全 文 ：◇药学研究◇
豹皮樟总黄酮对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响
周利华 1, 2 ,李　俊1 ,陈晓宇 1, 3 ,胡成穆 1 ,解雪峰 1 ,姜　辉 1
2007 - 02 - 09接收
基金项目:国家重大基础研究专项基金(编号:2002CCC 02900)
安徽省教育厅自然科学基金资助项目(编号:2003k j216)
作者单位:安徽医科大学 1 药学院 、2 护理学院 、 3 组胚教研室 , 合肥
　 230032
作者简介:周利华 ,女 , 30岁 ,讲师 ,硕士研究生;
李　俊 ,男 , 46岁 ,教授 ,博士生导师 , 责任作者 , E-mai l:li-
jun@ ahm u. edu. cn
摘要　目的　研究豹皮樟有效部位总黄酮(LCTF)对佐剂性
关节炎(AA)大鼠炎症免疫功能的影响 , 探讨其治疗作用的
机制。方法　SD大鼠左后足跖皮内注射 0. 1 m l, 弗氏完全
佐剂复制 AA模型;大鼠免疫后 12 d开始分别灌胃 LCTF
66.5、133、266 mg /kg, 连续给药 12 d。组织块培养法分离培
养大鼠滑膜细胞 , 透射电镜分析滑膜细胞内具分泌功能细胞
器的形态学改变;放射免疫测定法检测腹腔巨噬细胞 、滑膜
细胞分泌 IL-1β 水平;探讨 LCTF 作用机制。 结果 　
LCTF133、 266 mg /kg可恢复 A、B型滑膜细胞的分泌功能;纠
正 AA大鼠腹腔巨噬细胞 、滑膜细胞过高分泌 IL-1β的功能。
结论　LCTF可恢复 AA大鼠滑膜细胞的形态及改善腹腔巨
噬细胞 、滑膜细胞过高的分泌炎性介质的功能是其治疗 AA
的途径之一。
主题词　樟科;黄酮类 /药理学;关节炎 , 实验性 /中药疗法
中图分类号　R 282. 71;R 684.3;R 392. 12
文献标识码 A 文章编号 1000 -1492(2007)03 - 0292 -04
　　豹皮樟 ,又名老鹰茶 ,系樟科木姜子属毛豺皮樟
的叶 ,俗称白茶 ,分布于四川 、贵州 、云南 、安徽等地 ,
它是一种无毒副作用 、无污染 、风味较佳的天然野生
饮品 ,原料丰富 ,加工简单 ,饮用方便 ,具有解毒消
肿 、明目益思 、生津止渴 、解表防暑等功效 ,是我国南
方各民族民间长期饮用的一种植物代用茶 [ 1 -2] 。豹
皮樟的嫩叶中含有丰富的氨基酸及多种矿物质元
素 ,总黄酮含量可高达 3.45%,已知黄酮有山柰酚
山柰酚 (kaempfe ro l), 山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷
(kaempferol-3-O-β-D-glucopy ranoside),槲皮素-3-O-
β-D-葡 萄 糖 苷 ( querce tin-3-O-β-D-g lucopy rano-
side)[ 1, 2] 。豹皮樟总黄酮 (LCTF)由本校药学院提
取 ,为墨绿色粉末 ,具有特殊香味 ,经我院天然药物
化学教研室鉴定 ,总黄酮含量 >70%。前期研究表
明 LCTF具有抗炎 、镇痛等功效 [ 3] 。为进一步揭示
LCTF对大鼠 AA的作用机制 ,现采用电镜技术和免
疫学方法观察 LCTF对佐剂性关节炎 (AA)大鼠滑
膜细胞的超微结构及其分泌炎性细胞因子的影响 。
1　材料与方法
1. 1　动物　SD大鼠 ,体重 180 ～ 200 g, ♂,普通级 ,
安徽医科大学实验动物中心提供 。
1. 2　药物及试剂　LCTF,由乙醚萃取而得 ,为墨绿
色粉末 ,具有特殊香味 ,主要成份为黄酮类;新生小
牛血清 ,杭州四季青生物工程材料有限公司提供 ,批
号:031020;RPM I 1640粉 , S igma公司提供;雷公藤
多苷片(TPT),上海复旦复华药业有限公司生产 ,批
号 060503;卡介苗 (BCG),卫生部上海生物制品研
究所产品 ,批号 20060101。 RPM I 1640培养液:G ib-
co公司产品;125 I - IL - 1β放免试剂盒购于北京北
方生物研究所 ,其它试剂为分析纯 。
1. 3　仪器　电子天平 JT12001,上海精天电子仪器
厂;足趾容积测量仪 YLS-TA ,山东省医学科学院设
备站;水套式 CO2培养箱 ,美国 SHELLAB产品;全
自动高速冷冻离心机:GL20A ,湖南仪器仪表总厂离
心机厂;医学净化工作台:YJ-1450型 ,苏州净化设
备公司;倒置式显微镜:O lympus产品;透射电镜:J-
1230型 ,日本电子公司;放免测定仪:GC-911型 α
放射免疫计数仪 ,中国科学技术大学中佳公司。
1. 4　方法
1. 4. 1　动物分组及给药　SD大鼠随机均分为 6
组:正常组 、模型组 、LCTF(66.5、133、266 mg /kg)和
阳性药 TPT(30 mg /kg)对照组 ,每组 10只。按文献
报道造模 [ 3] ,除正常组外 ,其余各组均以弗氏完全
佐剂 (卡介苗 80℃、1 h水浴灭活后与高压灭菌的液
体石蜡充分碾磨混匀配成 10mg /m l的乳剂 )于每鼠
左后足趾皮内注射 0.1 m l致炎。各用药组于致炎
第 12 ～ 24天分别连续灌胃 ( ig 10 m l /kg)给药 ,正常
组及模型组给予等容量的 0.5%羧甲基纤维素钠。
1. 4. 2　AA大鼠评价　参照文献 [ 4] YLS-TA足趾容
积仪 (山东省医学科学院 )排水法测定右踝关节以
下的容积 (m l),分别于用药前 、用药后第 4、8、12、16
292 安徽医科大学学报　Acta UniversitatisM edicinalis Anhui　2007 Jun;42(3)
天同法测量非致炎足的容积变化 ,以致炎前后差值
表示其肿胀度(△m l), TPT(30mg /kg)对照组 (相当
于临床剂量的 6倍 )。多发性关节炎评分如下 , 0
分:无肿胀;1分:1个趾关节受累;2分:多趾关节受
累;3分:踝关节以下受累;4分:全爪受累 。
1. 4. 3　滑膜细胞培养 [ 5] 　免疫后第 28天大鼠清醒
状态下腋窝放血处死 。无菌取双侧膝关节滑膜组
织 ,滑膜细胞培养按文献说明进行 [ 5] , RPM I 1640重
悬细胞 1×109 cells /L,取 500μl细胞悬液和 500 μl
10 mg /LLPS置六孔板中 , 37℃ 5% CO2培养箱孵育
48 h ,收集上清液 - 20℃备测 IL-1β 。
1. 4. 4　透射电镜检查　收集滑膜细胞以 4%戊二
醛 M illoning缓冲液预固定 , PBS洗涤 , 1%锇酸固定
2 h,梯度乙醇逐级脱水。环氧树脂包埋 ,超薄切片 ,
醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色 ,日本电子公司 J-1230
型透射电镜观察摄像 。
1. 4. 5　 IL-1β放免的测定　AA大鼠腹腔巨噬细胞
产生的 IL-1β的检测 ,处死大鼠于腹腔内注入 D-
Hank液 5m l,轻揉腹部 ,抽出灌洗液 ,重复 1次 ,合
并灌洗液 ,离心洗涤细胞即得富含巨噬细胞的腹腔
细胞。 RPM I 1640重悬细胞 ,调整细胞浓度为 2 ×
10
8
/L,按分组将细胞悬液加入 24孔板中 (1m l /
孔 ), 5% CO2饱和湿度培养箱中培养 4 h,弃上清 ,
用 37℃预温的 5%小牛血清的 Hank液洗涤 2次 ,弃
除不贴壁细胞 ,余下为单层腹腔巨噬细胞 。 RPM I
1640重悬滑膜细胞 ,调整细胞浓度为 2 ×108 /L,方
法同腹腔巨噬细胞 。每孔加入含 LPS(终浓度为 6
mg /L)的 RPM I 1640液 1 m l, 5% CO2 , 37℃饱和湿
度培养箱中培养 48 h,收集上清 , 125 I放免试剂盒按
说明书方法进行 IL-1β含量测定 。
1. 5　统计学处理　结果以 –x±s表示 , SPSS 11.0软
件进行方差分析 , t检验。
2　结果
2. 1　滑膜细胞培养　滑膜成纤维细胞经涂片和 G i-
em sa染色 ,镜检 300个细胞 ,纯度 95%以上 。
2. 2　LCTF对 AA大鼠继发性炎症的影响　与 AA
大鼠模型组相比 , LCTF自用药第 8天后开始发挥疗
效 , LCTF(66.5、133、266 mg /kg)可明显抑制 AA大
鼠的继发性足肿胀 ,以 266 mg /kg组作用最显著 。
2. 3　LCTF对 AA大鼠多发性关节炎影响　LCTF
对 AA大鼠多发性关节炎的影响见关节评分 (表
2)。
2. 4　LCTF对滑膜细胞超微结构的影响　滑膜组
织中有两型细胞 , A型滑膜细胞起源于巨噬细胞 , B
型滑膜细胞起源于成纤维细胞 。正常滑膜组织以 B
型细胞为主 ,其特征是粗面内质网 、游离核糖体较
多;与正常组大鼠相比 , AA大鼠则多见 A型滑膜细
胞 ,细胞内囊泡增多 , A型细胞含明显的高尔基体和
囊泡分散于细胞质内 ,粗面内质网少 ,线粒体肿胀 、
嵴突破坏;B型滑膜细胞数量减少。各用药组大鼠
以 B型滑膜细胞为主 , B型滑膜细胞粗面内质网略
有扩张 , 但数量减少 , 少数线粒体肿胀 , 以 LCTF
(133、266mg /kg)和 TPT改善作用更为明显(图 1)。
表 1　LCTF对 AA大鼠继发性炎症的影响(–x±s, n=10)
组别 剂量(mg /kg) 足肿胀(m l)
12d 16d 20d 24d 28d
模型 - 0. 33±0. 08 0. 37±0. 09 0. 46±0. 06 0. 41±0. 07 0. 38±0. 08**
LCTF 66. 5 0. 33±0. 04 0. 36±0. 06 0. 36±0. 07* 0. 33±0. 08** 0. 31±0. 05**
133 0. 30±0. 07 0. 34±0. 07 0. 35±0. 05 0. 31±0. 05** 0. 29±0. 04**
266 0. 31±0. 09 0. 33±0. 05 0. 29±0. 04 0. 25±0. 03** 0. 22±0. 09**
TPT 30 0. 28±0. 04 0. 28±0. 07* 0. 26±0. 08** 0. 25±0. 05** 0. 21±0. 05**
　　与模型组比较:*P<0.05, **P<0.01
表 2　LCTF对 AA大鼠多发性关节炎的影响(–x±s, n=10)
组别 剂量 m g /kg 多发性关节炎评分
16d 20d 24d 28d
正常 - 0. 60+0. 52 1. 20±0. 57 1. 70±1. 25 1. 40±0. 67
模型 - 7. 50±0. 85△△ 8. 35±1. 34△△ 9. 15±1. 62△△ 8. 92±1. 20△△
LCTF 66. 5 6. 35±0. 67** 6. 83±0. 92** 7. 21±0. 92** 7. 10±0. 67**
133 6. 22±0. 63** 6. 88±1. 10* 7. 64±1. 65* 6. 12±1. 05**
266 5. 53±0. 85** 6. 65±1. 08** 7. 33±0. 82** 6. 13±1. 37**
TPT 30 5. 12±1. 15** 6. 46±0. 84** 7. 21±1. 14** 6. 25±0. 95**
　　与正常组比较:△△P<0. 01;与模型组比较:*P <0. 05, **P <0. 01
293 安徽医科大学学报　Acta UniversitatisM edicinalis Anhui　2007 Jun;42(3)
图 1a　AA模型大鼠的 A型滑膜细胞　透射电镜 ×10 000
图 1b　 266m g /kgLCTF处理 AA模型的 B型滑膜细胞　透射电镜
×12 000
2. 5　IL-1β含量测定　采用放射免疫测定法 ,收集
滑膜细胞 、腹腔巨噬细胞培养上清液 , AA大鼠释放
IL-1β明显高于正常组 , LCTF和 TPT能明显降低
IL-1β含量(表 3)。
表 3　LCTF对滑膜细胞 、腹腔巨噬细胞分泌的
IL-1β(μg /L)功能的影响(–x±s, n=10)
组别 剂量(m g /kg)
滑膜细胞 IL-1β
(μg /L)
腹腔巨噬细胞
IL-1β(μg /L)
正常 - 0. 292±0. 054 0. 101±0. 029
模型 - 0. 483±0. 044** 0. 347±0. 047**
LCTF 66. 5 0. 414±0. 087 0. 286±0. 083
133 0. 382±0. 065* 0. 235±0. 095**
266 0. 345±0. 058* 0. 206±0. 057**
TPT 30 0. 383±0. 069* 0. 223±0. 055**
　　与模型组比较:*P<0.05, **P<0.01
3　讨论
　　我们前期实验采用了急性 、慢性及免疫性炎症
模型 ,观察豹皮樟总黄酮的抗炎作用 ,结果表明
LCTF能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀 、角叉菜胶
所致大鼠足肿胀 、棉球诱导肉芽肿 [ 3] 。 RA是慢性
免疫介导的炎症性疾病 ,一般认为 , RA起因主要
为 ,细胞对未知抗原的反应 , T细胞被激活后 ,释放
淋巴因子 ,继而激活单核 /巨噬细胞释放多种单核因
子 ,如 IL-1。近来研究表明 , IL-1与炎症骨质破坏密
切相关 , IL-1在 RA发病中的作用首先表现在对免
疫和炎症细胞的局部效应 ,即在 RA病变早期可协
助其它细胞的迁徙和刺激内皮细胞的各种反应 , IL-
1对炎细胞有趋化和黏附作用 ,可促进活化细胞进
入炎性部位 ,促进炎细胞附壁和滑膜细胞增殖 ,且能
增加血管通透性 、刺激内皮细胞释放血小板活性因
子及前列环素[ 6] 。 IL-1可促进滑膜纤维母细胞产生
胶原酶和 PGE2 ,使病情向中晚期发展 , IL-1是 RA
发病机制中居中心地位的促炎症细胞因子。本实验
中以 AA大鼠为模型 ,以 IL-1为研究对象 ,探讨了豹
皮樟总黄酮的部分作用机制 。结果表明 ,豹皮樟总
黄酮能够明显抑制 LPS诱导的 AA大鼠腹腔巨噬细
胞过度分泌的细胞因子 IL-1。综上所述 ,豹皮樟总
黄酮具有明显的抗炎作用 ,其机制与调节体内 IL-1
的生成有关。
滑膜组织和关节腔内的 A、B型滑膜细胞是 RA
关节损伤的最终的效应细胞 。从功能上分析 ,分布
于 A型细胞内的高尔基复合体参与分泌活动 ,线粒
体则为细胞代谢提供能量;B型滑膜细胞内的粗面
内质网具有分泌蛋白质等功能 [ 7] 。本超微结构的
研究通过对不同类型滑膜细胞分泌 、代谢功能的细
胞器的观察 ,结果发现以正常组为对照 , AA模型组
在免疫后 24 d时 ,滑膜细胞的代谢活性及 IL-1β,
TNF-α分泌功能均有所亢进;各治疗组 A、B型滑膜
细胞中高尔基体 、线粒体 、粗面内质网 、囊泡的数量
均有所减少 ,表明 LCTF可降低亢进的滑膜细胞功
能 ,保护滑膜细胞结构破坏 ,从而减轻滑膜细胞变
性。
在我们的研究中 , AA大鼠滑膜细胞释放较高
水平的 IL-1β, LCTF可抑制 IL-1β的产生 。 LCTF可
通过降低 AA大鼠滑膜细胞活化而减轻继发性炎
症。该抑制滑膜细胞分泌亢进的功能与透射电镜观
察到滑膜细胞具分泌功能细胞器的形态改变的结果
一致 。因此 ,在治疗 RA时 ,就要设法阻抑细胞因子
的产生和降低其活性 ,阻断由它介导的关节炎症过
程 ,诱导病情缓解[ 8] 。 LCTF能成为有效的抗类风
湿的药物 。
参考文献
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腔巨噬细胞 IL-1, IL-6和 TNF-α产生的动态影响 [ J] . 中国药
294 安徽医科大学学报　Acta UniversitatisM edicinalis Anhui　2007 Jun;42(3)
奇士乐对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节作用
姜　辉1 ,李　俊 1 ,胡成穆 1 ,陈纪军2
摘要　目的　研究中药复方奇士乐对佐剂性关节炎(AA)大
鼠的免疫调节作用。方法　以弗氏完全佐剂(FCA)制备 AA
大鼠模型 , 奇士乐灌胃( ig)给药治疗 AA大鼠 , 以雷公藤多
苷片 ig给药作阳性对照。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法 )
检测刀豆蛋白 A(ConA)、脂多糖(LPS)诱导的 AA大鼠脾淋
巴细胞增殖反应;放免法测定白细胞介素( IL)-1、 IL-2、 IL-6、
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素 E2(PGE2)的含量。结
果　奇士乐能明显抑制 AA大鼠继发性足肿胀;上调 ConA、
2007 - 03 - 26接收
基金项目:国家科技部十五重大科技专项 (863)资助项目 (编号:
2004AA2Z3322)
作者单位:1 安徽医科大学药学院 ,合肥　 230032
2 中国科学院昆明植物研究所 ,昆明　650204
作者简介:姜　辉 ,男 , 26岁 ,硕士研究生;
李　俊 ,男 , 47岁 ,教授 , 博士 ,博士生导师 , 责任作者 , E-
m ail:lijun@ ahmu. edu. cn
LPS诱导的 AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应 , 促进 IL-2分泌水
平;同时奇士乐还可抑制 AA大鼠腹腔巨噬细胞过高的 IL-
1、TNF-α、 IL-6和 PGE2的分泌。结论　奇士乐对 AA大鼠紊
乱的免疫功能具有调节作用 ,其机制可能与调节细胞因子水
平有关。
主题词　关节炎 , 实验性 /中药疗法;关节炎 , 实验性 /免疫
学;细胞因子类;人参 /治疗应用;黄芪 /治疗应用
自由词　佐剂性关节炎;奇士乐
中图分类号 　R 967;R-332;R 457. 2;R 684.3;R 282. 71;
R 392. 12
文献标识码 A 文章编号 1000 - 1492(2007)03 -0295 - 04
　　奇士乐为中药复方制剂 ,呈淡黄色粉末状 ,主要
含有人参 、黄芪等六味药物 ,其有效成分可通过抑制
人免疫缺陷病毒 (human immunode ficiency v irus,
HIV)、促进 T淋巴细胞转化 、增加特异性细胞免疫
　　 理学报 , 2002, 23(8):752 - 6.
[ 7] 　Levick J R, M cDonald JN. U ltras tru cture of transport pathways in
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nates and m etalloproteinase inhibitors [ J] . A rthritis Res Ther,
2003, 5(1):12 - 24.
Study on anti-inflammatory mi munological activity
effects of total flavonoids of litsea coreana Leve. Var
Zhou Lihua
1, 2 , Li Jun1 , Chen X iaoyu1, 3 , et a l
(1School of Pharmacy, 2School ofNurse, 3Dept ofH istology and Embryology, AnhuiMedicalUniversity,Hefei　230032)
Abstract　Objective　To study the anti - inflamm atory e ffec t and possible mechanism o f tota l flavonoids of litsea
co reana LeveV ar. (LCTF) on adjuvant arthritis(AA).Methods　0.1 m l o f the comple te Freund′s ad juvan tw as
subcu taneously in jected in to the the left hind feet pads o f the SD rats. 12 days after immuniza tion, to tal flavono ids
ex tracted from litsea coreana Leve. A t the dosage o f 66.5、133、266mg /kg and con trol drug Tripteryg ium g lycosides
30 mg /kg con tinuous intragastrice in jec ted adm in istration for 12 days. Synoviocy tesw e re derived from explant cul-
ture o f tissue fragment, transm ission e lectronm icroscope w as used to analy ze themorpho log ica l alteration of secre to-
ry function o rgane l.l Radioimmunoassay w as used to detect leve l of IL-1β in secre tory peritoneal macrophages and
synoviocy tes. Results　LCTF(133、266)mg /kg could recove ry sec re to ry function ofA , B type synoviocy tes. LCTF
co rrected the high leve l o f IL-1β in secre to ry peritoneal macrophages and synov iocy te s. LCTF has preventive and
therapeutic effects on AA rats and cou ld significantly suppresse activity of IL-1β. Conc lusion　LCTF has effects o f
anti-inflammato ry in AA ra ts. The anti-inflamm atory mechan ism of LCTF in AA ra ts m igh t be re lated to inhibitory
level of IL-1β from pe ritonea lmacrophages and synoviocy tes in vivo.
MeSH　 iauraceae;f lavones /pharmacology;arthritis, experimen tal /drug the rapy
295 安徽医科大学学报　Acta UniversitatisM edicinalis Anhui　2007 Jun;42(3)