全 文 ：浙江楠（P. chekiangensis）、紫楠（P. sheareri）和
桢楠（P. zhennan）为樟科（Lauraceae）楠属常绿阔叶
乔木。该属木材坚实，结构细致，不易变形和开裂，
为建筑、家具、船板等优良木材；在园林景观、化妆
品研发和香料提取等方面也占有重要地位，素有
“木材贵族”之美称，具有广泛的使用价值和巨大的
经济价值[1-2]。近年来，随着楠属市场树种的增多，不
同树种间差价巨大，一些不法商贩为了渔利以次充
好，影响了木材市场的健康发展。
传统的木材鉴定主要采用形态学方法，难以区
分到种。简单序列重复区间扩增多态性（inter-
simple sequence repeat，ISSR）是 E.Zieticwiez 等 [3]于
3种楠木 DNA提取及其 ISSR标记鉴别
王 英 1，骆嘉言 1*，钟文翰 2，石江涛 1，樊 帅 1
（1. 南京林业大学材料科学与工程学院，南京 210037；
2. 浙江省家具检测技术研究重点实验室，杭州 311112）
摘要：【目的】采用 ISSR分子标记鉴别楠属 3个树种。【方法】以紫楠、浙江楠和桢楠木材为对象，比对改良 CTAB-
SDS法、CTAB法和试剂盒法 3种方法提取的木材基因组 DNA质量，采用 ISSR-PCR技术对 3个树种 24个样本基
因组 DNA进行扩增。【结果】改良 CTAB-SDS法和 CTAB法较适合这 3种木材的 DNA提取。序列扩增筛选出 7条稳
定、条带清晰且多态性好的引物，确定其最佳退火温度。7条引物共扩增出 67条大小为 100～2 000 bp的条带，其中多
态性条带 43条，多态率 64.2％。【结论】这 7条引物扩增的多态性条带都可用于鉴别与区分这 3种楠木。
关键词：紫楠；浙江楠；桢楠；ISSR-PCR；分子鉴定
中图分类号：S792.24 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2016）04-0450-06
DNA Extraction and Wood ISSR Identification from
Three Phoebe Species
WANG Ying1，LUO Jia-yan1*，ZHONG Wen-han2，SHI Jiang-tao1，FAN Shuai1
（1. College of Materials Science and Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China；
2. Key Laboratory of Furniture Inspection Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 311112，China）
Abstract:【Objective】The aim of the study was to identifying 3 phoebe species by inter simple se－
quence repeat（ISSR）technique.【Method】The optimized CTAB-SDS，CTAB and kit for DNA extrac－
tion methods were used to extract wood DNA from P. sheareri，P. chekiangensis and P. zhennan. Three
species were amplified with ISSR -PCR technique.【Results】The optimized CTAB-SDS and CTAB
methods were better for DNA extraction of 3 woods. 7 ISSR primers were screened and their amplifica－
tion were stable，clear and high polymorphic. A total of 67 bands were obtained through 7 primers，
43，64.2% of which were polymorphic. DNA fragment size were ranged from 100 bp to 2 000 bp.
【Conclusion】These polymorphism bands amplified by the 7 primers can distinguish the woods of 3
species.
Key words: P. sheareri；P. chekiangensis；P. zhennan；ISSR-PCR；molecular identification
第 34卷 第 4 期
2016年 12月
收稿日期：2016-05-13
基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。
作者简介：王英，硕士研究生。*责任作者：骆嘉言，副教授，主要从事木材学方面的研究，E-mail：luojiayan@njfu.edu.cn。
Vol．34 No．4
Dec． 2016
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Agricultural University
doi：10. 16036/j. issn. 1000-2650. 2016. 04. 010
表 1 实验用材料的信息
Table 1 Information of tested materials
H1
H2
H3
编号
No.
树种
Species
浙江楠 Phoebe chekiangensis
紫楠 Phoebe sheareri
桢楠 Phoebe zhennan
来源
Source
南京林业大学立木
南京林业大学立木
四川
取样部位
Sample position
幼嫩枝条木质部
成熟树干边材
木材标本
重复次数
Repeats
3
3
3
采样量
Sample size
8
8
8
表 2 3种方法的步骤与区别
Table 2 Methods of DNA extraction
传统的 CTAB法
方法 Methods 主要步骤 Main steps
将木粉加入 2%的 CTAB缓冲液，PVP，β-硫基乙醇和蛋白酶 K中混匀，65 ℃水浴 2 h，用氯仿/异戊醇抽
提 3次，异丙醇冷冻 DNA沉淀 1 h，TE缓冲液溶解 DNA，加入 RNase，4 ℃保存
将木粉加入 2%的 CTAB缓冲液，SDS，PVP，β-硫基乙醇和蛋白酶 K中混匀，65 ℃水浴 2 h，用氯仿/异
戊醇抽提 3次，异丙醇冷冻 DNA沉淀 1 h，TE缓冲液溶解 DNA，加入 RNase，4 ℃保存
将木粉加入 GP缓冲液，PVP，β-硫基乙醇和蛋白酶 K中混匀，65 ℃水浴 20 min，加入缓冲液 GD和漂
洗液 PW去除洗脱蛋白等，TE缓冲液溶解 DNA，4 ℃保存
试剂盒法
改良的 CTAB-SDS法
1994年提出的一种利用 PCR扩增进行检测的 DNA
标记。具有稳定性好、多态性丰富、成本低、操作简
单和样品用量少等特点，该技术已在植物遗传多样
性分析和树种鉴定中得到广泛应用，Fang D.Q. 等[4]
用 ISSR标记区分亲缘关系很近的柑橘属，只需 22
个引物就将 68个柑橘区分开来。沈永宝等 [5]采用
ISSR标记技术，仅用 2个 ISSR引物就将 13个银杏
区分开来。侯渝嘉等[6]利用 ISSR分子标记技术研究
了茶树种质资源，结果表明只要其中任何 1条引物
即可将 14个茶树区分开来。李薇等[7]采用 ISSR标
记技术对 6个美洲黑杨树种进行鉴定分析，只需单
独 1条引物就可区别它们。A.Prevost等[8]采用 2条
引物将 34份马铃薯区分开来。邢建宏等[9]利用 15
条 ISSR 引物对樟树 35个树种进行亲缘关系和遗
传多样性的分析，结果表明在遗传距离约为 0.21处
可划分为樟树、油樟、云南樟和猴樟 4大类群。刘君
等[10]利用 ISSR技术对 9种狗牙根进行鉴定分析，结
果表明只需 2个引物构建的指纹图谱就可区分这 9
个品种，并通过聚类分析将它们聚为 5类。朱沛煌
等[11]利用 ISSR分子标记技术对 26份红桔资源进
行亲缘关系分析，结果表明遗传相似性系数 GS=
0.62~0.86，在 0.73处将所有资源聚为 4类。ISSR分
子标记技术在种质鉴定中成功应用，并被证实具有
很好的可靠性和稳定性。因此，本研究利用 ISSR分
子标记技术对楠属 3个树种进行鉴别，为楠属木材
准确鉴别提供技术支持。
1 材料和方法
1.1 材料
实验材料经南京林业大学树木学向其柏教授
通过形态学标记方法鉴定为浙江楠、紫楠和桢楠，
样品详细信息见表 1。
1.2 DNA提取
DNA提取采用改良 CTAB-SDS法[12]、CTAB法[13]
和试剂盒法[14]，其主要步骤见表 2。
1.3 DNA浓度和纯度检测
用紫外分光光度计检测 DNA样品的浓度与纯
度 OD260/280，OD260/230值，用琼脂糖凝胶检测 DNA的
质量。
1.4 ISSR分析
查阅文献[15-17]选出 20条 ISSR引物（表 3），
设定梯度退火温度：50、52、54、56 ℃，对浙江楠、紫
楠和桢楠进行 PCR 扩增。扩增反应体系：10×Taq
Buffer（含 Mg2+）2μL、dNTP Mixture（10 mmol/L）0.8μL、
DNA模板（100 ng/μL）2 μL、ISSR引物（10 mmol/L）
3 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、无菌水 12 μL。
PCR循环：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 40 s，退火
40 s，72 ℃延伸 2 min，循环 35次，72 ℃保温 10 min。
电泳检测：取扩增产物 5 μL上样到 2%琼脂糖凝胶
中电泳，电泳缓冲液为 0.5×TBE，电压 180 V，电泳
40 min。电泳完毕后放入凝胶成像系统中观察、拍照。
1.5 数据分析
对扩增的电泳图进行读带分析，统计多态性位
王 英，等：3 种楠木 DNA 提取及其 ISSR 标记鉴别第 4期 451
点，计算多态性比率，多态性比率=（总条带数－共有
条带数）/总条带数×100%。
取同一树种不同样本扩增出的共有条带，构建
浙江楠、紫楠和桢楠的指纹图谱，用于鉴别这 3个
树种。
2 结果与分析
2.1 木材 DNA质量
3种方法的 DNA提取液经琼脂糖凝胶检测，结
果见图 1，改良 CTAB-SDS 法和 CTAB 法提取的
DNA主带清晰，残留杂质少。试剂盒法的条带虽强，
但点样孔有较多残留的糖类等杂质，且条带弥散，
电泳拖尾严重。
DNA经紫外分光光度计检测，DNA得率、OD260/280
及 OD260/230见表 4，不同方法提取同一树种的 DNA
质量差别明显。用改良 CTAB-SDS 法和 CTAB法提
取的 DNA OD260/280在 1.7~2.0，OD260/230均大于 2，说
明 RNA，蛋白质污染少，有机溶剂残留少，DNA
样品纯度高，其中改良 CTAB-SDS 法提取的 DNA
样品浓度高达 88 μg/g，近似是 CTAB 法提取 DNA
样品浓度的 1 倍。用试剂盒法提取的 DNA 质量
低，平均每 1 g木材只能获得 3.3 μg DNA，OD260/280
大于 2。
随机选择表 2 中的引物 842 和 808 对不同方
法提取的 DNA进行 PCR扩增，电泳图见图 2。扩增
结果表明 3种 DNA模板均可扩增出检测条带，但
改良 CTAB-SDS法和 CTAB 法扩增的条带清晰，多
态性好，重复性高，根据多态性位点上特异性条带
可快速区分浙江楠、紫楠和桢楠。而用试剂盒法扩
增的条带模糊，背景弥散，不能有效区别 3种树木。
扩增结果与 DNA纯度检测结果一致。
3种检测结果表明，改良 CTAB-SDS法和 CTAB
表 3 本实验所用引物及其序列
Table 3 ISSR primers and sequences
811
812
840
841
842
853
808
826
827
866
891
895
837
838
858
859
871
872
873
881
引物号 Primer 引物序列 3-5Sequence（3-5）
GAG AGA GAG AGA GAG AC
GAG AGA GAG AGA GAG AA
GAG AGA GAG AGA GAG AYT
GAG AGA GAG AGA GAG AC
GAG AGA GAG AGA GAG AYG
TCT CTC TCT CTC TCT CRT
TAT ATA TAT ATA TAT AG
ACA CAC ACA CAC ACA CC
ACA CAC ACA CAC ACA CG
CTC CTC CTC CTC CTC CTC
HVH TGT GTG TGT GTG TG
AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC
TAT ATA TAT ATA TAT ART
TAT ATA TAT ATA TAT ARC
TGT GTG TGT GTG TGT GRT
TGT GTG TGT GTG TGT GRC
TAT TAT TAT TAT TAT TAT
GAT AGA TAG ATA GAT A
GAC AGA CAG ACA GAC A
GGG TGG GGT GGG GTG
参考文献 References
[15]
序号来源 Source
润楠
Machilus pingii
图 1 各种方法提取 DNA 的电泳
Figure 1 Electrophoresis of DNA for different
extraction methods
第 34卷四川农业大学学报
[16]思茅木姜子Litsea pierrei
[17]樟树Cinnamomum camphora
452
王 英，等：3 种楠木 DNA 提取及其 ISSR 标记鉴别第 4期
图 2 引物 842，808 扩增结果
Figure 2 Amplified results of primers 842 and 808
表 4 木材 DNA质量
Table 4 DNA quality of wood
H1
H2
H3
DNA含量 DNA content/（μg·g-1）
88.4±6.2
69.1±9.0
75.7±3.8
CTAB-SDS
编号
No.
56.9±8.8
36.6±3.7
41.5±7.1
CTAB
4.2±0.5
2.9±0.3
3.0±0.9
试剂盒
OD260/280
1.85±0.02
1.93±0.09
1.71±0.02
CTAB-SDS
1.80±0.03
2.0±0.06
1.71±0.07
CTAB
3.16±0.8
2.73±0.8
2.62±0.1
试剂盒
OD260/230
2.08±0.09
2.16±0.06
1.95±0.06
CTAB-SDS
2.17±0.04
2.13±0.04
1.99±0.05
CTAB
3.12±0.7
2.86±0.3
5.51±0.5
试剂盒
注：表中数据为 3 次实验重复的平均值。
Note: The mean values have been averaged from three experiments.
法提取的 DNA 样品纯度高，OD260/280 大多在 1.8~
2.0，适合从新鲜木材和标本木材中提取 DNA，且能
有效用于 ISSR-PCR扩增，试剂盒法提取的 DNA质
量不能得到满意的结果。本试验在提取 DNA过程
中参考前人的研究，在液氮研磨和提取液中加入
PVP，抽提时加入 β-巯基乙醇并将抽提次数从 2
次增至 4 次，发现能较好地降低褐化程度，并将
OD260/280从 1.3左右提升 1.8左右，提高了 DNA的纯
度。而试剂盒法主要是针对少量新鲜样品设计的，
所用各种提取液很少，且温育时间短，导致提取液
不能充分与样品混匀，DNA抽提不彻底，很多抑制
PCR扩增的物质也难以充分去除。相比之下，改良
CTAB-SDS 法和 CTAB 法所用的样品量和试剂量
都较多，抽提比较充分，所以提取的效果好于试剂
盒法。
2.2 ISSR引物及退火温度的筛选
从 20条 ISSR 引物中筛选出了 7 条能够扩增
出清晰条带且多态性好的引物，分别是引物 808、
811、826、827、841、842和 844，最佳退火温度分别
是：52、52、54、56、52、56和 50 ℃，部分引物（827和
811）的筛选结果见图 3。引物 827和 811在不同温
度下扩增出的条带都很清晰，但在 56 ℃和 52 ℃时
扩增的条带数最多，多态性最好，综合考虑将其定
为最佳退火温度。
2.3 ISSR多态性分析
7条引物对 3个树种 24个样本进行扩增，共获
得 67条清晰可辨条带，部分引物扩增电泳图见图4，
其中多态性条带 43条，平均多态性比率为 64.2％，
扩增的 DNA片段集中在 100~2 000 bp。平均每条引
物扩增出 9.6条带，其中 6.1条具多态性，见表 5。多
态性最高的为 85.7%（引物 826），低的只有 40%（引
物 841），不同引物扩增的产物在多态性水平上有较
大差异，表明参试材料浙江楠、紫楠和桢楠在分子
水平上差异很大，具有丰富的遗传多样性。扩增结
果表明筛选出的 7条引物扩增的多态性条带都可
鉴别与区分参试的 3种楠木。
2.4 ISSR标记鉴别
本试验通过 3次重复得出，扩增出的 DNA片段
长度基本相同，重复性很高，说明引物重复性好，多态
性高，可以用于指纹图谱的构建。以 7条引物 ISSR-
PCR扩增电泳图为基础，取同一树种不同样本扩增
出的共有条带，构建浙江楠、紫楠和桢楠的指纹图
453
表 5 7条 ISSR引物扩增结果
Table 5 Amplified results of 7 ISSR primers
808
811
826
827
842
844
841
总计 Total
平均Mean
引物序号
Primer
52
52
54
56
56
50
52
—
—
退火温度
Annealing temperature/℃
12
9
7
8
14
7
10
67
9.6
总条带数
Total bands
7
7
6
5
9
5
4
43
6.1
多态位条带数
Numbers of polymorphic bands
58.3
77.8
85.7
62.5
64.3
71.4
40
—
64.2
多态性比率
Polymorphism/%
图 3 引物 827，811 退火温度的筛选
Figure 3 Annealing temperature screening of primers 827 and 811
图 4 3 条引物 ISSR-PCR 扩增电泳图（部分）
Figure 4 Electrophoresis of ISSR-PCR amplification for 3 primers
第 34卷四川农业大学学报454
表 6 7种引物构建的 ISSR指纹模式图
Table 6 ISSR fingerprints of 3 phoebes amplified by 7 primers
H1
H2
H3
808片段 Primer 808/bp
＋
-
＋
170
编号
No.
＋
-
-
900
-
-
＋
700
811片段 Primer 811/bp
＋
＋
-
750
-
-
＋
200
＋
＋
＋
450
827片段 Primer 827/bp
＋
＋
-
1 700
-
-
＋
400
＋
-
＋
250
注：＋表示扩增成功，-表示未扩增成功。
Note：＋ and - indicate success or failure of amplification, respectively.
H1
H2
H3
826片段 Primer 826/bp
＋
-
-
700
编号
No.
-
-
＋
500
-
＋
＋
250
841片段 Primer 841/bp
＋
-
-
750
-
＋
-
1 500
842片段 Primer 842/bp
＋
-
-
1 200
-
-
＋
150
844片段 Primer 844/bp
＋
-
＋
200
-
-
＋
400
谱，见表 6。其中每条引物构建的指纹图谱单独使用均
可将楠属 3个树种鉴别开来。引物 808构建的指纹
图谱，浙江楠在 900 bp处扩增出特异性条带，桢楠在
700 bp处扩增出特异性条带，通过这两条带可将 3
个树种鉴别开来。引物 842指纹图谱表明在 1 200 bp
处可区分出浙江楠，150 bp处可区分出桢楠。
（下转第 477页）
王 英，等：3 种楠木 DNA 提取及其 ISSR 标记鉴别第 4期
3 结论与讨论
①改良 CTAB-SDS 法和 CTAB 法均适合浙江
楠、紫楠和桢楠木材基因组 DNA的提取，且提取的
DNA 满足 ISSR-PCR 扩增要求，试剂盒法提取的
DNA不能得到满意的结果。
②利用 20条 ISSR引物进行 PCR扩增，从 20
条 ISSR引物中筛选出 7条条带稳定，多态性高的引
物（808、811、826、827、841、842 和 844）并测得其最
佳退火温度，分别是 52、52、54、56、52、56和 50 ℃。
③7条 ISSR引物共扩增出 67条条带，其中 43
条为多态性条带，条带的稳定性和可重复性高，每个
树种均有各自特异的条带，经多次 PCR扩增和电泳
检测验证，可用于参试材料浙江楠、紫楠和桢楠木
材的鉴定。
基因组 DNA质量是分子鉴定试验的关键因素
之一，樟科植物细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣
质、桂皮醛和桂皮酸等次生代谢物，会干扰 DNA的
提取，影响 DNA的质量。徐虹等[18-19]用 CTAB法从
樟科植物叶片基因组中提取了高质量 DNA，用试剂
盒法提取的 DNA质量很低，这与本研究结果一致，而
焦立超[20]用试剂盒法从杉木中提取了高质量 DNA，
说明不同树种适合不同DNA提取方法，而改良 CTAB-
SDS法和 CTAB法均适合楠属 3种木材 DNA 的提
取。
用 ISSR分子标记技术鉴定木材，鉴定时间短、
结果准确、耗材少、不受时间和环境的限制，拓宽了
木材识别的范围，提高了木材识别的精确性，而且
采用琼脂糖凝胶电泳进行分子鉴定，大大节约了实
验的经济成本，可用于大规模 DNA指纹分析，这不
仅在进出口树种鉴定中意义重大，在巨大的木制品
消费市场及相关其他领域也具有广泛的应用前景
和开发利用价值。
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