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白花丹参毛状根诱导体系的建立与其内生真菌提高毛状根中丹酚酸含量的研究



全 文 :收稿日期:2014-08-07; 修订日期:2015-01-08
基金项目:国家自然科学基金(No. 81173489);
山东省自然科学基金(No. ZR2010CM063);
中国博士后科学基金项目(No. 20110490051)
作者简介:陶 如(1980-),女(汉族),山东泰安人,泰山医学院讲师,硕士
学位,主要从事中药活性成分分析工作.
* 通讯作者简介:郝岗平(1970-),男(汉族),山西临县人,泰山医学院教
授,硕士研究生导师,博士学位,主要从事中药生物技术的研究工作.
白花丹参毛状根诱导体系的建立
与其内生真菌提高毛状根中丹酚酸含量的研究
陶 如1,冯 蕾1,赵法兴2,李艳玲1,冀海伟1,郝岗平1*
(1. 泰山医学院,山东 泰安 271000; 2. 江西中医药高等专科学校,江西 抚州 344000)
摘要:目的 建立白花丹参毛状根诱导体系及检测其丹酚酸的合成,研究内生真菌对毛状根中丹酚酸生物合成的影响。
方法 通过发根农杆菌 ACCC10060 浸染白花丹参叶片,成功诱导出毛状根,毛状根在 6,7 - V 液体培养基中扩大培养 60
d,并测定毛状根中丹酚酸的含量。白花丹参毛状根在 6,7 - V培养基中培养 12 d后,添加从白花丹参分离的不同浓度的
内生真菌诱导子,测定毛状根丹酚酸含量。结果 发根农杆菌 ACCC10060 能够成功从白花丹参叶片诱导出毛状根,毛状
根培养 40 d和 50 d时丹酚酸 B和丹参素的最高产量可达 9. 38mg·g -1 DW 和 1. 281 mg·g -1 DW。60 (μg glc equ).
ml - 1内生真菌诱导子是促进丹酚酸合成的最佳浓度,内生真菌处理后 30 d 后,丹酚酸 B 和丹参素的产量分别增加 1. 55
和 2. 68 倍。结论 白花丹参毛状根诱导培养可以做为一种生产丹酚酸的有效途径,60 (μg glc equ)·ml -1内生真菌诱导
子可以显著提高毛状根中丹酚酸含量。
关键词:白花丹参; 毛状根诱导; 丹酚酸 B; 丹参素; 内生真菌
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2015. 06. 078
中图分类号:R284. 2;S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)06-1469-04
Hairy root induction of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba and fungal endophytes enhanced
salvianolic acid contents in hairy root cultures
TAO Ru1,FENG Lei1,ZHAO Fa-xing2,LI Yang-ling1,Ji Hai-wei1,HAO Gang-ping1*
(1. Taishan Medical University,Taian 271000,China;2. Jiangxi College of Traditional Chinese Medical,
Fuzhou 344000,China)
Abstract:Objective To establish hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba and test the salvianolic acid production of
these cultures,and investigate the influence of fungal endophytes on the synthesis of salvianolic acid in hairy root culture of Salvia
miltiorrhiza Bge. f. alba. Methods To induce hairy root of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba,leaf explants were infected with
Agrobacterium rhizogenes ACCC10060. Hairy roots were cultured in 6,7 - V liquid medium for 60d and tested the salvianolic acid
production of these cultures. To investigate the influence of fungal endophytes on the synthesis of salvianolic acid in hairy root cul-
ture of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba,various concentrations of fungal endophytes isolated from Salvia miltiorrhiza Bge were add-
ed to the hairy root cultures grown for 12 d. After cultured for 30d,salvianolic acids content were tested. Results Hairy root cul-
tures of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba were successfully established by infecting leaf explants with Agrobacterium rhizogenes AC-
CC10060. Hairy roots were cultured in 6,7 - V liquid medium and Salvianolic acid B and Salvianic acid A were detected in hairy
root cultures. After culture for 40d and 50d,maximum production of Salvianolic acid B and Salvianic acid A (9. 38 mg. g -1 DW
and 1. 281 mg·g -1 DW respectively)were respectively attained. Salvianolic acid B and Salvianic acid A contents increased 1. 55
and 2. 68 times respectively after 60 (μg glc equ). mL -1 fungal endophytes elicitor treated for 30 d. Conclusion Hairy root cul-
ture of Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba is a valuable alternative approach for the production of salvianolic acid,60 (μg glc equ).
mL -1 fungal endophytes elicitor is the optimal concentration for salvianolic acid production.
Key words:Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba; Hairy root; Salvianolic acid B; Salvianic acid A; Fungal endophytes
植物次生代谢产物具有较高的经济价值,但是在植物中的合
成量比较低。早期人们探讨了通过培养植物细胞来生产有用的、
具有复杂结构的次生代谢物,但是产量很有限,不能满足需要。
发根农杆菌转化植物外植体细胞诱导可以毛状根生成。毛
状根培养有很多优点,包括生化和遗传性状的稳定性高、对季节
和地理化境的依赖性低、生长速度快,与自然生长植物相比具有
更高的次生代谢物水平等。因此,利用该方法生产的植物次生代
谢产物已被广泛应用于医药、化妆品、食品等多种行业 [1,2]。
次生代谢产物的合成是植物应对环境胁迫和病原体攻击的
一种防御方式。通过植物细胞悬浮培养提高次生代谢物产量的
策略就是基于这个机制[3]。能够刺激次生代谢途径的生物分子
或非生物分子称之为诱导子[4]。在细胞培养中,诱导子是加强
次生代谢合成的最有效的方法。诱导子种类很多,比如,真菌诱
导子、苯甲酸、茉莉酸甲酯、花生四烯酸等,都能诱导次生代谢产
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 6 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期
物的合成[5]。
植物内生真菌是最常见的和高度多样化的微生物,生活在植
物组织中,但通常不引起植物病害。内生真菌通常被认为是植物
的依生生物,如内生真菌通过产生生物碱之类的毒枝菌素减少食
草动物对植物的破坏[6]。内生真菌作为植物的一种共生体在全
部阶段或者某一阶段生活在健康植物组织中。内生真菌和植物
宿主之间的生态关系非常复杂。内生真菌在植物中作为共生体
可以产生一些保护性物质(抗真菌类物质、抗菌类物质),这些物
质可以杀死或者抑制病原体进入植物组织[7]。同时,植物宿主
也会给内生菌提供营养素,因此,内生菌在植物生长发育相关的
抗胁迫次生代谢途径中发挥重要的作用。有研究报道肉汤培养
基中的内生真菌(镰孢菌属)可以刺激悬浮培养的红豆杉细胞合
成紫杉烷类物质并累积[8]。我们前期的研究也证明内生真菌处
理银杏悬浮细胞可以诱导类黄酮的累积[9]。真菌诱导子还可以
诱导喜树悬浮细胞中喜树碱的累积[10]。内生真菌可以诱导大戟
悬浮细胞的 NO和 SA含量的增加[11]。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)是临床常用的一种重要中草
药,有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效[12,13]。白花丹参
(Salvia miltiorrhiza Bge. f. alba C. Y. WU et H. W. Li)是紫花丹
参的变型,已作为一个新品种被收录进《山东省中药材标准》
(2000 年版)[14]。白花丹参除具丹参的生物活性和用途外,对治
疗血栓性脉管炎具有独特疗效[15]。白花丹参与丹参的化学成分
基本相同,含有脂溶性成分丹参酮类和水溶性成分酚酸类物
质[15],可以作为丹参的替代品。因此,白花丹参也具有重要的医
药和经济价值。
我们前期工作已从白花丹参中分离出 53 种内生真菌,并分
析了这些真菌的代谢产物。从白花丹参根部分离的内生真菌
BDG1 - 2 - 1 可以产生丹酚酸类物质[16]。关于白花丹参毛状根
的诱导以及毛状根中丹酚酸生成的研究,目前尚未有报道。本研
究利用发根农杆菌 ACCC10060 成功从白花丹参叶片诱导出毛状
根,并研究了内生真菌 BDG1 - 2 - 1 作为诱导子对毛状根丹酚酸
生物合成的影响。
1 材料和方法
1. 1 植物材料 白花丹参种子收集于泰山医学院中药试验田,
4℃保存备用。种子萌芽率超过 80%。
1. 2 白花丹参种子的消毒及发芽处理 白花丹参种子用 70%的
乙醇消毒处理种子 1min,4% 的次氯酸钠液处理 10 min,无菌水
漂洗 3 次。每 20 颗种子一组接种至 25ml 琼脂固体 MS 培养基
上。接种后培养基置于 25℃标准条件下培养箱内培养至发芽,
光照周期为 16 h 光 / 8 h 黑暗周期[白色日光灯管以 35μmol /
(m2 /s)辐射]。
1. 3 农杆菌活化 从 - 70℃冰箱取出甘油封存的菌种 AC-
CC10060,接种在 YEP液体培养基中,28℃、180 r /min,震荡培养,
活化细菌;再按 1 /100 接种量二次活化农杆菌,28℃震荡培养至
OD600 = 0. 5 左右;将二次活化的菌液转移到无菌离心管中,
3000r /min,离心 8min,上清倒掉,用等体积 MS 液体培养基重悬
菌体沉淀,用于下一步的侵染。
1. 4 白花丹参毛状根诱导及毛状根培养 选取六叶片的白花丹
参嫩叶片,将叶片剪成 0. 5cm2 的小块,并用刀子划伤叶片表面,
以背面向上的方式将叶片置于 MS 固体培养基上,于 25℃、16h
光照 /8h黑暗条件下预培养 2 d。将预培养的丹参叶片放入上述
MS重悬菌液中侵染 10min,然后将叶片用无菌镊子取出放置在
无菌滤纸上,吸干叶片表面的菌液,在重新将叶片放入 400μg /ml
头孢噻肟(Cef),30g /L 蔗糖,8g /L 琼脂的无激素 MS 培养基内,
黑暗中共培养 2 d。将共培养后的外植体用无菌水漂洗至无混
浊,再在添加 400mg /L cef的无菌水中浸泡 15min左右,然后移至
含有 400mg /L cef的MS固体培养基,于黑暗中进行除菌。2 周左
右可以看到大量的毛状根从被侵染的叶片伤口部位长出。从外
植体上分离毛状根,依次转移至含有不同浓度 cef 的 MS 固体培
养基中(cef浓度从 400mg /L到 350,300,200,100,50mg /L逐渐
降低)。如此经过多次转移培养后获得大量的毛状根。选择生
长迅速,长 2. 0 ~ 3. 0cm的毛状根分离出来转移至 30ml含 30g /ml
蔗糖的 6,7 - V液体培养基内,25℃,100 r /min 摇床培养。60 天
之内每隔 10 天回收毛状根测定干重并测定丹酚酸的含量。
1. 5 内生真菌 BDG1 - 2 - 1 诱导子制备及诱导子对白花丹参毛
状根的处理 内生真菌 BDG1 - 2 - 1 从白花丹参根部分离并在实
验室保存培养[16]。将 BDG1 - 2 - 1 接种于马铃薯 /葡萄糖 /琼脂
(PDA)平板上活化,26℃培养 7d。从培养 7d 的马铃薯 /葡萄糖 /
琼脂(PDA)培养基转移 2 cm3大小的方块到 150ml 的 PDA 液体
培养基,120 r /min,25°C,黑暗培养 7 d。过滤收集菌丝,备用。诱
导子制备方法参照文献[17]。硫酸 -蒽酮法测总糖含量,用总
糖标定其浓度,冷冻保存。不同浓度的真菌诱导子加入到 12d 龄
的成熟白花丹参毛状根中,处理 20d 和 30d 后,分别测定白花丹
参毛状根的干重和丹酚酸含量。
1. 6 丹参毛状根干重的测定 将收获的丹参毛状根用蒸馏水冲
洗 3 遍,用滤纸吸干多余的水分,放入 45°C 的烘箱中烘至质量
恒定,测定其干重。
1. 7 丹酚酸 HPLC分析样品的制备和测定 取干重 1g 的丹参毛
状根样品,研钵研磨成粉状,加 20ml 水溶解,回流 1. 5h,滤纸过
滤。滤液保存在 4℃。高效液相色谱法分析样品中丹酚酸含量,
Beckman Ultrasphere C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm),柱温 30°C,
流速设置 1. 0ml /min。上样量 20μl,流动相 A(甲醇)∶ B(0. 5%
乙酸)0 ~ 5min A∶ B = 20%:80%。15 ~ 30min A∶ B = 43% ∶
57%。40min A∶ B = 80% ∶ 20%,波长 286nm。外标法定量,通
过与标准丹酚酸 B和丹参素曲线比对保留时间和波形确定丹酚
酸的含量。
1. 8 统计分析 每一个测定结果重复 3 次,SigmaPlot软件求平均
值。差异显著性分析采用 ANOVA方法。
2 结果
2. 1 白花丹参毛状根的诱导及培养 通过发根农杆菌 AC-
CC10060 浸染白花丹参叶片、茎和叶柄,诱导毛状根,用于生产丹
酚酸。发根农杆菌 ACCC10060 浸染白花丹参外植体,共培养 2
天后,将外植体转入含有 400mg·L -1头孢噻肟(Cef)的 MS 固体
培养基进行除菌培养。15 d左右看到在外植体被侵染的伤口边
缘有毛状根长出。
研究结果(表 1)表明,以 ACCC10060 菌株作为试验菌株,外
植体类型对白花丹参毛状根的诱导率存在着一定的影响。3 种
外植体的诱导率之间的方差分析结果显示,3 种外植体对丹参毛
状根的诱导能力存在着极其显著的影响。毛状根诱导能力的大
小顺序依次是:叶片 >茎段 >叶柄。叶柄在除菌培养基中褐化的
最严重,茎段其次,叶片相对最好。并且叶片外植体诱导出的毛
状根的生长速度比较快。选择叶片作为最佳外植体进行毛状根
诱导(图 1)。
将长至 2 ~ 3cm 的毛状根从外植体组织分离转移到新的
400mg /L头孢噻肟(Cef)的 MS 固体培养基,每隔 7 天更换一次
培养基(Cef的浓度逐渐降低),反复继代培养 6 ~ 7 次,毛状根开
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始快速生长。据报道,无论是毛状根的生长速度还是次生物质的
产量,6,7 - V液体培养基都优于 MS,B5 和WPM培养基[18]。因
此,将除菌后的毛状根克隆转移至 6,7 - V 液体培养基内扩大培
养,生长态势良好见图 1。
表 1 不同外植体对白花丹参毛状根的诱导率的影响 %
外植体 培养 8d 培养 16d 培养 24d
叶片 0. 09 ± 0. 012 0. 564 ± 0. 121a 0. 726 ± 0. 134a
茎段 0 0. 357 ± 0. 143b 0. 624 ± 0. 128b
叶柄 0 0. 287 ± 0. 091b 0. 479 ± 0. 112c
a、b、c不同的字母表示差异显著(P < 0. 05)
A:毛状根被侵染的外植体边缘有长出;
B:发根农杆菌侵染 20 天后,毛状根生长良好;
C:毛状根生长迅速;
D ~ F:毛状根在不含植物激素的液体培养基中的生长情况
(D:10 天;E:20 天;F:30 天)
图 1 白花丹参毛状根的诱导及培养
2. 2 白花丹参毛状根培养产生丹酚酸 毛状根在 6,7 - V 液体
培养基中培养 60d。每隔 10 天回收毛状根测定丹酚酸产量(图
3)。我们前期的研究结果表明,白花丹参根部和叶片的丹酚酸
成分以丹酚酸 B和丹参素为主。因此我们主要测定白花丹参毛
状根中丹酚酸 B和丹参素的含量(图 2)。在 HPLC图谱中,丹参
素的保留时间为 11. 96 min,丹酚酸 B 的保留时间为 20. 86 min
(图 2)。所以此色谱条件可以很好的分离丹酚酸 B 和丹参素。
60d的培养期中,丹酚酸 B 和丹参素的含量显著升高,丹酚酸 B
在第 40 天时达最高值,为 9. 38 mg·g -1 DW,丹参素的含量第 50
天时达最高值 1. 281 mg·g -1 DW。见图 3。
图 2 HPLC测定白花丹参毛状根中丹酚酸 B和丹参素含量
2. 3 内生真菌诱导子对白花丹参毛状根生长速度和丹酚酸产
量的影响 前期实验我们从白花丹参根部分离到内生真菌 BDG1
- 2 - 1[16],为了研究内生真菌 BDG1 - 2 - 1 对白花丹参毛状根
生长速度和丹酚酸产量的影响,将不同浓度的内生真菌诱导子接
种到预培养 12 天的毛状根中,培养 20d后分别测定毛状根干重。
结果显示,20(μg glc equ)·ml -1的真菌诱导子对毛状根的生长
没有明显影响,40,60,80 和 100 (μg glc equ)·ml -1真菌诱导子
处理的毛状根比对照组分别降低了 16. 2%、28. 6 %、43. 28%和
45. 3%,方差分析结果显示,40,60,80 和 100 (μg glc equ). ml - 1
真菌诱导子的添加对丹参毛状根生长具有显著性影响(P <
0. 05)。见图 4。
图 3 白花丹参毛状根培养时间与丹酚酸含量水平关系
图 4 不同浓度的真菌诱导子对白花丹参毛状根生长的影响
研究结果也表明内生真菌 BDG1 - 2 - 1 诱导子可以提高白
花丹参毛状根丹酚酸 B和丹参素的含量。不同浓度的真菌诱导
子处理毛状根 30d后,测定丹酚酸 B 和丹参素的含量,结果显示
低于 60(μg glc equ). ml - 1真菌诱导子浓度时,丹酚酸 B 和丹参
素的含量随着诱导子浓度的升高而提高;真菌诱导子浓度为 60
(μg glc equ). ml - 1时,丹酚酸 B 和丹参素的含量达到最高为
14. 21 mg·g -1 DW和 3. 28 mg·g -1 DW,分别比对照提高了1. 55
和 2. 68 倍。真菌诱导子浓度高于 60 (μg glc equ). ml - 1,丹酚酸
B和丹参素的含量下降,因此真菌诱导子的最佳浓度是 60 (μg
glc equ). ml - 1。方差分析结果显示,不同浓度真菌诱导子的添
加对丹参毛状根中丹酚酸 B和丹参素含量具有显著性影响(P <
0. 05)。见图 5。
图 5 不同浓度的真菌诱导子对白花丹参毛状根丹酚酸含量的影响
3 讨论
发根农杆菌是一种土壤传播的植物病菌,可以感染植物的受
伤部位,诱发产生毛状根,也可以导致植物生化代谢的改变。发
根农杆菌诱导毛状根的产生已被应用到多种植物[19]。毛状根独
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有的特性促进了其在植物生物技术中的应用。另外,毛状根生长
速度快,遗传和生化性质稳定,这些特点使得毛状根培育技术成
为取代植物细胞悬浮培养技术生产次生代谢产物的新途径。通
过培育毛状根生产酚酸成分在一些植物中已有研究,比如苦荞
(荞麦属)[20]、鼠尾草[21]、丁香罗勒[22]、毒莴苣[23]、荞麦[24]和藿
香[25]等植物。
本研究中我们首次建立了一种有效的发根农杆菌介导的白
花丹参毛状根诱导培养体系,研究结果表明,叶片比茎和叶柄更
有利于毛状根的诱导生长(表 1),并且叶片外植体诱导出的毛状
根的生长速度比较快,与文献中报道的荆芥的毛状根诱导情况相
似[26]。总之,我们应用农杆菌 ACCC10060 成功诱导出白花丹参
毛状根,并在 6,7 - V培养基中培养的毛状根中检测到生药丹参
的主要成分丹酚酸 B和丹参素(图 1,2),且丹酚酸 B和丹参素的
含量分别在培养 40 d 和 50 d 时达最高值(图 3)。这些结果表
明,白花丹参毛状根培养体系是一种很有价值的生产丹酚酸的生
物技术。
多种诱导子已应用到提高植物次生代谢物含量的研究中。
诱导现象是一种可被外界小剂量诱导子诱导并促进细胞启动或
者加强次生代谢成分生物合成的一种生物过程。诱导子(elici-
tor)最初是指那些可以诱导植物细胞产生和积累植保素的化学
物质[27],后来发现诱导子能快速、专一和选择性地诱导植物多种
特定基因的表达,尤其是活化特定的次生代谢途径,积累次生代
谢产物[28]。诱导子可以分为生物诱导子和非生物诱导子,也可
以分为内生诱导子和体外诱导子。诱导子可来源于植物、真菌、
细菌等多种生物[29]。
内生菌是指存在于寄主植物组织中,不引起植物病害的微生
物。它们可以产生活性物质提升寄主植物的抗病性,增强植物的
防御能力,或者刺激植物生长。真菌可以作为诱导子引发植物细
胞的多种反应,包括一些次生代谢物的合成[30]。有研究报道,内
生菌产生的活性物质不仅可以激活紫衫悬浮细胞合成紫杉醇,还
可以刺激细胞的生长[8]。诱导子在诱导次生代谢合成的同时也
可以下调初生代谢。诱导子促进细胞次生代谢产物的累积和细
胞生物量积累之间呈负相关,但是,细胞生物量积累过低也不会
有助于次生代谢产物的累积。茉莉酮酸酯衍生物在抑制紫杉醇
细胞 15%左右的生长速度时可有效促进紫杉醇的生物合成 [31]。
由此看来,诱导子的最佳作用剂量可以刺激紫杉醇产量达到最
高,但是,剂量过高会对细胞的生物合成途径产生毒性效应。因
此,优化诱导子的作用剂量才能最大程度的发挥其诱导紫杉醇生
物合成的作用。本研究表明,内生真菌诱导子的最佳作用剂量是
60 (μg glc equ)·ml -1(图 4 ~ 5),使丹酚酸 B 和丹参素的产量
分别增加 1. 55 和 2. 68 倍,但是毛状根的生长速度被抑制了
28. 6%。这与已经报道的紫杉醇产量与内生菌真菌作用计量之
间的关系是相似的[8,32]。
总之,内生真菌引发的植物细胞内次生代谢物合成的信号转
导机制尚不明确。目前,我们认为,真菌诱导子作为细胞外的信
息分子辨认并结合植物细胞壁上特定的受体,刺激细胞内产生特
定细胞内信息分子,通过特定信号转导途径调控细胞核内的基因
表达[32,33],最后,激活次生代谢途径合成次生代谢物。植物细胞
通过多种信号分子和信号转导途径接受和传递真菌感染等生物
胁迫[34],信号分子和信号转导途径之间的关系还需要进一步深
入研究。
参考文献:
[1] Giri A,Narasu M L. Transgenic hairy roots:recent trends and applica-
tions[J]. Biotechnol,Adv,2000,18(1):1.
[2] Yang Y K,Lee S Y,Park W T,Park N I & Park S U. Exogenous aux-
ins and polyamines enhance growth and rosmarinic acid production in
hairy root cultures of Nepeta cataria L[J]. POJ,2011,3:190.
[3] Zhao J,Davis L C,Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to
production of plant secondary metabolites[J]. Biotechnol,Adv,2005,
23(4) :283.
[4] Drnenburg H,Knorr D. Strategies for the improvement of secondary me-
tabolite production in plant cell cultures[J]. Enzyme Microbiol Techn-
ol,1995,17(8) :674.
[5] Yukimune Y,Tabata H,Higashi Y et al. Methyl jasmonate - induced
over - production of paclitaxel and baccatin III in taxus cell suspension
cultures[J]. Nat,Biotechnol,1996,14(9) :1129.
[6] Faeth S H Fagan W F. Fungal endophytes:eommon host plant symbi-
onts but uncommon mutualists[J]. Integr Comp Biol,2002,42:360.
[7] Strobel G A,Torczynski R,Bollon A. Acremonium sp. - a leucinosta-
tin A producing endophyte of European yew (Taxus baccata) [J].
Plant Sci,1997,128:97.
[8] Li Y C,Tao W Y. Interactions of Taxol - producing endophytic fungus
with its host (Taxus spp.)during Taxol accumulation[J]. Cell Biol
Int,2009,33(1) :106.
[9] Hao G P,Du X H,Zhao F X,et al. Fungal endophytes - induced ab-
scisic acid is required for flavonoid accumulation in suspension cells of
Ginkgo biloba[J]. Biotechnol Lett,2010,32:305.
[10] Lu D,Dong J,Jin H,et al. Nitrate reductase - mediated nitric oxide
generation is essential for fungal elicitor - induced camptothecin accu-
mulation of Camptotheca acuminata suspension cell cultures[J]. Appl
Microbiol Biotechnol,2011,90(3) :1073.
[11] Gao F K,Ren C G,Dai C C. Signaling effects of nitric oxide,salicylic
acid,and reactive oxygen species on isoeuphpekinensin accumulation in
Euphorbia pekinensis suspension cells induced by an endophytic fungal
elicitor[J]. J Plant Growth Regul,2012,31(4) :490.
[12] Chen A J,Li C H,Gao W H,et al. Application of non - aqueous mi-
cellar electrokinetic chromatography to the analysis of active components
in Radix Salvia miltiorrhiza and its medicinal preparations [J]. J
Pharm Biomed Anal,2005,37(4) :811.
[13] Wu J Y,Shi M. Ultrahigh diterpenoid tanshinone production through re-
peated osmotic stress and elicitor stimulation in fedbatch culture of Sal-
via miltiorrhiza hairy roots[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2007,78
(3) :441.
[14] 郝岗平,边高鹏,张媛英. 泰山白花丹参干叶片高质量 DNA的提取
[J]. 中草药,2006,37(6):855.
[15] 王培军,高长请,李 蜜. 丹参与白花丹参中丹参酮 ILA 的含量研
究[J]. 甘肃中医,2004,17(4):42.
[16] 李艳玲,史仁玖,王健美,等. 泰山产丹参内生真菌的分离鉴定和
多样性分析[J]. 时珍国医国药,2012,23(1):114.
[17] Zhang C H,Mei X G Liu L,et al. Enhanced paclitaxel production in-
duced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Tax-
us chinensis[J]. Biotechnol Lett,2000,22(19) :1561.
[18] Chen H,Chena F,Chiu F C,et al. The effect of yeast elicitor on the
growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltior-
rhiza[J]. Enzyme,Microb,Technol,2001,28(1) :100.
[19] Georgiev M I,Pavlov A I,Bley T. Hairy root type plant in vitro systems
as sources of bioactive substances[J]. Appl Microbiol Biotechnol,
2007,74(6) :1175.
[20] Kim Y K,Li X H ,Xu H,et al. Production of phenolic compounds in
hairy root culture of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn)
·2741·
时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 6
[J]. J Crop Sci Biotechnol,2009,12(1):53.
[21] Grzegorczyk I,Krolicka A & Wysokinska H. Establishment of Salvia
officinalis L. hairy root cultures for the production of rosmarinic acid
[J]. Z Naturforsch C,2006,61(5) :351.
[22] Tada H,Murakami Y,Omoto T,et al. Rosmarinic acid and related
phenolics in hairy root cultures of Ocimum basilicum[J]. Phytochem-
istry,1996,42(2) :431.
[23] Stojakowska A,Malarz J,Szewczyk A,et al. Caffeic acid derivatives
from a hairy root culture of Lactuca virosa[J]. Acta Physiol Plant,
2012,34(1) :291.
[24] Uddin M R,Li X,Won O J,et al. Herbicidal activity of phenolic
compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum[J]. Weed
Res,2011,52(1) :25.
[25] Lee S Y,Xu H,Kim Y K,et al. Rosmarinic acid production in hairy
root cultures of Agastache rugosa Kuntze[J]. World J Microbiol Bio-
technol,2008,24:969.
[26] Lee S Y,Lee C Y,Eom S H,et al. Rosmarinic acid production from
transformed root cultures of Nepeta cataria L [J]. Sci Res Essays,
2010,5(10) :1122.
[27] Smith C J. Accumulation of phytoalexins:defence mechanism and stim-
ulus response system[J]. Plamt Sci,1996,132(1) :1.
[28] Hahn M G. Microbial elicitors and their receptors in plants[J]. Ann
Rev Phytopathol,1996,34:387.
[29] Namdeo A G. Plant Cell Elicitation for Production of Secondary Metab-
olites:A Review[J]. Phcog Rev,2007,1:69.
[30] Modafar C E,Tantaoui A & Boustani E S E. Differential induction of
phenylalanine ammonia - lyase activity in date palm roots in response to
inoculation with Fusarium oxysporum f. sp. Albedinis and to elicitation
with fungal wall elicitor[J]. Plant Physiol,2001,158:715.
[31] Zhao Z J,Xu Y F,Qian Z G,et al. Novel fluoro - and hydroxyl -
containing jasmonate derivatives as highly efficient elicitors in suspen-
sion cultures of Taxus chinensis[J]. Bioorg Med Chem Lett,2004,14
(18) :4755.
[32] Wang C G,Wu J Y & Mei X G. Enhancement of taxol production and
excretion in Taxus chinensis cell culture by fungal elicitation and medi-
um renewal[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2001,55(4) :404.
[33] Nu ¨ rnberger T,Colling C,et al. Perception and transduction of an
elicitor signal in cultured parsley cells[J]. Biochem Soc Symp,1994,
60:173.
[34] Ligterink W,Kroj T ,Zur Nieden U,et al. Receptor - mediated activa-
tion of a MAP kinase in pathogen defense of plants [J]. Science,
1997,276(5321) :2054.
收稿日期:2014-09-24; 修订日期:2015-02-28
基金项目:海南省自然科学基金(No. 814291);
海南医学院引进人才科研启动经费;
海南医学院药学院大学生创新课题(No. Hyydc2013004)
作者简介:高炳淼(1982-),男(汉族),安徽明光人,海南医学院讲师,博士
学位,主要从事南药与生物技术研究工作.
* 通讯作者简介:张俊清(1964-),女(汉族),内蒙古呼和浩特人,海南医
学院教授,博士学位,主要从事南药资源开发与研究工作.
南药益智废弃物综合利用现状与分析
高炳淼,魏 娜,王 勇,李永辉,田建平,谭银丰,钟 霞,张俊清*
(海南医学院 海南省热带药用植物研究开发重点实验室,海南 海口 571199)
摘要:益智为海南道地药材之一,也是我国四大南药之一,主要用于脾寒泻泄、腹中冷痛、口多唾涎、肾虚遗尿、小便频
数、遗精白浊等。益智的主要药用部位是利用其干燥成熟果实种子益智仁,采摘后的益智叶和根茎,以及在加工过程中
产生的益智果肉和果壳等都作为废弃物。阐述和分析益智的叶、根茎和果壳等非药用部位的主要活性物质,为在采收以
及加工过程中产生的益智废弃物资源的综合利用提供理论依据。最后探讨了南药益智废弃物在综合利用方面存在的一
些问题,并提出相应的发展对策。
关键词:南药; 益智; 废弃物; 综合利用
DOI标识:doi:10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2015. 06. 079
中图分类号:R2 -03 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)06-1473-03
益智 Alpinia oxyphylla Miq.为姜科山姜属植物,其干燥成熟
果实为常用中药益智仁(Fructus Alpinae Oxyphyllae),为海南道地
药材之一,也是我国四大南药之一,具暖肾固精缩尿、温脾止泻摄
唾之功效。我国益智在海南岛野生资源丰富,现普遍为人工栽
培,主要分布于海南、广东、广西等省区,福建、云南等地也见栽
培。其中海南是益智仁的主要产区,产量占总产量的 95% 以
上[1,2]。益智主要用途在《本草拾遗》《唐本草》《本草纲目》中均
有记载,如《局方》益智散、《世医得效方》三仙丸、《魏氏家藏方》
固真丹等均以益智为主要组成药材。现代研究也表明益智仁有
强心、降血压、抗癌、抗溃疡、抗菌、镇痛等作用[3,4]。益智是中国
卫生部公布的既是食品又是药品的天然物之一,是一种安全性较
高的药食同源植物资源,预示益智将不仅在药品领域的功能,还
在食品和保健品领域也具有广泛的应用前景。如海南民间常以
盐水腌渍益智鲜果后食用,可起到治胀气、腹痛,助消化作用。
目前,关于益智植物资源的利用仍以其成熟果实益智仁应用
于中医临床为主,年利用量达到 5000 吨左右。益智为多年生草
本植物,在采收益智果实六到七年后,其结果能力一般会下降,药
农会将其地下尚存大量丰富的益智根茎与整个植株被一同废弃,
存在益智根茎和叶的资源未充分利用的现状。另外,在益智仁炮
制过程中产生大量的益智果壳作为益智药用植物的废弃物被丢
弃,造成资源浪费[5]。
1 益智仁采收过程中产生的废弃物
2010 版《中国药典》记载中药益智的药用部位为果实,由于
益智为姜科植物,与其他使用地下根茎的高良姜等一样具有大量
丰富的根茎,但根茎和植株叶片都作为废弃物,存在益智根茎和
叶片资源浪费的现状。因此,有必要了解和掌握益智叶片和根茎
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2015 VOL. 26 NO. 6 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期