全 文 ：• 2687 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年 11月第 26 卷第 11期 CJTCMP , November 2011, Vol . 26, No. 11
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（收稿日期：2010年9月2日）
通讯作者：唐瑜菁，泰安市迎胜东路2号泰山医学院生物科学系，邮编：271000，电话：0538-6223275，E-mail：jiaopeng196@163.com
·研究报告·
泰山白花丹参提取物对人脐血内皮祖细胞增殖、
黏附及分泌NO的影响
焦鹏1，常起2，陈彬1，杨娜娜1，唐瑜菁3，夏作理1
（1泰山医学院动脉粥样硬化研究所细胞生物学实验室，泰安 271000；2泰山医学院附属医院人事科，
泰安 271000；3泰山医学院生物科学系生物工程研究室，泰安 271000）
摘要：目的：观察单味中药泰山白花丹参提取物（SBE）对人脐血内皮祖细胞（EPCs）增殖、黏附及分泌一
氧化氮（NO）的影响。方法：采用密度梯度离心法从脐血获得单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被的培
养板上，培养7d后收集贴壁细胞，加入不同浓度SBE继续培养24h；分别采用MTT比色法、黏附能力测定实验和硝
酸还原酶法测定EPCs的增殖、黏附和分泌NO能力。结果：与对照组比较，SBE组EPCs增殖、黏附能力提高，培
养上清中NO浓度增加（P<0.05），其作用在一定范围内随SBE浓度增加而增强。 结论：白花丹参显著改善EPCs功
能，这可能是其内皮保护的新机制。
关键词：白花丹参；内皮祖细胞；增殖；黏附；一氧化氮
基金资助：山东省自然科学基金项目（No.Y2007C126），山东省教育厅基金项目（No.J06L27），泰山医学院
自然科学基金项目（No.2010ZR001）
Effects of Taishan Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract on proliferation, adhesive
activity and nitric oxide secretion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells
JIAO Peng1, CHANG Qi2, CHEN Bin1, YANG Na-na1, TANG Yu-jing3, XIA Zuo-li1
( 1Laboratory of Cell Biology, Research Institute of Arteriosclerosis, Taishan Medical College, Taian 271000, China;
2Department of Personnel, Affi liated Hospital of Taishan Medical College, Taian 271000, China; 3Institute of Bioengineering,
Department of Bioscience, Taishan Medical College, Taian 271000, China )
• 2688 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年11月第26卷第11期 CJTCMP , November 2011, Vol . 26, No. 11
泰山白花丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba）是唇形科
植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的变种，为山东特有的珍
稀濒危药用植物，主要产于山东境内，其他地区分布较少。丹
参是中医临床常用的活血化瘀药，其水溶性成分的药理作用广
泛，具有改善微循环、抗血栓、促进组织恢复、保护血管内皮细
胞等多种活性，已用于多种中成药制剂，如口服液、颗粒剂、气
雾剂、注射液、注射用灭菌粉末等[1]。内皮祖细胞（endothelial
progenitor cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，在血管内
皮损伤后的修复过程中起着重要的作用[2-3]。考虑丹参可能通
过影响EPCs而发挥其内皮保护作用，本文重点研究泰山白花丹
参对EPCs的增殖、黏附及NO释放能力的影响。
材料与方法
1. 材料与试剂 脐血取自于泰安市中心医院妇产科正常健
康产妇；白花丹参，产自泰山；EBM-2培养基购自Lonza公司；人淋
巴细胞分离液购自天津TBD公司；DiI-Ac-LDL，FITC-UEA-I购自
BTI公司；人纤维连接蛋白，PE-VEGFR-2，PE-CyTM5-CD34购自
美国BD公司；MTT购自Sigma公司；PBS购自美国Gibco公司；一氧
化氮试剂盒购自南京建成生物工程研究所；FITC-VE-cadherin购
自Bender system公司；APC-AC133购自美国eBioscience公司。
2. 药物 白花丹参，产自泰山，由山东大学博士生导师夏
作理教授鉴定。中药白花丹参提取物由泰山医学院微循环重点
实验室制备。制备过程如下：称取100g自然干燥的生药白花丹
参根，剪切成碎块，加1L双蒸水，以温水浸泡4h。文火第1次煎
1.5h，收集煮剂，再加双蒸水1L，第2、3次各煎1h，合并煎液，
200目滤网过滤，5 000r/min离心10min，收集上清液，旋转蒸发
仪蒸馏浓缩至100mL，-60℃冰冻煮剂后，冷冻干燥机干燥19h
后得到47g样品，-20℃冰箱避光储存备用。每次用时称取适当
样品，实验前用培养液（不含血清）稀释成所需浓度，0.22μm滤
膜过滤后，用于体外实验。
3. 仪器 倒置荧光显微镜（IX-71，日本OLYMPUS公司），
CO2培养箱（MCO-15AC，日本Sanyo公司），酶标仪（550型，美
国BIO-RAD公司），分光光度计（T6新世纪，北京普析通用仪
器公司），超净工作台（BCM-100，苏州净化仪器厂），图像分析
系统Lasersharp2000软件（v4.5.3，美国BIO-RAD公司）。
4. 方法
4.1 EPCs的培养 密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，
以2.5×106个/cm2接种于包被有纤维连接蛋白的培养板中，每孔
加入细胞悬液2mL，置37℃、5%CO2的培养条件下，孵箱内培养
4d，然后吸出培养液，用PBS液轻柔洗掉非贴壁细胞，换培养
液继续培养，以后每隔3d换培养液[4]。
4.2 EPCs的鉴定 培养7d后，将EPCs与DiI-Ac-LDL（2.4mg/L）
在37℃孵育1h，2%多聚甲醛固定；将FITC-UEA-I（10mg/L）滴加
于上述标本中37℃孵育1h；PBS冲洗3次，蒸馏水振洗1次；向待
检标本上滴加50%缓冲甘油封片，荧光显微镜检测。将培养第7
天细胞以0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，于两上样管中分别
加入荧光标记的抗CD133、CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2单克隆
抗体及其相应的同型对照，流式细胞仪分析内皮祖细胞CD133、
CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2表达情况。
4.3 增殖能力检测 单细胞悬液以每 孔5×10 3个细胞
100μL接种于96孔培养板中，贴壁24h后分别接入不同浓度的
无菌的SBE溶液100μL，使最终浓度分别为0.1、0.3、0.6g/L，
各组设5个重复孔，对照组加100μL无血清培养液，在37℃，
50mL/L CO2条件下继续培养24h，实验终止前加入新配制的
5g/L的MTT溶液20μL，混匀，再继续培养4h，弃去上清，每孔加
DMSO 200μL，充分振荡30min，溶解MTT沉淀物，490nm测定
每孔的吸光度A值。
4.4 黏附能力检测 用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞，
计数，然后将同等数目的EPCs接种在包被纤维连接蛋白的培养
板中，在37℃培养30min后洗去未贴壁细胞，计数贴壁细胞。
4.5 NO水平测定 将不同浓度SBE溶液加入EPCs中培养
24h，然后取各组细胞培养中的上清液，用硝酸还原酶法测定细
胞分泌NO的功能，操作步骤按NO试剂盒说明书进行。分光光
度计550nm波长测定吸光度A值，计算NO含量。
5. 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分
析。计量资料以x-±s表示，统计分析采用t检验及方差分析，
P<0.05为差异有统计学意义。
Abstract: Objective: To investigate the effects of single Chinese traditional medicine of Taishan Salvia miltiorrhiza
Bunge.f.alba extract (SBE) on proliferation, adhesive activit of endothelial progenitor cells (EPCs) and its nitric oxide (NO)
secretion. Methods: Total mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood by ficoll density gradient
centrifugation and inoculated on the human fi bro-ligandin encrusting plate. After 7 days of in vitro culture，adherent cells were
collected and incubated with SBE for 24h. The proliferation, adhesive activity and NO secretion of EPCs were assayed using
MTT, adhesion determination and nitrate reductase method, respectively. Results: EPCs incubated with SBE showed the capacities
higher than those of control in proliferation, adhesion and with a higher NO concentration in the culture supernatant. Conclusion:
Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba can improve the function of EPCs, which might be a novel mechanism of its effects in improving
vascular endothelial function.
Key words: Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba; Endothelial progenitor cells; Proliferation; Adhesive activity; Nitric oxide
Fund assistance: Natural Science Foundation of Shandong Province (No.Y2007C126), Foundation of Ministry of
Education of Shandong Province (No.J06L27), Natural Science Foundation of Taishan Medical College (No.2010ZR001)
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结果
1. EPCs的表型及鉴定 培养至第7天，倒置显微镜下观察
细胞形态学特征，见较多的梭形细胞且多个细胞团呈集落样
生长。荧光显微镜下见DiI-acLDL染色阳性细胞发红色荧光，
FITC-UEA-I染色阳性细胞发绿色荧光，二者双染阳性细胞为
正在分化的EPCs，双阳性率大于90%。与国内外文献报道一
致。流式细胞仪分析表明，表达CD133、CD34、VEGFR-2、VE-
Cadherin的细胞分别为（16.34±2.28）%、（53.58±6.98）%、
（32.28±5.42）%及（45.63±8.84）%。
2. 泰山白花丹参对人脐血EPCs增殖的影响 见表1。MTT
比色法检测SBE对人脐血EPCs增殖的影响。结果显示不同浓度
SBE溶液与EPCs共培养24h后均可使EPCs增殖能力有所增高，
与对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。
胞获取EPCs，EPCs经贴壁法培养纯化，再经过目前国内外通用
的DiI-acLDL、FITC-UEA-I染色从功能上对EPCs进行标记[8-9]。
研究结果显示，白花丹参作用于离体的EPCs，与对照组比较可
有效促进EPCs的增殖、黏附和释放NO能力，说明中药白花丹参
对内皮祖细胞具有保护作用，增强其细胞功能，其机制可能是
多方面的，可能与其减少细胞凋亡，促进分泌某些细胞因子以
及增加或减低某些酶活性等有关，这也是我们下一步实验需要
探讨的内容。
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（收稿日期：2010年9月8日）
表1 白花丹参对人脐血内皮祖细胞增殖、黏附及分泌NO
的影响（x- ±s）
组别
对照组
0.1g/L SBE组
0.3g/L SBE组
0.6g/L SBE组
吸光度（A值）
0.301±0.013
0.313±0.014*
0.351±0.024*
0.369±0.025*
黏附细胞（/s）
29.4±3.6
31.4±4.3*
33.5±7.2*
34.8±7.5*
NO（μmol/L）
21.6±1.3
25.2±1.0*
34.0±1.5*
37.3±1.4*
注：与对照组比较，*P<0.05。
3. 白花丹参对人脐血EPCs黏附能力的影响 见表1。不同
浓度SBE组与对照组相比，贴壁细胞数明显增加，差异有统计
学意义（P＜0.05）。
4. 白花丹参对人脐血EPCs分泌NO能力的影响 见表1。不
同浓度SBE组与对照组相比，NO分泌量都有所增加，差异有统
计学意义（P＜0.05）。
讨论
NO是一种血管舒张因子，是内皮细胞中L-精氨酸在eNOS
的作用下生成的一种重要的血管活性物质，具有调节血管张
力、血小板聚集、炎性细胞黏附及血管渗透性的作用，对于内
皮细胞正常生理功能的维持具有重要的意义。近年来研究进
一步表明，NO在EPCs的抗血栓形成、生长增殖和抗氧化凋亡
等方面起着重要作用，是反映EPCs功能的关键指标[5]。在动脉
粥样硬化发生发展中，NO生成减少为标志的内皮细胞功能失调/
障碍被认为是的关键性的第一步，血管内皮细胞功能失调/障碍
其特征表现为由内皮细胞产生的NO水平降低及所介导的内皮
依赖性血管舒张功能受损[6-7]。NO的含量与生物活性的变化能
够反映内皮功能的状态。
白花丹参特产于泰山、济南一带，医家一直将其视为珍品，
医学研究证明，白花丹参的药物有效成分远高于《中国药典》
中的紫花丹参。丹参具有益气活血、化瘀通络之效。动物实验
和临床研究都发现其对血管内皮具有一定的保护作用。本实验
利用EPCs贴壁生长的特点，采用直接贴壁培养人脐血单个核细