全 文 ：第 33 卷 第 5 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 33 No． 5
2013 年 10 月 JOUＲNAL OF SOUTHWEST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Oct． 2013
收稿日期:2013 － 07 － 30
基金项目:国家林业局林业公益性行业科研项目(201304303)资助;高校产学合作科技重大项目(2013N5002)资助。
第 1 作者:蔡丽平(1967—) ，女，博士。研究方向:土壤侵蚀与植被恢复重建。E-mail:fjclp@ 126. com。
通信作者:马祥庆(1966—) ，男，博士，教授，博士生导师。研究方向:森林培育。E-mail:lxymxq@ 126. com。
doi:10． 3969 / j． issn． 2095 － 1914． 2013． 05． 007
濒危植物沉水樟 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立与优化
蔡丽平1 梅辉坚2 陈奶莲3 苗作云4 吴鹏飞1 邹显花1 马祥庆1
(1．福建农林大学林学院，福建 福州 350002;2．抚州市林业局森林资源监测中心，江西 抚州 344000;
3. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002;4. 黄河科技学院，河南 郑州 450063)
摘要:为从分子水平上探讨濒危物种沉水樟种质资源的保护机制，以其基因组 DNA 为模版，开展
ISSＲ － PCＲ反应体系的研究，对各反应因子水平、引物退火温度和循环参数进行优化，确定适于沉
水樟 ISSＲ － PCＲ反应的最佳体系:20 μL 反应体系中各反应物的最适含量为模板 75 ng、引物 0. 4
μmol /L、dNTP 200 μmol /L、Taq酶 1. 25 U、Mg2 + 1. 5 mmol /L;扩增程序为:94℃预变性 7 min;94 ℃
变性 30 s，53. 0 ～ 58. 0 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 90 s，45 个循环;72℃延伸 7 min，4 ℃保存。
关键词:沉水樟;濒危植物;ISSＲ;PCＲ反应体系
中图分类号:S722. 3 文献标志码:A 文章编号:2095 － 1914(2013)05 － 0040 － 06
Establishment and Optimization of ISSＲ － PCＲ System for
Endangered Plant Species Cinnamomun micranthum
CAI Li-ping1，MEI Hui-jian2，CHEN Nai-lian3，MIAO Zuo-yun4，
WU Peng-fei1，ZOU Xian-hua1，MA Xiang-qing1
(1． College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou Fujian 350002，China;
2． Monitoring Center of Fuzhou Forest Ｒesources，Fuzhou Jiangxi 344000，China;
3. College of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou Fujian 350002，China;
4. Huanghe Science and Technology College，Zhengzhou Henan 450063，China)
Abstract:In order to explore the germplasm resource conservation mechanism for the endangered species Cin-
namomun micranthum from the molecular level，the most appropriate ISSＲ － PCＲ reaction system with its genomic
DNA was experimented by optimizing the level of each reacting factors，the primer annealing temperature and cycle
parameters． The results showed that the suitable dosage of each reacting factor for C． micranthum ISSＲ － PCＲ reac-
tion system was as follows:20 μL reaction system，including 75 ng template，0． 4 μmol /L primer，200 μmol /L
dNTP，1． 25 U Taq enzyme，and 1． 5 mmol /L Mg2 + ． The best amplification program was as:denaturation for 7
min at 94 ℃ in advance，then denaturation at 94 ℃ for 30 s，annealing for 45 s at 53. 0 － 58. 0 ℃，extension for
90 s at 72 ℃，after 45 cycles，extension at 72 ℃ for 7 min，preservation at 4 ℃ ．
Key words:Cinnamomun micranthum;endangered plants;ISSＲ;PCＲ reaction system
沉水樟 (Cinnamomun micranthum (Hayata)
Hayata)是我国樟科植物中含油量较高的速生经济
树种，是大陆和台湾地区的间断分布种。其木材纤
维长，结构均匀，含水量高，是船舶、桥梁、造纸和家
具的重要用材，也是涵养水源和美化环境的优良树
种［1 － 2］。由于长期以来对沉水樟的破坏，加之其种
子产量少、质量差、天然更新困难等原因，沉水樟天
然林资源锐减，处在濒危境地，1982 年被列为国家
三级濒危保护植物［3］。目前仅在福建省建瓯市万
木林自然保护区内有大面积的分布［4］。因此，如何
有效地保护沉水樟种质资源已成为当前林业生产
中急需解决的重大课题。
为了更好地保护沉水樟资源，国内许多学者从
沉水樟细根养分异质性［5］、生物学特性［6］、人工培
育、扦插繁殖技术、体细胞变异［1，6 － 10］、濒危机制［4］
等方面进行了大量研究，对沉水樟的栽培生物学特
性及栽培技术有了一定了解，但目前对沉水樟濒危
的内在机制尚不清楚，特别是对从分子生物学角度
探讨沉水樟遗传多样性及其濒危机制的研究较少。
用 ISSＲ分子标记技术进行基因组分析具有很
好的多态性和稳定性，已成为植物种质资源鉴定及
遗传多样性分析的重要手段［11 － 15］。国内外学者应
用 ISSＲ分子标记技术对不同植物的遗传多样性
进行了大量研究，Ｒ． M． A． Khalil［16］应用 ISSＲ 标
记技术对 7 个高粱(Sorghum spp. )品种进行了鉴
定，胡凤荣等［17］应用 ISSＲ 技术进行风信子(Hya-
cinthus orientalis)引 物 的 筛 选，E. Svobodová 等
人［18］还用其对雪莲果(Smallanthus sonchifolius)及
其近缘种进行研究，均取得了较好效果，但在林木
遗传多样性方面的研究相对较少。有鉴于此，本
文采用 ISSＲ 分子标记技术从分子水平上探讨影
响沉水樟 ISSＲ － PCＲ 反应的因素，建立沉水樟
ISSＲ － PCＲ 的最佳反应体系，为沉水樟遗传多样
性分析、亲缘关系鉴定及其濒危机制研究奠定基
础，对濒危植物沉水樟迁地保护和天然种群保护
提供重要参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
在福建省建瓯市万木林自然保护区(东经
118°0822″ ～118°0923″，北纬 27°0228″ ～ 27°0332″)
内选取 31 株天然沉水樟标准木，根据沉水樟在天然
林中的分布规律，采取不规格的网格线随机采集，
单株间距在 20 m左右。同时，在福建农林大学莘口
教学林场(东经 117°2600″，北纬 26°1130″)32 年生
沉水樟迁地保护林中选择 13 株沉水樟标准木。每
个取样单株采集嫩叶 5 ～ 7 片，采样后分别编号置于
塑料自封袋，放入带有大量冰块的泡沫箱中带回实
验室，置于 － 70℃超低温冰箱中储存备用。
1. 2 试验试剂
dNTP(10 mmol /L)、Taq 酶(2. 5 U /μL)、10 ×
PCＲ buffer、MgCl2(25 mmol /L)均购自天为时代生物
技术有限公司。GeneＲulerTM 100 bp DNA Ladder
Plus购自上海生物工程公司(产品 SM0321)。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 DNA的提取 采用改良的 CTAB 法提取基
因组 DNA［19 － 21］，用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳
法(EB染色)测定基因组 DNA 的浓度和纯度。根
据琼脂糖凝胶电泳结果检测 DNA的质量，利用分光
光度结果计算样品的浓度，最后将样品浓度稀释至
50 ng /μL，－ 20℃保存备用。
1. 3. 2 ISSＲ分子标记 利用德国 Eppendorf 公司
的 Eppendorf Mastercycler 型 DNA 扩增仪进行 PCＲ
反应。本试验设定了参与 ISSＲ反应的 DNA模板浓
度、引物浓度、dNTP 浓度、Mg2 +浓度、TaqDNA 聚合
酶用量、退火温度、延伸时间、循环次数等关键因子
的变化梯度进行条件优化，各参数设计见表 1。对
UBC#系列的 100 个引物进行 ISSＲ － PCＲ 扩增(退
火温度统一为 53℃)的初步筛选，选出具有清晰扩
增条带的引物 18 条。PCＲ 扩增反应产物以 100 bp
DNA Ladder Plus为 Marker，用含 0. 5 μg /mL EB 的
1. 5%琼脂糖凝胶电泳，在电压 130 V(4 V /cm)的条
件下，电泳 90 min，用 VILBEＲ LOUＲMAT 公司凝胶
成像系统照相并保存。
表 1 ISSＲ － PCＲ反应体系影响因子梯度水平设计
梯度水平
DNA模板 /
ng
引物 /
(μmol·L －1)
dNTP /
(μmol·L －1)
Mg2 +浓度 /
(mmol·L －1)
TaqDNA聚
合酶 /U
退火
温度 /℃
循环次数
延伸
时间 / s
1 25 0. 1 50 1. 00 0. 50 50. 0 ± 1. 0 25 60
2 50 0. 2 100 1. 25 0. 75 52. 0 ± 1. 0 30 75
3 75 0. 3 150 1. 50 1. 00 54. 0 ± 1. 0 35 90
4 100 0. 4 200 1. 75 1. 25 56. 0 ± 1. 0 40 105
5 150 0. 5 250 2. 00 1. 50 58. 0 ± 1. 0 45 120
6 － 0. 6 300 2. 25 1. 75 60. 0 ± 1. 0 － －
7 － － － 2. 50 2. 00 － － －
8 － － － 2. 75 － － － －
14第 5 期 蔡丽平等:濒危植物沉水樟 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立与优化
2 结果与分析
2. 1 模板对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
PCＲ反应中对模板浓度要求的范围较宽，不同
类群的 DNA 进行 PCＲ 时适合的浓度不同［22］。本
试验对 25 ～ 150 ng的模板分别进行了 PCＲ扩增，结
果发现:在此范围内模板浓度对 PCＲ产物的特异性
和稳定性影响不大，只是扩增的条带清晰度有差
异。根据扩增结果(图 1) ，本试验最终选定 75
ng /20 μL为本研究的最佳模板浓度。
2. 2 引物浓度对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
引物浓度的变化实质上是改变了引物与模板
的配对几率，从而影响扩增效率［23］。引物浓度过
低，引物与模板的结合几率降低，扩增反应过早终
止，扩增条带过浅甚至不能得到可观察的结果;引
物浓度过高，引物与模板非特异性配对增加，出现
非特异性扩增［24］。从图 2 可看出，在本试验设置
的 6 个引物浓度梯度中，0. 4 μmol /L 引物浓度条
件下扩增结果稳定，重复性较好。为了减少非特
异性扩增，加强重复性，本试验最终选用的引物浓
度为 0. 4 μmol /L。
2. 3 dNTP浓度对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
dNTP是 PCＲ 的原料，常用的浓度范围为 50 ～
200 μmol /L，浓度过高会产生错误掺入，并与
TaqDNA聚合酶竞争 Mg2 +，使 TaqDNA 聚合酶不能
充分发挥聚合作用，导致扩增失败;浓度过低导致
产率过低，甚至会因 dNTP 过早消耗完而使产物单
链化［23］。本试验对不同浓度的 dNTP 进行 PCＲ 扩
增，dNTP 在 150 ～ 200 μmol /L 时扩增结果一致，而
在 100 μmol /L 时条带不够清晰，在 250 μmol /L 以
上带型会产生变化(图 3) ，本试验最终采用 200
μmol /L的 dNTP浓度。
2. 4 Mg2 +浓度对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
Mg2 +浓度对 PCＲ 反应的特异性和扩增效果有
着显著影响，Taq 酶的聚合作用需要一定浓度的
Mg2 +来激活［25］。若 Mg2 +浓度过低，加上 dNTP 和
溶液中的 EDTA 对 Mg2 +的鳌合作用［26］，使没有足
够的 Mg2 +来激活 Taq酶的活性，将导致扩增减少甚
至整个反应失败。而 Mg2 +浓度过高，反应严谨性降
低，非特异性产物将大大增加［27］。从图 4 可看出:
本试验设置的 8 个 Mg2 +浓度梯度中，在 1. 5 mmol /L
浓度下扩增稳定，重复性强，且此浓度正好是 10 ×
24 西 南 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
Taq Plus Ｒeaction Buffer(含 15 mmol /L MgCl2)溶液
中 Mg2 + 的浓度，因此试验中可省去外加 MgCl2
环节。
2. 5 TaqDNA聚合酶用量对 ISSＲ － PCＲ的影响
酶的用量是影响 PCＲ反应的另一个重要因素，
酶浓度过低无法扩增，浓度太高又会产生非特异性
扩增［28］。设置酶浓度从 0. 50 ～ 2. 00 U 对每个反应
体系分别进行扩增，结果(图 5)表明:在酶浓度为
0. 50 U 时扩增条带少且模糊，酶浓度 1. 25 U 和
1. 50 U 时扩增谱带结果稳定一致，重复性好，酶浓
度为 2. 00 U 时带型发生变化。由于 TaqDNA 聚合
酶的成本较高，所以在确保试验结果稳定的前提
下，每个反应体系采用较低的浓度 1. 25 U。
2. 6 退火温度对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
退火温度是影响 ISSＲ 扩增特异性的主要因子
之一。微卫星引动的 PCＲ 和 ＲAPD － PCＲ 很相似，
退火温度明显影响扩增带的式样［23］。本试验尝试
50 ～ 60 ℃的退火温度，不同引物具有不同的最适退
火温度，对所筛选出的多态性引物进行最佳退火
温度的筛选确定。从表 2 可见，引物的退火温度
一般在 53. 0 ～ 58. 0 ℃，以 54. 0 ℃和 57. 0 ℃为退
火温度的引物较多。根据引物 UBC836 退火温度
梯度(图 6)扩增结果，最终确定 58. 0 ℃为其最佳
退火温度。
表 2 沉水樟居群所用引物序号、序列及实际退火温度
引物名称 碱基序列 5 － 3
退火温度
Tm /℃
UBC813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 54. 0
UBC815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 53. 5
UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC 54. 0
UBC825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 53. 0
UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA G(CT)T 55. 0
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA G(CT)C 57. 0
UBC836 AGA GAG AGA GAG AGA G(CT)A 58. 0
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG A(CT)T 55. 5
UBC847 CAC ACA CAC ACA CAC A(AG)C 53. 0
UBC848 CAC ACA CAC ACA CAC A(AG)G 56. 0
UBC854 TCT CTC TCT CTC TCT C(AG)G 54. 0
UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA C(CT)T 57. 0
UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA C(CT)G 54. 5
UBC858 TGT GTG TGT GTG TGT G(AG)T 56. 0
UBC859 TGT GTG TGT GTG TGT G(AG)C 57. 0
UBC880 GGA GAG GAG AGG AGA 53. 0
UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG 57. 0
UBC891 (ACT)(ACG)(ACT)TGT GTG TGT GTG TG 57. 0
34第 5 期 蔡丽平等:濒危植物沉水樟 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立与优化
2. 7 延伸时间对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
在 ISSＲ反应中延伸温度一般为 72 ℃，延伸时
间的长短和扩增片段的长度呈正相关。时间过短，
无法完成扩增，产量低;时间过长，会产生非特异扩
增［29］。本研究进行 5 种试验，发现不同引物最适的
延伸时间不同。对沉水樟来说，不同引物扩增的片
段大小范围不同，而且跨度较大，一般为 2. 0 kb ～
200 bp，60 s 时多数引物无扩增带或带型很少，90 s
时多数引物获得稳定扩增，带型较为丰富(图 7)。
因此为了试验的统一性，不论引物组成均采用 90 s
的延伸时间。
2. 8 循环次数对沉水樟 ISSＲ － PCＲ的影响
PCＲ的循环次数决定产量，本试验选取 2 个
模板进行 25、30、35、40、45 次循环扩增，结果见
图 8。
结果表明:25 个循环时，没有扩增;30 个循环
时，扩增的条带总体很弱、不稳定;随着循环次数的
增加，扩增的条带逐渐变亮，35、40、45 个循环时，扩
增结果基本一致，而 45 个循环的扩增条带更亮一
些。为了试验的统一性，选取 45 个循环作为最佳
条件。
3 结论与讨论
应用 ISSＲ分子标记技术对沉水樟模板浓度、引
物浓度、dNTP 浓度、Mg2 + 浓度、TaqDNA 聚合酶用
量、退火温度、循环次数、延伸时间等进行优化，建
立适合沉水樟 ISSＲ － PCＲ 分析的反应体系和扩增
程序:20 μL 反应体系中加入模板 7 5ng，引物 0. 4
μmol /L，dNTP 200 μmol /L，Taq酶 1. 25 U，Mg2 + 1. 5
mmol /L;94 ℃预变性 7 min;94 ℃变性 30 s，53. 0 ～
58. 0 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 90 s，45 个循环后;72 ℃
延伸 7 min，4 ℃保存。
退火温度对 ISSＲ 指纹的稳定性至关重要［30］。
较低的退火温度增加了非特异扩增的可能，导致一
些假带的产生［31］。本研究对初筛多态性引物的最
佳退火温度进行梯度试验发现:退火温度对沉水樟
扩增结果影响明显，不同引物具有不同的最适退火
温度，对此本试验建立了每条引物扩增的最佳温
度，这与张杨等［23］的研究结果不同，导致这一结果
的原因可能是供试材料不同所致;模板的浓度和纯
度、引物浓度、dNTP浓度一定范围内对 ISSＲ扩增的
稳定性和重复性影响不显著［23，32］;随着分子生物学
技术的不断发展以及分子标记技术体系的不断完
善，Mg2 +浓度的波动范围较小［32］;不同厂家或同一
厂家生产不同批次的 TaqDNA 聚合酶具有较大差
异［33］，为确定最佳的酶用量，对于不同的 TaqDNA
聚合酶用量都要进行优化;循环次数和延伸时间因
扩增的 DNA片断大小而不同。上述各因素对扩增
结果的影响差异显著，这可能与各试验所选材料不
同息息相关，因此，对沉水樟试验的反应体系进行
优化，最终确定沉水樟 ISSＲ － PCＲ最佳反应体系是
必要的。
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(责任编辑 张 坤)
54第 5 期 蔡丽平等:濒危植物沉水樟 ISSＲ － PCＲ反应体系的建立与优化