全 文 ：应 用 生 态 学 报 年 月 第 卷 第 期
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高温胁迫对根瘤菌 在土壤中的存
活及其表型表达的影响 ‘
蔺继 尚 崔明学 靳素英 李 宁 李明棋 赵 巍 张晓东
中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态系统痕量物质生态过程开放实验室 , 沈阳
摘要 研究了 株弗氏中华根瘤菌 , 卜 突变株于适宜温度和高温
胁迫两种条件下在土壤中的存活和 表型的表达 在适宜温度 ℃ 条件下的灭菌
和未灭菌土壤中的存活研究表明生物因素抑制了突 变株和野生型的生长 但野生型和突
变株的存活种群密度之间无显著差异 。 在高温胁迫 条件下 , 土壤中野生
型和突变株的种群密度迅速下降 , 其中部分 一 和 一 细胞丢失了 表型 , 说明
部分细菌的 表型在高温胁迫条件下不能表达
关链词 转座子 监测标记 高温胁迫
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1 引 言
经遗传工程修饰的微生物(G M M s)在
给人类带来巨大效益的同时 , 也存在着对
自然生态 系统潜在的威胁 , 因而在向环境
释放 G M M s 之前有必要评价其引入环境
所带来的风险〔’〕. 成功的风险评价依赖于
可靠的监测方法. 目前监测环境中 G M M s
的方法有随机抗性和标记基因等 , 应用随
机抗性的历 史较长 , 但随机抗性突变容
易 回复且在环境中特异性差 . 因此 , 近年
来人们更倾向于采用标记基 因监测方法.
其 中 P epper 等〔, 〕采 用转座子 T ns 标记 ,
其优点在于 T ns 片段遗传稳定且在环境
中具有特异性 , 既可以利用 T ns 编码的
卡那霉素抗性表型检测 , 又可以通过 T ns
探针结合 PC R 扩增 技术利用 D N A 杂交
, 国家自然科学基金和中国科学院陆地生态系统痕
量物质生态过程开放实验室基金资助项 目.1995 年 l 月 23 日收到 , 5 月 28 日改 回.
应 用 生 态 学 报 6卷
方法直接检测从环境中分离的全 D N A 样
品[‘·, ·‘] .
各种环境 因子均影响 G M M s 在环境
中的存活和重组基因 (包括标记基因在内)
的表达 , 尤其是胁迫条件对细菌存活极为
不利. 因而对 T n s能否作为环境中微生物
的监测标记的研究必须考虑到环境胁迫条
件对 G M M s 生长和繁殖的制约 〔, 〕. 前文报
道 插入 R h izob iu m fr ed ii 的 T ns 的水平
转移 能 力很 低 , T n s 对 R hizob iu m j卜ed ii
的 T ns 突变株的运 动扩散影响很小图.本
文 旨在探讨高温 胁迫 条 件对 R hi zo biu,) :
介丫d il’ 的 T n s 突变株的生存及 T n s 表型
表达的影响.
2 材料与方法
2.1 细菌菌株和培养条件
R hizobium j卜ed ii Q B l l3o 系中国科学院沈
阳应用生态研究所保藏菌株 , 携带链霉素抗性
(S m ’ ) . 石.co li S M 10 系美国康纳尔大学分子生
物学实验室馈赠菌株 , 携带 pSU P lol 质粒 , 具
有卡那霉素抗性(K m , ) .
R h i
二。占矛u ,’ 为1于d i i O N 一 2 , O N 一 3 , O N 一4 是 以
Q B ll 3o 为受体 , 与 E .‘o z i S M l o / p S U P z o l l 接合
得到的 T ns 插入 突变株 , 具有 K m ‘、 S m 「 .
其 中 Q B ll3 。和 3 株突变株培养于 T Y 或
Y M A 培养基 (2 S C ). 大肠杆菌培养于 L B 培养
基 (3 7 C ). 配制固体培养基时需加 入 1. 5 % 琼
脂 , 在选择性培养基中的链霉素 (Sm ) 和卡那霉
素(K m ) 最终浓度分别为 50 和 50 拜g · m l .
2
.
2 接合诱变
按前文方法进行[2] .
2.3 植物结瘤试验及乙炔还原分析
按前文方法进行:21 .
2.4 土壤准备
供试土壤为沈 阳生 态站的草甸棕壤土 , p H
为6.1一 7 .0 , 有机碳含量 1.0 % , 全 N 为0.08 % .
经检测土样中不存在 K m · 菌. 取 土深度为 。一
2 0c m , 经风干 , 过筛(< Zm m )后在 4 C 田间潮湿
条件下储存.
2.5 高温液体培养基培养时突变株的生长和
T ns表型表达的测定方法
4 株根瘤菌分别接种于不加 K m 的 T Y 液体
培养基 , 然后在 28 ℃和 40 ℃两种温度下静止连
续培养 7d , 每隔 12h 振荡 10 m in 以提供氧气. 在
不同时间取样测定在 K m + Sm 平板和单纯 Sm
平板上的生长情况. 为了确证 40 C 培养时是否
存在热休克 , 分别在第 2d 、第 5d 和第 7d 把单纯
Sm 平板上长出的菌落转接到 K m + Sm 平板上 ,
然后计数并与初始 K m + Sm 平板及单纯 Sm 平
板上的单菌落数比较.
2.‘ 突变株在适温土壤中的存活和其T ns 表型
的表达测定方法
分别研究细 菌在灭菌和未灭菌土壤中的存
活和 T n s 表型 的表达. 灭菌土样可以通过连续
Zd 在 121 C 下分别灭菌 lh 得到. 土样 (1009)分
装在 50 Om l 三角瓶中. 根瘤菌在 29 ’C 下 T Y 液体
培养基中培养到指数生长中期 , 用无菌去离子水
冲洗 , 再重新悬浮于无菌去离子水使菌浓达 105
个 · m l , 以 0 . lm l · g 一 , 土的比例接种于土样中.
封住三角瓶瓶 口 . 于 28 C 下培养 18d . 在培养期
间定期加水以维持土壤湿度. 间隔取样并计数存
活细菌.
2.7 高温培养时细菌在土壤中的存活和 T ns 表
型表达
在夏季土壤表层温度有时高达 40 C , 且以前
的研究发现根瘤菌在 40 C 的土壤中存活能力下
降.因此本研究选择 40 C 作为高温胁迫条件.
将培养到指数生长中期的细菌培养物接种
于土 样 , 在 4o C 的培养箱中培养 18d .在培养期
间 , 土 壤湿度通 过每天 加 无菌水维 持在 飞2 %
(w /v)以 防止土壤过干或过湿 , 间隔取样并对存
活细菌计数.同时用加卡那霉素的选择性培养基
检测未丢失 T ns 编码的卡那霉素抗性的细胞.
2.8 从土壤提取目的细菌与检测计数方法
本研究采用修改的蔗糖密度梯度离心法仁川
从土样中提取细菌细胞 , 该方法克服了以往振荡
提取法回收效率低的缺点. 将含野生型的提取液
涂布于只加 Sm (500拌g · m l 一 , ) 和放线菌酮 (300拜g
·
m l
一 ,
)( 用 于抑制真菌的生长) 的 Y M A 平板.
含突变株的提取液涂布于 加 K m (5即g · m l 一 , ) 、
S m ( 5 0 0 拌g · m l 一 , ) 和放线菌酮 (300拜g , m l 一 , ) 的
期 蔺继尚等:高温胁迫对根瘤菌 T ns 在土壤中的存活及其表型表达的影响
~
遥白.1.2.月
叭净、
二之一
一二之三污牛
内‘扭臼..,
Y M A 平板 , 同时涂布 加 Sm (500拌g · m l 一 , ) 的
Y M A 平板 , 比较从这两种培养平板上得到的细
胞数量 , 以估计突变株和野生型的种群变化趋势
和可存活但不能表达 T n s表型的突变菌细胞数.
2., 统计分析
利用完全随机化设计方法设计实验 , 每一实
验方案均设 3 个重复 , 方差分析后 , 利用 T 一检验
在 0.01 % 水平上计算野生 型和突变株之间的显
著性差异.
b.一3结 果3.1 转座子诱变以 E . :011 S M zo (pS U P lo ll )为供体与 R . 介‘di i Q B I 1 30 作接合诱变. 在 K m
+ S m 的基本培养基上筛选接合子. 随机
挑选若干株产多糖及菌落形态与野生株一
致的接合子作细菌学鉴定 、 共生结瘤和 固
氮能力测定 , 发现这些 T ns 突变株的代
时 、菌体形态 、大小 , 产酸等特 征都与原野
生株 Q B ll3O 无明显差异 , 在连续传 40 代
后 , 卡那霉素抗性仍存在. 挑选 3 株具有
较强结瘤固氮能力的突变株 O N 一 2 、 O N 一 3 、
O N
一
4
, 作为下一步研究用菌株.
3.2 高温对液体培养基中培养 的突变株
的生长和遗传稳定性的影响
温度是 细菌生 长的主要 限制 因子之
一 在适温下液体培养基中培养的所有菌
株生长迅速 , 种群密度在第 3d 时增加 了
约 4 个对数单位 (图 1) . 而在高温胁迫条
件下所有菌株的最终菌浓度均 比初始浓度
至少降低了 2 个对数单位 (图 l) , 从第 3d
选择性培养基和非选择性培养基上的菌落
计数差别上可 以看 出部分 O N 一 2 和 O N 一 3
突变株的 K m !表型丢 失 (图 IA 、 I B ) . 表
明高温对 上述 菌株生存均极为不利 , 并影
响 O N 一 2 和 O N 一 3 2 个突变株 T ns 表型的
表达.但对 O N 一 4 菌的 T ns 编码 K m 『 表型
影响很小 (图 IC ).分别在第 2 、 第 5 和第
7d 检测 T n s 表型表达丢失是否由热休克
, 一 _多 。、, 场‘注 勺
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时 间11m e (d)
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图 l 适宜温度及高温胁迫对培养于液体培养基的 T ns
突变株和野 生型的存活及 T ns 的表型表达的影响(3 次
试验结果的平均值)F ig.1 P heno typie expression of T n s and survival ofT n snlutants and w ild type under optim um or h igh tem pera-tu re stress in liq uid eulture. (T he value 15 rhe niean ofth ree exPerim en t results).
x . 28亡的培养结果 , T h e re s u l t s o f 2 8 ℃ ; 1 . 4 0 ℃的
培养结果 , T h e r e s u l t s o f 4 0 ℃ . A . ()N 一 2 , B . ( ) N 一 3 , C .
( ) N 4
.
引起 . 从 Sm 平板上分离 的 T ns 突变株 ,
再培养于加 K m 的培养基中 , 与初始 K m
+ Sm 平板及 Sm 平板上的菌落数比较 , 转
接 K m 培养基后得到的单菌落与初始 K m
培养基上得到的单菌落数很相 近 , 表明细
菌细胞在 28 C (最适生长温度) 培养时仍
未恢复其在高温下失去的 K m ‘ ( 表 1) . 因
此热休克不是 T ns 表型丢失的原因.
3.3 适温条件下突变株在土壤中的存活
3.3 .1 在灭菌土壤中的存活 土壤经灭菌
后生物 因素影响降低到最低值.T n s 突变
株 O N 一 2 、 O N 一 3 、 O N 一 4 和野 生 型 Q B ll30
在灭菌土壤中培养 了 18 d . 从图 2 可 以看
出 , 4 株菌的存活曲线均呈上升趋势.除突
应 用 生 态 学 报 6 卷
衰 l 高温对突变株 Tn s 表型表达的影响
T able 1 Influen ce o f hig h tem 讲rature on Phen otypie ex-
Pres ion of T ns
时 间 菌 株 初始 K m , 初始 s m , 转接后 K m ,
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第 Zd ()N 一 2 1 9 9 2 5 1 1 9 2
Z n d d a y ( ) N
一
3 6 3 3 1 6 6 4
9 8 9 ( ) N
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第 sd ()N 一 2 1 6 4 0 1 5
s t h d a y ( ) N
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3 1 6 1 0 0 1 4
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第 7d ()N 一 2 1 0 3 2 1 1
7 t h d a y ( ) N
一 3 1 6 5 0 1 5
( ) N
一 4 3 2 7 8 3 0
a 为取样后 初次涂布 于加卡那霉家的选择性平板 (10a
数量级)上 的单菌落数 , b 为取样后 初次涂布于加链每
素平板 (10 3 数量级)上的单菌落数 , 。 为从加链称素平
板(103数量级) 上的 单菌落转接到 加卡 那霉素的选择
性平板后长出的单菌落数 .12r ^
株 O N 一 2 、 O N 一 3 、 O N 一 4 和野生型 Q B l l30
在未灭菌土壤 中培养了 18 d , 从图 3 可以
看出存活曲线几乎稳定在一个水平上. 除
突变株 O N 一 3 在第 6d 以后明显 比野生型
的种群密度较低外 (图 3B ) , 其它两株突变
菌和 野 生型 在 数 量 上 无 显著差 异 (P -
0.01 )(图 3A 、 3 C ) . 用 T n s编码的 K m , 检
测和 只用 K m ‘ 检测所得的突变株存活菌
数量之间无显著差 异(图 2) , 说明在适宜
温度的未灭菌土壤 中 T ns 在宿 主中可正
常表达 K m ’·
, ‘二5e10a相.
八勺.、。。,I)玛截贫暇粗如
卜卜.
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时 间刀. e 伍)
图 2 适宜温度条件 F 在 火菌 土壤 T ns 突变株和野生
型的存活及 T n s 的表型表达 (3 次试验结果的平均值 )
F ig.2 P hen oty pie expression of T n s and survivalof T ns
m utanrs and w ild tyPe under oPtinium ten1Perature insterile 5011. (T he value 15 the nlean o f three exPerinientresults).A . ()N 一 2 , B . ( ) N 一 3 , C . ( ) N 一4 .
变株 O N 一 3 在第 gd 以后 的种群密度明显
比野生型的低 外 , 其它两株 突变菌 (O N -
2 、O N 一 4 ) 和野生型在数量上无显著差异(P
~ 0.01) . 用 T ns 编码的 K m r检测和只用
Sm ’ 检测所得的突变株存活菌数量之间无
显著差异 (图 2) .
3.3. 2 在未灭菌土壤中的存活 T n s 突变
图 3 适宜温度条件下在未灭菌土壤中 T n s 突变株和
野生型的存活及 T n s 的表型表达 (3 次试验结果的平均
值).
Fig.3 Ph enorypie expression of T ns and survivalof T ns
niutants and w ild type u nd er oprim um tem perature in
sterile 5011. (T he value 15 the niean of three experim en tresu lts).A . ()N 一 2 , B . ( ) N 一 3 , C . ( ) N 一 4 .
3
.
4 高温胁迫对突变株存活和 T ns 表型
表达的影响
图 4 显示了高温培养时 4 株菌在土壤
中的存活和插入突变株的 T ns 表型的表
达.在 18d 的培养过程中所有菌株的种群
密度下降了大约 3 个对数单位 , 特别是在
前 9d 下降明显 , 约 2 个对数单位.此后 , 4
株菌的种群数量均 趋于稳定 .比较 用 T n s
编码的 K m 『 检测和 只用 Sm r检测所得的
突变株存活菌数量 , 发现突变株 O N 一 2 从
5.校10512.
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期 蔺继尚等:高温胁迫对根瘤菌 T ns 在土壤中的存括及其表型表达的影响
诀、一~ ~ -__. _全、各~ 一石二二飞二艺习匆
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(岌、。。口O烈橄贫创扭如
、一.寸-弓-一青一能时间 们巨. (d ) e1心勺勺图 4 高温胁迫条件下 T ns 突变株和野 生型在 土壤中
的存活及 T n s 的表型表达(3 次试验结果的平均值 ).F ig.4 P henotypie expression of T ns and survival of T ns
m utants and w ild type in 5011 under h ig h tenlperaturestress. (T he value 15 the nlean of th ree exPerim ent re-
sults).A .()N 一 2 . B . ( ) N 一 3 C . ( ) N 一 4 .
第 9d 开 始有显 著差异 (图 4A ) , 突 变株
O N 一 3 从第 12 d 开始差异增大 , 在第 18 d
时相差约 1 个对数单位 (图 4B ) , 而突变
株 O N 一 4 除第 g d 外无显著差异 (图 4C ).
说明 O N 一 2 、 O N 一 3 菌株的 T ns 表型表达受
高温胁迫的影响较大 , 在培养过程中部分
细菌细胞失去了 K m r, 而 O N 一 4 兹株所受
影响较 小. 当 用固有标记 (sm r)检测时 ,
O N
一
2 和 O N 一 4 两株突变株和野生型之 间
在 存活菌 数量之 间无 显著差异 , 突变株
O N 一 3 则不同 , 其生存种群数量在第 9d 时
显著下降 , 但在第 12d 时又 回升到和野生
型相近的水平(图 4B ).
4 讨 论
4.1 适宜温度条件下突变株在土壤 中的
存活和 T n s 表型表达
评价转座子 T ns 作 为生态学标记的
可行性 , 需考虑到各种环境因子对转座子
突变株的存活及其遗传稳定性的影响.影
响微生物在土壤中存活的环境因子可分为
生物因素和非生物 因素.非生物 因素包括
温 度 、 p H 、 营 养 、 土 壤 结 构 和 潮 湿 度
等民 , ·, 〕. 生物 因素包括噬菌体的侵染 、 土
壤酶以及与其它已经建立了牢固生态位的
土著微生物之间的竞争. 目前的研究发现
生物 因素的影响更大 一些.在本实验中 ,
T
n
s 突变株培养于灭菌土壤时 , 在 18 d 后
种群数量增加了约 2一 3 个对数单位 , 而在
未灭菌土壤中种群数量反而下降 , 表明生
物 因素明显地抑制 了释放 菌的生长 和繁
殖.D evanas 等「3〕也曾报道携带重组质粒
的大肠杆菌菌株培养于灭菌土时增加了约
3 个 对数单位 , 而在未灭菌土 壤中则呈下.降趋势.在培养期间 , 从灭菌和非灭菌的土
样中取样后 , 用 T n s 编码的 K m , 检测和只
用 Sm r检 测所得的突变株存活菌 数量之
间无显著差异 , 表明在 28 C 时 T n s 表型的
表达是稳定的.同时检测所得到 的突变株
和野生型在种群数量上无显著差异 , 表明
存在于细胞内的 T ns 片段对 宿主没有不
利的影响.因此在非胁迫条件下 , T n s 可以
作为基因工程微生物释放的生态学标记.
4.2 高温胁迫条件对 突变株存活和 T n s
表型表达的影响
本实验采用 40 C 作为温度限制 因子 ,
探讨高温胁迫条件对根 瘤菌存活和 T n s
表型表达的影响程度.结果表明高温胁迫
抑制了细菌的生长和繁殖.实验结果表明
部分突变株细胞丢失了 T n s 编码 的 K m r
标记.基因功能的丢失一般有以下几个原
因 :1) 基 因片段完全或部分从基因组中切
除.但研究表明在纯培养过程中 T ns 从根
瘤菌基因组精确切除的发生频率只有 10一 。
一 10 一 , , 系小概率事件.因此不是本实验中
应 用 生 态 学 报 6 卷
部分细菌细胞丢失 T ns 表型的原 因.2) 热
休克 , 用加 Sm 的培养基 分离培养于高温
胁迫条件下的液体培养基中的 T ns 突变
株细胞 , 然后在 27 C 下于无选择压力的培
养基中培养 48 h 后重新在加 K m 的选择性
培养基上培养仍不生长 , 说明热休克也不
是 T ns 表型丢失的原因 .3) 基因突变 , 在
不利的环 境条 件下 基因 突变率会大大提
高.T ns 编码 K m ‘ 和 新霉素抗性的 nPt l
区域产生的突变是突变株丢失 T n s 表 型
的一个可能的原因.
高温胁迫对 细菌的生存 和 T ns 片段
的功能表达均不利 , 但对不同突变株的影
响程度存在差异 , 突变株 O N 一 3 菌 株的存
活和所携带的 T ns 的表型表达受到 的不
利影响最大 , 而 O N 一 4 所受影响相对较小.
T ns 的插入是随机的 , 可以插入细菌染色
体的多个位点 , 显然在某些位点的插入是
相对稳定的 , 而在另外一些位点的插入则
是不 稳定 的.因此有 必要 分 别评 价每个
T ns 插入 以确 定其是 否可作 为生态学 标
记.另外 , 保存了 T n s 编码的 K m ‘ 的突变
株和存活下来的突变株在种群数量之间所
存在的统计学上的显 著性差 异 , 是 否有生
态学上的显著意义 , 是一个值得注意的现
象 , 还有待于进一步探讨.
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6 F red r ie k s o n . J . K . e t a l.’ 1 9 8 8 . E n u m e r a t i o n o f
T n s m u r a n t b a e t e r i a i n 5 0 1 1 b y u s in g m o s t p r o b a b l e
n u n l b e r D N A h y b r i d i za
t i o n p r o e e d u r e a n d a n t i b i o t ie
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. 助户l. E 。而ro , 卜 M i’r ob iol . , 5 4 : 4 4 6 一4 5 3 .
7 H o lbe n .W . E . , J a n s s o n , J . K . C h e l m , B . K . T i e d j e .
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. 月户户l. E , 。i。 , : . 拟矛‘r砧101 二 54 :703 一7 0 8 .
8 1, i n , J . , e t a l . 1 9 8 7 . C h a r a e t e r i z a t i o n o f R . 介产以11
Q B l l 3 0 . a s tra in e ffe e tive o n eo m me re ia l so y be a ne u ltiva rs . 尸la ” t a ”d 5 0 11 , 9 9 : 4 4 1 一 446.
9 P nlai, S . D . a
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b r o a d h o s t r a n g e n 、o b iliz a t io n s y s t e m f o r in v iv o g e -
n e t ie e n g in e e r in g , r a n d o m a n d s i t e s p e e i f i e m u t a g e -
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乙 , 沼刃之尸刀曰 。 1 岭 了亡r 众口矛口止。 一 J y : 马0 0 一任0 廿-