全 文 ：羊踯躅嫩茎离体培养和植株再生
顾地周，陆 爽，巴春影，李媛媛
(通化师范学院生物系，吉林 通化 134002)
摘要:本研究以羊踯躅嫩茎为外植体，应用均匀设计法筛选其最适合的嫩茎基部直接再生芽苗和生根培养基。
结果表明，最适合羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗的诱导培养基为:1 /4DR + 2ip3． 75 mg /L + IAA 0． 03 mg /L +
KT 1． 30 mg /L，诱导率为 99． 8%;生根培养基为:1 /4DR + ZT 0． 06 mg /L + NAA 0． 02 mg /L，生根率达 99． 0%
以上。以再生植株茎节为材料进行快繁的结果表明，在 28 d的培养周期内，每段增殖倍数平均达 5 以上。成功
建立了羊踯躅的离体培养和植株再生体系，所建立的植株再生体系可以满足羊踯躅工厂化育苗的需要。
关键词:羊踯躅;离体培养;植株再生;均匀设计
中图分类号:Q 945． 51 文献标识码:A 文章编号:1000 － 2324(2012)04 － 0574 － 05
收稿日期:2010 － 08 － 12
基金项目:吉林省科技厅资助项目(200705C05)
作者简介:顾地周(1973 －) ，男，吉林通化人，讲师，主要从事珍稀濒危植物和药用植物研究。
* 通讯作者:Author for correspondence． E － mail:liusid@ sdau． edu． cn
IN VITRO CULTURE AND PLANTLET REGENERATION BY THE TENDER
STEM OF RHODODENDRON MOLLE (BLUME)G． DON
GU Di － zhou，LU Shuang，BA Chun － ying，LI Yuan － yuan
(Department of Biology，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China)
Abstract:In this study，the tender stems of Rhododendron molle were used as explants for the experiment，uni-
form design for the most suitable media for shoots regeneration by the tender stems and rooting was screened． The
results showed that 1 /4DR +2ip3． 75 mg /L + IAA 0． 03 mg /L + KT 1． 30 mg /L was the best media for shoots
regeneration and the rate of induction was 99． 8%;1 /4DR + ZT 0． 06 mg /L + NAA 0． 02 mg /L was the best
media for rooting，the rate of rooting was more than 99． 0%;Stems each with one node were cut from regenerated
shoots and cultured for propagation，and a 5 － fold proliferation rate was achieved within 28 days． In vitro culture
and plantlet regeneration system of Rhododendron molle have been successfully established． which could satisfac-
tion of wants for factory changes grows seedlings of Rhododendron molle．
Key words:Rhododendron molle (Blume)G． Don;in vitro culture;plantlet regeneration;uniform design
羊踯躅 Rhododendron molle (Blume)G． Don又名闹羊花、黄杜鹃、黄色映山红。隶属杜鹃花科杜鹃花
属羊踯躅亚属落叶灌木。主要分布江苏、浙江、江西、福建、湖南、湖北、河南，四川、贵州等地的山坡、石缝、
灌木丛中。是珍稀濒危药用植物，羊踯躅花中含毒性成分木毒素和石楠素，叶含黄酮类、杜鹃花毒素、煤地
衣酸甲酯。有镇痛、驱风、除湿、麻醉功效，可治风湿顽痹，伤折疼痛，皮肤顽癣等症。对粮食害虫、蔬菜害
虫有一定的防治效果，可用于开发植物源农药。可引种驯化成为露地栽培的园艺观赏植物，是杜鹃育种的
重要种质资源。羊踯躅利用种子、扦插、嫁接及压条的常规繁殖存在萌发率、生根率和移栽成活率极低等
问题，使其开发及利用受到极大限制。目前，羊踯躅及与其同属的其他植物种的离体培养研究已有报
道［1 － 6］，但羊踯躅的研究并未建立高效的快繁体系。而本研究利用植物组织培养方法，以羊踯躅嫩茎为材
山东农业大学学报 (自然科学版) ，2012，43 (4) :574 － 578
Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science)
料，在嫩茎基部直接诱导芽苗并形成丛生芽的方式建立羊踯躅离体培养和植株再生体系，在国内外尚未见
报道。同时为羊踯躅的工厂化育苗奠定基础和提供方法。
1 材料与方法
1． 1 外植体材料的来源和处理
羊踯躅枝条采自江西省井冈山，将枝条茎尖剪除后在实验室内水培促其腋芽萌发。待腋芽萌发长至
3． 00 cm后将嫩枝剪下，在超净工作台上用体积分数 70%酒精涮洗 10 s，用次氯酸钠(质量浓度为 3%)溶
液浸泡 8 min，无菌水冲洗 8 次，无菌滤纸吸干表面水分后作为外植体备用。
1． 2 羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗培养基的筛选
以 1 /4DR为培养基［7］，加入蔗糖 30 g /L，琼脂 6． 5 g /L，并附加不同浓度的 2ip(由预试验确定为 2．
80 ～ 3． 50 mg /L)、IAA(由预试验确定为 0． 04 ～ 0． 07 mg /L)和 KT(由预试验确定为 0． 50 ～ 1． 00 mg /
L) ，调节 pH为 5． 6，将切割成 1 叶 1 段在温度(26 ± 2)℃、光照强度 1 200 lx、光照周期 12 h /d条件下培
养。采用均匀设计法［8 － 10］，选用 U12(12
3)均匀表，每个处理接种嫩茎数为 10，重复 3 次，考察 2ip、IAA 和
KT不同质量浓度交叉配比对 率的影响。茎段培养 50 d 统计 率，同时筛选最适合羊踯躅嫩茎基部
直接再生芽苗的诱导培养基。
1． 3 羊踯躅植株再生体系的建立
以 1 /4DR为培养基，加入蔗糖 15 g /L，琼脂 7． 5 g /L，并附加不同浓度的玉米素 ZT(由预试验确定
为 0． 01 ～ 0． 05 mg /L)、IAA(由预试验确定为 0． 10 ～ 0． 30 mg /L)和 NAA(由预试验确定为 0． 05 ～ 0．
20 mg /L) ，调节 pH为 5． 4，再生芽苗在温度(20 ± 2)℃、光照强度 800 lx、光照周期 8 h /d 条件下培养。
为了提高羊踯躅芽苗生根速度和生根率，选用 U10(10
3)均匀表，每个处理接种芽苗数为 10，重复 3 次，考
察细胞分裂素 ZT、生长素 IAA和 NAA不同质量浓度交叉配比对生根率的影响。培养 35 d 统计生根率，
筛选最适合羊踯躅芽苗生根的培养基。
采取节增殖方式对羊踯躅进行高效快繁［11，12］，待生根的苗伸长至 3． 00 cm以上时，在超净工作台上打开
培养瓶，将生根的苗留 1 或 2 叶剪下苗干，并切割成 1 或 2 叶 1 段转接到附加 GA31． 00 mg /L的生根培养
基中，进行腋芽萌发伸长同时生根培养，统计并计算每瓶中每段茎节的增殖倍数和周期。
1． 4 数据处理与分析
采用均匀设计法进行初步规律设计性试验，数据分析处理应用均匀设计软件(Uniform Design 3．
0V)。
2 结果与分析
2． 1 1 /4DR培养基中不同质量浓度激素配比对羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗的影响
表 1 羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗培养基筛选的 U12(12
3)均匀设计试验安排与结果
Table 1 U12(12
3)Uniform design test plan and result for media for bud
seedling regeneration at base of tender stems of Rhododendron molle
处理号
Treatment code
因 素 Factors /(mg·L －1)
2ip IAA KT
X1 X2 X3
诱导率 Y /%
The rate of induction /%
1 2． 80 0． 06 0． 70 72． 7
2 2． 90 0． 07 1． 00 78． 9
3 3． 00 0． 07 0． 80 69． 3
4 3． 10 0． 06 0． 50 77． 4
5 3． 20 0． 07 0． 60 73． 5
·575·第 4 期 顾地周等:羊踯躅嫩茎离体培养和植株再生
处理号
Treatment code
因 素 Factors /(mg·L －1)
2ip IAA KT
X1 X2 X3
诱导率 Y /%
The rate of induction /%
6 3． 30 0． 05 0． 90 83． 7
7 3． 40 0． 06 0． 90 90． 0
8 3． 50 0． 04 0． 60 91． 9
9 3． 20 0． 05 0． 50 80． 5
10 3． 30 0． 04 0． 80 87． 5
11 3． 40 0． 04 1． 00 94． 5
12 3． 50 0． 05 0． 70 88． 7
实验所得数据(表 1)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知，检验值 Ft﹥临界值 F (0． 05，3，8)，回归方程
显著。对各方程项进行显著性检验可知:各方程项对 Y 影响均显著。根据回归方程求出 Y 的最优组合
为:X1 = 3． 50，X2 = 0． 04，X3 = 1． 00，在此组合基础上求得最优解:y = 96． 0，此解为回归方程的解析解，同
理，计算优化值区间估计为 Y = 96． 0 ± 7． 37，即 88． 63% ～103． 37%。通过表 1 试验结果和回归分析结果
可知，各方程项对回归的贡献值和贡献率分别为:U1 = 119，U1 /U = 17． 9%;U2 = 74． 1，U2 /U = 11． 1%;U3 =
68． 3，U3 /U = 10． 3%，说明 2ip对再生芽苗的诱导率 Y的贡献远远大于 IAA和 KT，又因 2ip 和 KT均与诱
导率呈正相关，IAA与诱导率呈负相关。以免 2ip质量浓度在 3． 50 mg /L和 KT在 1． 00 mg /L以上及 IAA
在 0． 04 mg /L以下有较高的诱导率，因此，又以 2ip质量浓度为 3． 50 ～ 4． 00 mg /L，IAA 质量浓度为 0． 00、
0． 01、0． 02、0． 03 和 0． 04 mg /L，以及 KT质量浓度为 1． 00 ～ 1． 50 mg /L做了 11 个处理的试验，重复 3 次，
发现 2ip质量浓度为 3． 75 mg /L，IAA质量浓度为 0． 03 mg /L，KT 质量浓度为 1． 30 mg /L 时再生芽苗诱
导率最高。按着 1． 2 中的方法，将嫩枝切割成 1 叶 1 段接种到添加 2ip3． 75 mg /L、IAA 0． 03 mg /L 和
KT1． 30 mg /L的 1 /4DR培养基上进行验证试验，培养 12 d发现嫩茎基部切口处产生大量颗粒状小凸起，
继续培养至 25 d，颗粒状小凸起逐渐转变为锥状，培养至 40 d，锥状体逐渐生长并伸长为不定芽(图
1a) ，培养至 50 d，可产生大量不定芽且长度可达 1． 50 cm以上(图 1b) ，诱导率达 99． 8%以上，在估计区
间内，且比表 1 所列 12 个处理的诱导率均高。可见，羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗诱导的最佳培养基为:
1 /4DR +2ip3． 75 mg /L + IAA 0． 03 mg /L + KT 1． 30 mg /L。
a，b． 嫩茎基部直接再生芽苗诱导培养;c，d． 再生芽苗生根培养和植株再生。
a，b． of shoots regeneration by the tender stems;c，d． Rooting culture and plantlet regeneration．
图 1 羊踯躅离体培养和植株再生各阶段的培养物形态
Fig． 1 Morphostructure of cultures of in vitro culture and plantlet
regeneration of Rhododendron molle at various stages．
2． 2 1 /4DR培养基中不同质量浓度激素配比对羊踯躅再生芽苗生根的影响
·675· 山东农业大学学报(自然科学版) 第 43 卷
表 2 羊踯躅再生芽苗生根培养基筛选的 U10(10
3)均匀设计试验安排与结果
Table 2 U10(10
3)Uniform design test plan and result for media for shoots rooting of Rhododendron molle
处理号
Treatment code
因 素 Factors /(mg·L －1)
2ip IAA KT
X1 X2 X3
诱导率 Y /%
The rate of induction /%
1 0． 01 0． 30 0． 10 82． 0
2 0． 02 0． 30 0． 15 82． 4
3 0． 03 0． 25 0． 20 85． 5
4 0． 04 0． 25 0． 15 88． 3
5 0． 05 0． 20 0． 10 95． 9
6 0． 05 0． 20 0． 15 94． 3
7 0． 04 0． 15 0． 20 87． 6
8 0． 03 0． 15 0． 05 87． 3
9 0． 02 0． 10 0． 05 85． 4
10 0． 01 0． 10 0． 20 77． 0
实验所得数据(表 2)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知，检验值 Ft﹥临界值 F(0． 05，2，7)，说明回归
方程显著。对各方程项进行显著性检验可知:仅 X1和 X3方程项对 Y影响均显著，说明 IAA对生根率 Y影
响不显著。根据回归方程求出 Y的最优组合为:X1 = 0． 05，X3 = 0． 05，在此组合基础上求得最优解:y =
96． 2，计算优化值区间估计为 Y =96． 2 ± 2． 99，即 93． 21% ～99． 19%。通过表 3 试验结果和回归分析结果
可知，X1和 X3方程项对回归的贡献值和贡献率分别为:U1 = 257，U1 /U = 94． 5%;U3 = 24． 0，U3 /U = 8．
82%，同理，ZT对再生芽苗生根率 Y的贡献远远大于 NAA，因 ZT与生根率呈正相关，NAA 与生根率呈负
相关。避免 ZT质量浓度在 0． 05 mg /L以上和 NAA在 0． 05 mg /L以下有较高的生根率，又以 ZT质量浓度
为 0． 05 ～ 0． 10 mg /L以及 NAA质量浓度为 0． 00 ～ 0． 05 mg /L做了 12 个处理的试验，重复 3 次。发现 ZT
质量浓度为 0． 06 mg /L和 NAA质量浓度为 0． 02 mg /L 时芽苗生根率最高。待再生芽苗长至 1． 50 cm
左右时，将生长健壮的芽苗切下，转接到附加 ZT 0． 06 mg /L 和 NAA 0． 02 mg /L 的 1 /4DR 培养基中验
证，培养 8 d在靠近芽苗切口的茎部有微小颗粒出现，继续培养 20 d 微小颗粒逐渐变形为锥状，培养至
27 d锥状颗粒伸长为不定根，35 d后可形成 3 ～ 5 条不定根，并有侧根出现(图 1c) ，生根率达 99． 0%以
上，在估计区间内，且比表 2 所列 10 个处理的生根率均高。可见，羊踯躅再生芽苗生根的最佳培养基为:
1 /4DR + ZT0． 06 mg /L + NAA0． 02 mg /L。
按照 1． 4 中的方法，对生根培养基进行改良，即为 1 /4DR + ZT0． 06 mg /L + NAA0． 02 mg /L + GA31．
00 mg /L。以达腋芽快速萌发生长和生根同时进行的目的(图 1d)。快繁的结果表明，经过 28 d 的培养
后，每节段平均增殖 5 倍以上。
表 3 羊踯躅离体培养和植株再生各阶段的回归分析结果
Table 3 Regression analysis result of in vitro culture and plantlet regeneration in various stages of Rhododendron molle
培养阶段
Culture stages
回归方程
Regression
equation
样本容量(N)
Sample
sizes
复相关系数(R)
Multiple correlation
coefficient
剩余标准差(S)
Residual standard
deviation
检验值(Ft)
Test value
临界值
Critical value
芽苗再生 Shoots
regeneration
Y = 25． 5 + 19． 6X1 －
303X2 + 14． 0X3
12 0． 9437 3． 2000 21． 72 F (0． 05，3，8)= 4． 066
生根培养
Rooting culture
Y = 79． 6 + 360X1 －
28． 2X3
10 0． 9800 1． 2700 85． 00 F(0． 05，2，7)= 4． 737
注:显著性水平 α = 0． 05。
3 结论与讨论
结果表明，培养基 1 /4DR +2ip3． 75 mg /L + IAA 0． 03 mg /L + KT 1． 30 mg /L对羊踯躅嫩茎基部直
·775·第 4 期 顾地周等:羊踯躅嫩茎离体培养和植株再生
接再生芽苗的诱导效果最佳，2ip质量浓度低于 2． 80 mg /L和高于 3． 75 mg /L 时嫩茎基部芽苗诱导率均
下降，均在 53． 0%以下，说明低浓度的 2ip满足不了羊踯躅嫩茎基部直接再生大量芽苗的诱导，而过高的
2ip浓度对嫩茎基部直接再生芽苗的诱导起抑制作用。适宜的 IAA 浓度有利于芽苗的生长。在培养基中
附加 KT1． 30 mg /L， 的芽苗比未附加的粗壮、长势好且诱导速度快［13］;培养基 1 /4DR + ZT 0． 06 mg /
L + NAA 0． 02 mg /L 适合羊踯躅芽苗的生根，当 NAA 低于 0． 02 mg /L 时芽苗几乎不生根，高于 0． 20
mg /L时，芽苗基部膨胀或产生愈伤组织，继续培养根从膨胀部或愈伤组织上产生，这样的苗在移栽时根随
愈伤组织从苗基部脱落，移栽成活率极低，可能是根和苗茎部的纤维疏导组织连接错位等原因所致［14］。
植株的高效快繁采取节增殖的方式法，在生根培养基中附加 1． 00 mg /L 的 GA3有利于腋芽快速萌发和生
长［15，16］，有利于缩短生长周期，从而提高了增殖倍数。该方法简捷，成本低，可操作性强。本研究结果表
明:已成功建立了羊踯躅嫩茎基部直接再生芽苗和高效植株再生体系，达到了预期目的。
目前，国外有许多野生杜鹃优良品种已通过人工繁殖并驯化为园艺栽培种。我国野生杜鹃品种众多，
但人工繁殖并开发利用极少。羊踯躅是我国珍稀药用和观赏植物资源，至今未见推广应用。本研究结果
为羊踯躅和其它野生杜鹃优良品种的开发利用和工厂化育苗奠定基础和提供方法。
参考文献
［1］ 顾宏辉，袁群英，朱春艳，等． 羊踯躅的组织培养与快速繁殖［J］． 植物生理学通讯，2006，42(4) :683
［2］汤桂钧，张建安，蒋建平，等． 高山杜鹃的组织培养快速繁殖技术研究［J］． 上海农业学报，2004，20 (3) :15 － 18
［3］宫汝淳，姜云天，顾地周，等． 短果杜鹃的组织培养与快速繁殖［J］． 植物生理学通讯，2008，44(1) :133
［4］顾地周，邓志刚，綦茂伟，等． 苞叶杜鹃离体培养及种质试管保存体系的建立［J］． 南京林业大学学报(自然科学版) ，2009，33(3) :20 －
24
［5］顾地周，高捍东，郭玉昕，等． 毛毡杜鹃离体培养及种质试管保存体系的建立［J］． 西北农林科技大学学报(自然科学版) ，2009，37(4) :
151 － 157
［6］顾地周，张 琪，朱俊义． 小叶杜鹃的离体快繁体系建立及种质试管的保存［J］． 东北林业大学学报，2009，37(10) :26 － 28
［7］曹孜义，刘国民． 实用植物组织培养技术教程［M］．兰州:甘肃科学技术出版社，2002
［8］顾地周，罗 微，曹 逊，等． 松毛翠的离体快繁体系建立及种质试管保存研究［J］． 林业科学，2009，45(7) :140 － 144
［9］智翠梅． 均匀设计及优化［J］． 化工中间体，2007 (3) :7 － 10
［10］顾地周，冯 颖，顾美影，等． 基于均匀设计优化手参体细胞胚胎发生及植株再生体系［J］． 中草药，2010，41(6) :989 － 993
［11］顾地周，丛小力，姜云天，等． 色木槭的组织培养与快速繁殖［J］． 植物生理学通讯，2008，44(2) :314
［12］顾地周，丛小力，宋利丽，等． 木通马兜铃的组织培养和快速繁殖［J］． 植物生理学通讯，2008，44(1) :136
［13］姜云天，陈艳秋，朱俊义，等．细叶杜香高效快繁体系建立及种质试管保存研究［J］．植物研究，2009，31(2) :118 － 123
［14］Danielle J D， William E V， Kwai Y L． The anatomy of tissue cultured red raspberry prior to and after transfer to soil［J］． Plant Cell(Tissue
and Organ Culture) ，1985，(1) :43 － 50
［15］李合生．现代植物生理学［M］． 北京:高等教育出版社，2002． 256 － 258
［16］王雯雯，马秋月，朱俊义，等．大字杜鹃离体快繁体系建立及种质试管保存研究［J］．植物研究，2009:29(2) :198 － 203
·875· 山东农业大学学报(自然科学版) 第 43 卷