全 文 ：研究报告
Research Report
阴香内生真菌 Y-74鉴定及其次级代谢产物的初步研究
梁彩云 1 王森胜 1 何熙璞 1,2* 刘鸿杰 3 张敏 4 李鹏飞 5
1广西大学化学化工学院,南宁, 530004; 2亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁, 530005; 3广西师范学院化学与生命科学系,
南宁, 530001; 4广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 5广西林产化学与工程重点实验室,南宁, 530006
*通讯作者, hexipu@gxu.edu.cn
摘 要 本研究主要是对阴香内生真菌菌株 Y-74 进行鉴定并对其次生代谢产物进行分离。运用 ITS
rDNA分子鉴定法鉴定菌株。通过对菌株 Y-74进行发酵，经反复硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析从发酵液活
性组分中分离得到一化合物，标为化合物(1)。采用 GC-MS确定了该化合物的纯度，通过理化方法、1H NMR、
13C NMR等手段鉴定其化学结构。分离纯化得到的化合物(1)为橘霉素 A，相关文献表明橘霉素 A具有一
定的抗肿瘤活性，为进一步研究代谢物及其活性奠定了基础。
关键词 内生真菌,次级代谢产物,橘霉素 A
The Separation and Identification of Secondary Metabolites of Fungi Y-74
from Cinnamourmus Endophytic
Liang Caiyun 1 Wang Sensheng 1 He Xipu 1,2* Liu Hongjie 3 Zhang Min 4 Li Pengfei 5
1 College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning, 530004; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utiliza-
tion of Subtropical Agro-bioresource, Nanning, 530004; 3 College of Chemistry and Life Science of Guangxi Teachers Education University, Nan-
ning, 530001; 4 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 5 Guangxi Key Laboratory of Chemistry and En-
gineering of Forest Products, Nanning, 530006
* Corresponding author, hexipu@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.000775
Abstract This research is to identify endophyti fungi Y-74 and separate and purify the secondary metabolites of
it. Endophyti fungi Y-74 was identified by the method of ITSrDNA. After liquid fermentation, one active
component of the culture was separated by means of silica gel and sephadex column chromatography and the
purity of the compound was determined using GC-MS. The target compound was characterized by 1H NMR and
13C NMR. The compound (1) is Penicitrinone A which has a significant autitumor activity according the reported
in literature. Thus the result lay the foundation for further research of metabolites and its active character.
Keywords Endophytic fungi, Secondary metabolism, Penicitrinone A
基金项目：本研究由广西林产化学与工程重点实验室开放课题(GXFC13-05)资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 4期，第 775-780页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.4, 775-780
植物内生真菌由于能够产生丰富多样的具有多
种生物活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要
的生态学作用，近年来，随着美国科学家 A. Stierle在
太平洋短叶杉上发现了抗肿瘤紫杉醇的产生菌(Stier-
le et al., 1993)，药用植物内生真菌及其活性物质的研
究成为了药物开发的重要课题(Zhang et al., 1998)。药
用植物内生菌作为一类次级代谢产物丰富的资源微
生物，在抗菌活性药物(Abdou et al., 2010)、抗肿瘤类
活性药物(Liu et al., 2012)、抗病毒类活性药物(Ding et
al., 2010)抗氧化类物质(Tejesvi et al., 2008)、除草类物
质(Amand et al., 2012)等方面具有广阔的应用前景。
我国药用植物资源十分丰富，对其内生真菌的
研究将有利于我国微生物药物的开发和珍稀植物资
源的保护(杨春平等, 2005)。阴香在《中华草药》《广西
中草药》第二册均有记录，具有温中止痛，祛风散寒，
解毒消肿的作用，中医用于胃寒痛，具有重要的药用
和经济价值。在抑菌活性方面，2004年，骆焱平等均
发现阴香植物组织提取物有很强的抑菌活性，2014
年，王森盛等从广西杉木内生真菌中分离筛选得到
具有抗菌活性的菌株。广西区内拥有丰富的药用植
物资源(丁建等, 2005)，其中无疑就蕴藏着丰富的微
生物资源，阴香作为重要的药用植物之一，有望从中
寻找到能够产生具有药学活性物质的内生真菌。本文
对从阴香茎部分离和筛选得到一株具有抗菌活性的
内生真菌 Y-74，经过 ITS (internal transcribed spacer)
鉴定和分析，初步确定该菌株为橘青霉。发酵后，利
用柱层析及薄层层析法对活性成分进行分离提纯，
GC-MS法确定纯度及经 1H NMR、13C NMR 等手段
对其次生代谢物的结构进行了鉴定分析。
1结果与分析
1.1菌株形态特征
菌落正面为青绿色呈绒毛状，反面为青黄色，极
易产孢。菌落边缘菌丝呈现银白色，表面干燥，不透
明，菌落形态见图 1。图 2为菌株 Y-74的扫描电镜
图，从图中可看出菌株 Y-74的菌丝细长且繁多，且
能立体直观的看出菌丝有隔，同时可以看出菌株
Y-74产孢量很大，能产生大量球状的分生孢子。
1.2 Y-74菌株 ITS-rDNA的序列分析
PCR扩增获得大约 500 bp的片段(图 3)，对扩增
产物进行连接、转化，经酶切验证后(图 4)测序，获得
长为 510 bp的核酸序列。对菌株 Y-74的 ITS-rDNA
图 1菌株 Y-74的菌落形态
Figure 1 Clone morphology of strain Y-74
图 2菌株 Y-74的扫描电镜照片(伊8.00k)
Figure 2 Scanning electron microscope photographs of strain
Y-74 (伊8.00k)
序列进行 Blast，并构建系统发育树。结果表明，Y-74
与橘青霉(Penicillium citrinum) JQ717340、JQ712839、
FJ765031、GU565103等的同源性高达 100% (图 5)，
初步判定菌株 Y-74应为橘青霉菌。
1.3化合物结构鉴定
化合物 1为黄色粉末，紫外灯下呈蓝色荧光。图 6
中，1HNMR (600MHz, CDCl3) 啄H：8.34 (1H, s, -OH)、6.38
(1H, s, H-7)、4.97 (1H, q, J=6.6 Hz, H-3)、4.62 (1H, qd, J
图 3菌株 Y-74 ITS rDNA PCR扩增
注: M: Marker; 1:样本
Figure 3 The ITS-rDNA PCR of strain Y-74
Note: M: Marker; 1: Sample
图 4菌株 Y-74酶切产物电泳照片
注: M: Marker; 1:样本
Figure 4 Electrophoresis picture of enzyme products
Note: M: Marker; 1: Sample
图 5菌株 Y-74的 ITS rDNA全序列的系统发育树(NJ)
Figure 5 Phylogenetic tree derived from the ITS rDNA sequence
of strain Y-74(NJ)
阴香内生真菌 Y-74鉴定及其次级代谢产物的初步研究
The Separation and Identification of Secondary Metabolites of Fungi Y-74 from Cinnamourmus Endophytic 776
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
=6.6, 4.2Hz,H-2)、3.16 (1H, qd, J=7.2, 4.2 Hz, H-3)、3.13
(1H, q, J =7.2 Hz, H-8)、2.21 (3H, s, 4-Me)、2.12 (3H, s,
5-Me)；图 7中，13CNMR(150MHz,CDCl3)啄C：155.7(C-1)、
82.5 (C-3)、21.1 (C-3-Me)、35.2 (C-4)、19.1 (C-4-Me)、
130.9 (C-4a)、132.0 (C-5)、10.8 (C-5-Me)、184.6 (C-6)、
103.4 (C-7)、158.2 (C-8)、100.1 (C-8a)、88.1 (C-2)、19.0
(C-2-Me)、44.8 (C-3)、19.2 (C-3-Me)、139.4 (C-3a)、
116.6 (C-4)、11.6 (C-4-Me)、147.5 (C-5)、102.4 (C-6)、
图 6化合物 1的 600 MHz 1H-NMR谱
Figure 6 1H-NMR (600 MHz) spectrum of compound 1 recorded in CDCl3
图 7化合物 1的 150 MHz 13C-NMR谱
Figure 7 13C-NMR (150 MHz) spectrum of compound 1 recorded in CDCl3
135.9 (C-7)、138.0 (C-7a)。另，在 1H-NMR和 13C-NMR
谱中存在石油醚主要成分正己烷，正戊烷的杂质峰。
1H-NMR谱中给出了 39个 H，其中 啄H：0.88 (9H, t)与
1.26 (6H, m)共 15个 H皆为石油醚杂质上的氢。在
13C-NMR 谱中 啄C：29.85、29.80、22.84 及 14.28 的信
号峰应为杂质正己烷与正戊烷上的碳信号峰。以上
波谱数据与文献报道(Daigo et al., 2006; Lu et al.,
2008) 及标准核磁数据库比对后发现与橘霉素 A一
777
阴香内生真菌 Y-74鉴定及其次级代谢产物的初步研究
The Separation and Identification of Secondary Metabolites of Fungi Y-74 from Cinnamourmus Endophytic
致，故将化合物(1)鉴定为橘霉素 A (penicitrinone A)，
分子式 C23H24O5 (图 8)。据文献报道，橘霉素 A是一
种具有较强的抗肿瘤活性的物质(夏明文等, 2013,
第十三届中国药师周论文集)。表 1列出了化合物
1 与相应参考文献中橘霉素 A的核磁共振氢谱和
碳谱数据，并进行了归属。
2讨论
本论文对一株从阴香茎部筛选出来的内生真菌
Y-74进行了鉴定，经过菌株形态观察以及分子生物
学方法鉴定，确定该菌株为橘青霉。对该菌株的次级
代谢产物进行了分离纯化，通过发酵培养及样品初处
理，得到固体浸膏，再经反复薄层层析及柱层析分离
得到一纯组分，最后用核磁共振进行结构表征，确定
该物质是橘霉素A，鉴定结果与文献报道及与标准核
磁数据库比对一致。橘霉素A是具有较强的抗肿瘤活
性的物质，这不仅丰富了活性药物的物质资源，还可
以为寻找新型抗肿瘤药物提供一条重要的途径。
3材料与方法
3.1材料
3.1.1菌株来源
阴香内生真菌 Y-74采自广西南宁良凤江国家
No.
1
3
3-Me
4
4-Me
4a
5
5-Me
6
7
8
8a
2
2-Me
3
3-Me
3a
4
4-Me
5
5-OH
6
7
7a
啄C
155.7
82.5
21.1
35.2
19.1
130.9
132.0
10.8
184.6
103.4
158.2
100.2
88.1
19.0
44.8
19.2
139.4
116.6
11.6
147.5
102.4
135.9
138.0
啄H (J in Hz)
4.97 (1H, q, J=6.6)
1.43 (d, overlap)
3.13 (1H, q, J=7.2)
1.32 (3H, d, J=7.2)
2.12 (3H, s)
6.38 (1H, s)
4.62 (1H, qd, J=6.6,4.2)
1.43 (3H, d, J=6.6)
3.16 (1H, qd, J=7.2,4.2)
1.32 (overlap)
2.21 (3H, s)
8.34 (1H, s)
实测核磁数据
The measured NMR data
表 1化合物 1以及参考文献中橘霉素 A的 NMR数据比较(CDCl3)
Table1 Comparision of NMR data of compound 1 and penicitrinone A (CDCl3)
图 8化合物(1)的化学结构
Figure 8 The chemical structures of compound 1
No.
1
3
3-Me
4
4-Me
4a
5
5-Me
6
7
8
8a
2
2-Me
3
3-Me
3a
4
4-Me
5
5-OH
6
7
7a
啄C
155.5
82.3
21.0
35.0
18.9
130.8
131.9
10.8
184.4
103.3
158.0
100.1
88.0
18.8
44.7
19.1
139.3
116.5
11.5
147.4
102.3
135.8
137.9
啄H (J in Hz)
4.97 (1H, q, J=7.0)
1.44 (3H, d, J=7.0)
3.14 (1H, q, J=7.0)
1.32 (3H, d, J=7.0)
2.12 (3H, s)
6.37(1H, s)
4.62 (1H, qd, J=6.7, 4.0)
1.42 (3H, d, J=6.7)
3.16 (1H, qd, J=6.7, 4.0)
1.34 (3H, d, J=6.7)
2.21 (3H, s)
8.34 (1H, brs)
参考文献报道数据
The reference NMR data
778
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
森林公园，初筛结果显示该菌株有一定的抗菌活性。
该菌株保存于广西大学亚热带农业生物资源保护与
利用国家重点实验室。
3.1.2培养基
固体培养基：马铃薯固体培养基(PDA培养基)：
PDA粉(美国 BD公司) 39 g，蒸馏水 1 000 mL，pH自
然，121℃，20 min灭菌。真菌发酵培养基：EP完全培
养基：参照 1971年 Puhalla (1971)描述的方法配制。
3.1.3主要仪器和试剂
G-BOX凝胶成像分析系统(美国 Gene 有限公
司)；DF-D电泳仪(北京东方特力科贸中心)；BX51光
学显微镜型(中国 OLYMPUS有限公司)；RE-52旋转
蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；安捷伦 7890A-5975C
型 GC-LC；Bruker AVANCE 睾-400 MHz 核磁共振
波谱仪，TMS为内标；GF254薄层析硅胶预制板及柱
层析用硅胶(200-300目) (青岛海洋化工厂)。
3.2菌株形态特征
将保存于斜面的菌种 Y-74活化 2~3 d，接种于
PDA培养基平板，置 27℃恒温培养箱中培养 7 d，观
察菌体的形态及菌落特征。利用扫描电镜观察菌丝
特征，包括菌丝体的粗细、是否分枝、性状、颜色、是
否产生分生孢子及有性孢子等。
3.3 ITS rDNA分子鉴定
采用 ITS rDNA基因的通用引物(ITS1/ITS4)对菌
株 Y-74的基因组 DNA进行 PCR扩增，利用凝胶纯
化回收试剂盒纯化 PCR产物，回收产物连接转化进
行测序，序列经 ClustalX软件和 Vector NTI软件进行
拼接和分析后，使用MEGA软件构建系统发育树。
3.4 Y-74菌株次级代谢产物的分离纯化
3.4.1发酵培养
将斜面保存的菌株取出，活化。28℃光照培养 5 d，
用灭菌打孔器打取 6 mm菌饼，用接种环挑取菌饼至
装有 EP完全培养基的 500 mL的锥形瓶中，于 25℃
恒温培养室中静置培养 21 d。
3.4.2 Y-74菌株次级代谢产物的分离纯化
菌株 Y-74发酵液经过滤得到菌体和菌液。菌体
烘干，用液氮研磨成粉末，以物料比为 1:10的比例加
入乙酸乙酯提取剂，浸提过夜，置于超声波萃取仪中
萃取 2 h，减压抽滤，得到乙酸乙酯相，备用。菌液经
旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积后，用等体积的乙
酸乙酯萃取 2~3次，有机相中加入适量的硫酸钠，静
置一段时间，过滤，收集得到乙酸乙酯相。将该滤液
与菌体经处理后获得的乙酸乙酯相的滤液合并，置
于旋转蒸发仪中减压蒸干，得到固态样品，备用。
采用硅胶柱层析对样品进行分离纯化。以乙酸
乙酯 /甲醇体系为洗脱液进行梯度洗脱，分离得到的
11个组分。抗菌活性检测，选用金黄色葡萄球菌为指
示菌，采用杯碟法(牛津杯法)进行抑菌实验。活性检
测中发现，11个组分中，B组、D组及 E组、F组均表
现出了一定的抑菌活性。针对这几个组分应用葡聚
糖凝胶柱层析进一步纯化，GC-MS分析确定从组分
B中分离得到一纯物质(化合物 1)，采用 1H NMR、13C
NMR等手段对该化合物的结构进行鉴定。
作者贡献
梁彩云承担菌株次级代谢产物的分离和鉴定等
实验，并撰写论文初稿；王森胜承担菌株筛选以及菌
株鉴定等部分实验；何熙璞负责研究的总体设计，为
论文提供思路及最终的修改和定稿；刘鸿杰参与实
验指导及论文的修改；张敏和李鹏飞进行了图谱分
析与鉴定。
致谢
本研究由广西林产化学与工程重点实验室开放
课题(GXFC13-05)资助。广西大学生命科学与技术学
院分子病毒研究室邹承武帮助构建系统发育树，周
燕师姐对本论文的撰写给予了修改与指导意见，在
此一并感谢。
参考文献
Abdou R., Scherlach K., Dahse H.M., Sattler L., and Hertweck C.,
2010, Botryorhodines A-D, antifungal and cytotoxic depsi-
dones from Botryosphaeria rhodina, an endophyte of the
medicinal plantBidens pilosa, Phytochemistry, 71(1): 110-116
Amand S., Langenfeld A., Blond A., Dupont J., Nay B., and Pra-
do S., 2012, Guaiane sesquiterpenes from Biscogniauxia
nummularia featuring potent antigerminative activity, Jour-
nal of Natural Products, 75(4): 798-801
Daigo W., Tomoo H., Takeshi I., Kaoru O., Galba M.D.C.T.,
Takashi Y., Kazutaka F., and Kenichi K., 2006, New citrinin
derivatives isolated from Penicillium citrinum, Nat. Med., 60
(4): 279-284
Ding J., and Xia Y.L., 2005, Present situation of Chinese medici-
nal plant resources, Shengwu Ziyuan (Resource Develop-
ment and Market), 21(5): 453-454 (丁建,夏燕莉, 2005,中
779
国药用植物资源现状,生物资源, 21(5): 453- 454)
Ding L., M俟nch J., Goerls H., Maier A., Fiebig H.H., Lin W.H.,
and Hertweck C., 2010, Xiamycin, a pentacyclic indolos-
esquiterpene with selective anti-HIV activity from a bacteri-
al mangrove endophyte, Bioorganic & Medicinal Chemistry
Letters, 20(22): 6685-6687
Liu J., Luo J., Ye H., and Zeng X., 2012, Preparation, antioxidant
and antitumor activities in vitro of different derivatives of
levan from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa
EJS-3, Food and Chemical Toxicology, 50(3-4): 767-772
Lu Z.Y., Lin Z.J., Wang W.L., Du L., Zhu T.J., Fang Y.C., Gu Q.Q.,
and Zhu W.M., 2008, Citrinin dimers from the halotolerant
fungusPenicillium citrinumB-57, Nat. Prod., 71(4): 543-546
Puhalla J.A., 1971, Genetics and nutritional requirements of End-
othia parasitica, Phytopathology, 61: 169-173
Stierle A., Strobel G., and Stierle D., 1993, Taxol and taxane pro-
duction by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of
Pacific yew, Science, 260(5105): 214-216
TejesviM.V., Kini K.R., Prakash H.S., Subbiah V., and ShettyH.S.,
2008, Antioxidant, antihypertensive, and antibacterial prop-
erties of endophytic Pestalotiopsis species from medicinal
plants, Canadian Journal of Microbiology, 54(9): 769-780
Yang C.P., Chen H.B., Wu W.J., and Gu A.G., 2005, Diversity of
plant endophytic fungi secondary metabolites and their po-
tential applications, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agricultur-
ae Boreali-occidentalis Sinica), 14(2): 126-132 (杨春平 , 陈
华保,吴文君,顾爱国, 2005,植物内生真菌次生代谢产物
的多样性及潜在应用价值,西北农业学报, 14(2): 126-132)
Zhang J.Z., Zhang L.H., Wang X.H., Qiu D.Y., Sun D., Gu J.Q.,
and Fang Q.C., 1998, Microbial transformation of 10-deace-
tyl-7-epitaxol and 1茁-hydroxybaccatin玉 by fungi from the
inner bark of Taxus yunnanensis, Nat. Prod., 61(4): 497-500
Tree Genetics and Molecular Breeding (TGMB)
Tree Genetics and Molecular Breeding (ISSN 1927-5781) is an international, open
access, peer reviewed journal, committed to serve for tree genetics and molecular
breeding, particularly publishing innovative research findings in the basic and applied
fields of tree molecular genetics and novel techniques for crop/
fruit/forest/ ornamental/horticultural trees improvement, as well as applications of
molecular enhanced products. TGMB publishes all the latest and outstanding research
articles, letters and reviews in all aspects of tree genetics and molecular breeding,
include studies in tree genetics and molecular breeding, include studies in
crop/fruit/forest/ornamental/horticultural trees genetic diversity, conservation genetics,
molecular genetics, evolutionary genetics, population genetics, physiology,
biochemistry, transgene, genetic rule analysis, QTL analysis, vitro propagation;
fruit/forest/ ornamental/horticultural trees breeding studies and advanced breeding technologies. Authors from
low-income countries and areas or having financial difficulties can apply the discount for APC upon submission,
and if the authors are qualified to be waived they dont necessarily pay the APCs. We do not want fees to prevent
the publication of worthy work.
Email: edit@tgmb.biopublisher.ca
Web: http://tgmb.biopublisher.ca
阴香内生真菌 Y-74鉴定及其次级代谢产物的初步研究
The Separation and Identification of Secondary Metabolites of Fungi Y-74 from Cinnamourmus Endophytic 780