全 文 ：J. of Chine seM icro circu la tion Dec. 2006, Vo.l 10, No. 6
基金项目:山东省自然科学基金(Z2002C 04)
作者单位:271000　山东泰安 ,泰山医学院脑微循环研究所(蔡
洪信 ,夏作理);山东省临沂市人民医院神经内科(王贤军)
第一作者简介:蔡洪信(1973-),男 ,山东泰安人 ,主治医师 ,在读
硕士。主要从事脑缺血保护的研究。
文章编号:1007-8568(2006)06-0402-04 实验研究
白花丹参对小鼠局灶性脑梗死 ICAM-1
表达及白细胞浸润的影响
蔡洪信 ,王贤军 ,夏作理
【摘要】　目的　探讨白花丹参水提取物预处理对局灶性脑梗死细胞间黏附分子-1( ICAM-1)表达
及白细胞浸润的影响。方法　小鼠随机分为假手术组 、脑梗死组 、白花丹参组 ,采用光化学法诱导小鼠
局灶性脑梗死模型 , 免疫组化和 ELISA法检测梗死侧皮层 ICAM-1的表达变化 , 比色法检测梗死侧皮层
髓过氧化物酶(MPO)的活性变化 , 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法测定梗死体积。结果　假手
术组 ICAM-1表达低 , 各时间点无差异(P >0. 05)。脑梗死组 ICAM-1表达于梗死后 3 h开始升高 , 12 h
达高峰 , 24 h开始下降。与脑梗死组相应时间点比较 , 白花丹参组于梗死后 3、6、12和 24 h ICAM-1的
表达均降低(P <0. 05)。M PO的活性变化规律基本同 ICAM-1的表达变化。与脑梗死组比较 , 白花丹
参组梗死体积明显缩小(P <0. 01)。结论　白花丹参水提取物预处理对小鼠局灶性脑梗死有保护作
用 , 其机制之一可能是降低梗死侧皮层 ICAM-1的表达 , 减少中性粒细胞的浸润。
【关键词】　白花丹参;细胞间黏附分子-1;髓过氧化物酶;局灶性;脑梗死
中图分类号:R743　　　　文献标识码:B
Effec ts of SalviaM iltiorrh iza Beg. f. a lba on the Expression of ICAM-1 and the Neu troph il In fil-
tration in Foca l Cerebral In farction in M ice
CAIHong-xin ,WANGX ian-Jun, X IA Zuo-li. Institute of Cerebral M icrocirculatin , Med ica l College of
Taishan, Ta ian 271000, Ch ina;D epartm ent of Neurology, People’ s Hospita l of Liny i, Liny i 276000, China
【Abstract】　Object ive　To observe the effec ts o f sa lv iam iltio rrhiza beg. .f a lba on the expression o f in-
terce llular adhesion m o lecule-1牗ICAM-1牘and the neu trophil infiltra tion in foca l ce rebra l infarction in m ice.
M ethods　M icew ere random ly div ided into three groups牶sham group牞 ce rebral infarction g roup牞 sa lv ia m ilti-
o rrhiza beg. .f a lba g roup. The mode l of foca l cerebral infarction w as estab lished based on the principle o f pho-
tochem ica l initia tion o f thrombosis牞expression o f ICAM-1 and the mye loperox idase牗MPO牘ac tivity o f the infa rc t
co rtex牞and the infarct vo lum e w ere mea sured. R esults　 In sham g roup牞 ICAM-1 expre ssed low. In ce reb ra l
infarction g roup牞 the expression o f ICAM-1 e leva ted in turn from 3 hou rs to 12 hours牞decrea sed a t 24 hours牞
highe r牗P <0. 05牘 than that in sham g roup at corre sponding time. In sa lv iam iltio rrhiza beg. .f a lba g roup牞from
3 hours to 24 hours牞 ICAM-1 expressed lowe r牗P <0. 05牘 than that in cereb ra l infa rc tion group at corre sponding
tim e. TheMPO activ ity showed sim ilar patte rn like the ICAM-1 expression. In salvia m iltio rrhiza beg. .f a lba
g roup牞 the infa rc t vo lum e is low e r牗P <0. 01牘 than tha t in cereb ra l infa rc tion group. Conc lu sion　Sa lv iam ilti-
o rrhiza beg. .f a lba pre trea tm ent has protective effects on foca l cerebra l in fa rc tion in m ice. One o f the m echa-
nism s may be re lated to depressing the exp ression of ICAM-1 and the neutroph il infiltra tion in the infarct co rtex.
【Key words】　Salv ia m iltiorrh iza beg. .f alba牷In te rce llu la r adhesion m o lecule-1牷M ye loperox idase牷Fo-
ca l牷C erebral infa rc tion
　　大量证据表明 ,急性炎症反应在脑缺血及脑缺 血再灌注损伤中起着重要作用。脑缺血和再灌注
早期产生的黏附分子 、细胞因子及中性粒细胞聚集
构成了炎症反应的基础。细胞间黏附分子-1( inter-
cellular adhesionmo lecule 1, ICAM-1)是最重要的白
细胞-内皮细胞间黏附分子之一 ,其介导白细胞与血
管内皮细胞之间的黏附以及白细胞穿出血管壁向
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中国微循环 2006年 12月第 10卷第 6期　
缺血脑组织浸润 ,并引起周围组织的炎症反应 。髓
过氧化物酶 (MPO)位于中性粒细胞嗜天青颗粒中 ,
其活性是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的可
靠指标 。因此 ,本研究采用光化学法诱导小鼠局灶
性脑梗死模型 ,选择 ICAM-1、MPO、梗死体积作为观
察指标 ,来研究山东特有珍稀物种白花丹参对脑缺
血的保护作用。
材料与方法
1　实验动物与分组
健康雄性 KM小鼠 100只 ,体质量 (22 ±2) g,
由山东大学实验动物中心提供 。随机分为假手术
组 、脑梗死组 、白花丹参组 , 按手术后断头取脑时
间 ,每组又分 1、3、6、12、24 h 5个时间点 ,每个时间
点 6只 , 1只作组织切片 , 5只作脑匀浆 。脑梗死
组 、白花丹参组 24 h时间点再各加 5只测梗死体
积 。
2　仪器及试剂
冷光源由徐州恒发有限公司研制 ,型号为 LG-
150。金属卤化灯 (150W , 24 V)为发光光源 ,滤去
全部紫外线与红外线 ,投射出单一绿色光束 ,波长为
(560±30) nm ,光导纤维输出口至照射区距离为 1. 5
mm ,光束投射中心直径为 3 mm ,光照强度为 5. 6×
10
5
cd /m
2 ,照射中心最高温度为 27℃。立体定位
仪 ,美国 Stoelting公司生产 ,型号为 51600。微循环
激光多普勒测量仪 ,瑞典百灵威公司生产 ,型号为
PF5001。酶标仪 ,美国 B IO-RAD公司生产 ,型号为
550。紫外分光光度仪 ,上海精密科学仪器有限公
司生产 ,型号为 UV755B。冰冻切片机 ,德国 LEICA
公司生产 ,型号为 CM1900。玫瑰红 (rose bengal,
RB)由美国 S igm a公司购买。 ICAM-1一抗 、ELISA
试剂盒 、SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士
德公司 。髓过氧化物酶 (MPO)测试盒购自南京建
成生物工程研究所 。 2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑
(TTC)购自国药集团化学试剂有限公司。
3　局灶性脑梗死模型的复制
根据丁品胜等[ 1]的方法略作改动 ,室温 25℃条
件下 ,腹腔注射水合氯醛 (0. 35 g /kg˙bw)麻醉 ,使
用加热垫调节体温以维持在 (37±0. 5)℃,经股静
脉缓慢注入 5%玫瑰红(100mg /kg˙bw),立体定位
仪固定小鼠头部 ,沿头正中切口分离 、暴露左侧颅
骨 。以矢状缝左侧 2 mm、冠状缝后 2 mm为中心 、
直径 3mm为照射野 ,使冷光源光导纤维探头垂直
贴近暴露的颅骨。注射玫瑰红后 5 m in时打开冷光
源 ,照射 10 m in。将激光多普勒测量仪探针垂直放
置在颅骨表面光照中心 ,即梗死中心 ,测量光照前
后的皮层血流量 ,光照前记录基准血流量值 ,光照
后再记录血流量值以证实栓塞的成功 ,并用基准值
的百分比来表示 。假手术组除不作光照外其他操
作同脑梗死组。白花丹参组剂量为 20 g生药 /kg.
bw ,连续灌胃 7 d;脑梗死组 、假手术组予以同等容
积的生理盐水连续灌胃 7 d,然后制作脑梗死模型 。
4　白花丹参水提物的制取
所用白花丹参根产于山东莱芜苗山白花丹参
种植基地 。称取白花丹参根适量 ,切片后加蒸馏水
浸泡 30 m in,然后加热煮沸。开始用强火 ,沸腾后
改用文火 ,保持微沸 40 m in,搅拌 、趁热过滤。药渣
再加蒸馏水同法煮沸后 ,滤过 。合并滤液 ,经旋转
蒸发仪浓缩 ,最后用蒸馏水稀释至所需浓度灌封 ,
4℃保存备用。
5　观测指标及方法
5. 1　灌药期间 、模型制作过程中及麻醉清醒
后进行一般情况的观察。
5. 2　 ICAM-1免疫组化检测:每组每个时间点
取 1只小鼠 ,麻醉后经心脏行主动脉插管 ,先用 4℃
生理盐水 20m l灌注至右心耳流出液清澈 ,再用 4%
多聚甲醛 20m l内固定后取脑 ,经 4%多聚甲醛后固
定 6 h, 10%、20%、30%蔗糖梯度脱水 ,制作 6 μm
的冰冻切片 ,进行 HE、ICAM-1免疫组化染色。
5. 3　 ICAM-1 ELISA检测:每组每个时间点取 5
只小鼠 ,脱臼处死 ,快速取脑 ,冰盘上分离左侧皮层 ,称
重后置于匀浆器中 ,按重量体积 1：9加入 0. 01mo l /L
PBS,于冰水混合物中匀浆 40次 , 然后严格按照
ELISA试剂盒说明进行操作 ,用酶标仪进行检测。
5. 4　MPO活性检测:取脑匀浆严格按 MPO检
测测试盒说明进行操作 ,用紫外分光光度仪进行检
测。
5. 5　TTC染色测梗死体积:脑梗死组 、白花丹
参组 24 h时间点各取 5只小鼠 ,脱臼处死 ,快速取
脑 ,置于冰盘上 ,以梗死中心点 , 1 mm层厚 ,向头尾
端各作 3个冠状切片 ,置于 2%TTC中 , 37℃水浴孵
育 30m in,然后于 4%多聚甲醛固定 24 h,扫描仪采
集图像 , image-prop lus图像分析系统计算每一层梗
死面积 ,梗死体积 =层梗死面积之和 ×层厚 。
6　统计学方法
实验数据两组比较采用 t检验 ,多组比较采用
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单因素方差分析 ,两两比较采用 q检验 ,数据用均数
±标准差(–x ±s)表示。所有数据均应用 SAS6. 12
软件进行统计学处理 。
结　果
1　一般情况的观察
灌胃期间小鼠饮食及体质量增长正常 ,模型制
作过程中小鼠生命体征稳定 ,麻醉清醒后 ,精神萎
糜 ,活动及摄食减少 ,但均无明显肢体瘫痪 。
2　脑组织大体观察
假手术组无变化 。脑梗死组大脑皮层光照区
在光照后各时间点均可见红染区 , 3 h时颜色最深 ,
以后颜色逐渐变浅 ,但范围逐渐增大 ,光照后 12 h
达面积最大 ,然后又缩小。梗死灶冠状切面呈 “碗
形 ”,尖端指向侧脑室 ,略穿透皮层 ,同一时间点梗
死灶大小一致。白花丹参组红染区颜色变淡 ,范围
缩小 ,穿透深度变浅。
3　HE染色的病理形态学观察
HE染色显示假手术组无变化 。脑梗死组光照
后 3 h坏死中心出现急性细胞坏死 、细胞减少 ,核碎
裂或溶解 ,随着时间的延长可见坏死区不断扩大 ,
上述表现不断加重 , 24 h最明显。同时在梗死区可
见微血管内血栓形成 , 3 ～ 6 h最明显 ,以后逐渐减
少 。白花丹参组坏死区范围缩小 ,组织结构破坏减
轻 。
4　脑组织 ICAM-1表达的变化
假手术组皮层内仅有少量血管内皮细胞呈
ICAM-1阳性表达 ,各时间点比较无差异(P >0. 05)。
脑梗死组皮层内 ICAM-1表达主要位于光照缺血区
及其周围 ,海马区亦有表达;阳性细胞主要为血管
内皮细胞 ,神经元 、胶质细胞偶见表达;1 h表达量
低 ,与假手术组 1 h比较无差异 (P >0. 05);3 ～ 6 h
依次升高 , 12 h达高峰 , 24 h又下降 ,与假手术组相
应时间点比较差异有显著意义(P <0. 05)。白花丹
参组海马区未见表达 ,皮层内 ICAM-1阳性表达的
范围减小;与脑梗死组相应时间点比较 , 1 h表达量
无差异 (P >0. 05), 3 ～ 24 h表达量降低 ,差异有显
著意义 (P <0. 05)(表 1)。
表 1　三组小鼠梗死侧皮层 ICAM-1表达量(OD值)的比较(–x±s, n=5)
组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
假手术组 0. 66±0. 02 0. 66±0. 02 0. 67±0. 02 0. 66±0. 02 0. 66±0. 01
脑梗死组 0. 67±0. 02 0. 86±0. 02★■ 0. 98±0. 02★■ 1. 01±0. 02★■ 0. 84±0. 02★■
白花丹参组 0. 67±0. 02 0. 77±0. 02★■▲ 0. 81±0. 02★■▲ 0. 72±0. 02★■▲ 0. 70±0. 01■▲
　　注:与同组前一时间点比较, ★P<0. 05;与假手术组相应时间点比较 ,■P <0. 05;
与脑梗死组相应时间点比较,▲P <0. 05。
5　脑组织 MPO活性的变化
假手术组皮层 MPO活性较低 ,各时间点比较
无差异(P >0. 05)。脑梗死组梗死侧皮层 MPO活
性 1 h最低 ,与假手术组 1 h比较无差异(P >0. 05);
3 ～ 6 h依次升高 , 12 h达高峰 , 24 h又下降 ,与假手
术组相应时间点比较差异有显著意义 (P <0. 05)。
白花丹参组与脑梗死组相应时间点梗死侧皮层
MPO活性比较 , 1 h无差异 (P >0. 05), 3 ～ 24 h降
低(P <0. 05),差异有显著意义 (表 2)。
表 2　三组小鼠梗死侧皮层 MPO活性(μ/g)的比较(–x±s, n=5)
组别 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
假手术组 0. 42±0. 02 0. 46±0. 03 0. 45±0. 03 0. 43±0. 03 0. 44±0. 04
脑梗死组 0. 45±0. 04 0. 63±0. 04★■ 0. 86±0. 03★■ 0. 93±0. 04★■ 0. 66±0. 04★■
白花丹参组 0. 45±0. 04 0. 55±0. 01★■▲ 0. 62±0. 02★■▲ 0. 48±0. 02★■▲ 0. 44±0. 01▲
　　注:与同组前一时间点比较 ,★P<0. 05;与假手术组相应时间点比较,■ P<0. 05;
与脑梗死组相应时间点比较 ,▲P<0. 05。
6　梗死体积的变化
与脑梗死组梗死体积 (15. 34±0. 46) mm3比
较 ,白花丹参组梗死体积 (12. 09±0. 62)mm 3明显
缩小 ,差异有显著意义 (P <0. 01)。梗死中心冠状
切面 TTC染色见图 1、2,左侧皮层白色区域代表梗
死区 。
讨　论
光化学法诱导局灶性脑梗死模型 ,已从病理 、
生理等方面证明与人类脑血栓形成的发病过程相
似[ 2] ,有研究表明光化学诱导大脑中动脉梗塞模型
既有永久性脑缺血又有脑缺血再灌注的特点[ 3] ,更
接近于缺血性脑血管病的自然病程 ,用该模型做研
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中国微循环 2006年 12月第 10卷第 6期　
究更有临床参考价值 。光化学法诱导小鼠局灶性
脑梗死模型 ,较传统的光化学法诱导大鼠局灶性脑
梗死模型又有许多优点:小鼠颅骨薄 ,光照可透过 ,
剪开头皮即可照射 ,检测皮层血流量也无需开颅 ,
损伤小 ,操作简单 ,模型成功率高;小鼠价格低 ,给
药量小 ,给药周期短 。该模型经济 、高效 ,适用于大
批量筛药。
ICAM-1属免疫球蛋白超家族 , 在体内分布较
广 ,包括各种血管内皮细胞 、上皮细胞 、单核巨噬细
胞 、淋巴细胞等多种细胞的表面 ,但在血管内皮细
胞表达最强 ,作为配基与白细胞表面表达的 LFA-1
和 Mac-1受体相结合 ,介导白细胞与血管内皮细胞
之间的黏附以及白细胞穿出血管壁 。正常情况下 ,
ICAM-1可以在内皮细胞有低水平的表达 ,与中性粒
细胞的亲和力较弱 ,但在脑缺血或脑缺血再灌注时
TNF-α、IL-1β 、IFN-γ等细胞因子激活下表达数量和
功能明显上调 ,造成白细胞与内皮细胞黏附 ,继之
浸润至缺血脑组织 ,加重缺血脑组织损伤 。本实验
显示 ,假手术组脑组织内仅有非常少量的 ICAM-1
表达 ,但脑梗死后 3 h梗死区及其周围 ICAM-1表达
显著升高 ,并于 12 h达到高峰 , 24 h又下降。另外 ,
梗死侧皮层 MPO在梗死后 3h活性明显升高 , 12 h
活性最强 ,以后又下降 ,与 ICAM-1表达的时程相一
致 。由此可见 ,当梗死侧皮层 ICAM-1表达开始升
高时 ,梗死侧皮层中性粒细胞浸润也开始增加 ,并
随着梗死时间的延长 ,两者同步升高并达到高峰 ,
与 G e[ 4] 、W ang[ 5]的研究报道相似 。
大量动物实验研究表明 ICAM-1的表达 、中性
粒细胞的浸润与脑缺血损害的程度密切相关 ,抗
ICAM-1抗体可明显减轻大鼠的梗死体积 [ 6] ,并可
延长溶栓治疗的时间窗 [ 7] ,但临床试验效果不理
想 ,反而使病情恶化 ,并伴随着感染和发热等副作
用 [ 8] 。而传统中药安全无毒 ,特别是丹参作为一种
常用的活血化瘀药物 ,在治疗缺血性脑血管病的临
床实践中已取得良好疗效 ,也有许多实验研究了其
分子机制 ,如有研究 [ 9] 显示丹参有预防白细胞黏
附 、减轻血管内皮损伤和改善微循环等作用 。白花
丹参作为一稀有药材 ,虽多年来常雷同丹参使用 ,
但对其研究甚少。有研究[ 10]显示白花丹参所含化
学成分与丹参基本一致 ,并含有一些特有成分 ,如
1, 2, 15, 16-四氢丹参醌Ⅰ 、丹参醛 Ⅱ ,有些成分含量
还高于丹参。另有研究 [ 11]表明白花丹参茎叶水提
物能明显增强小鼠的耐缺氧作用 ,使缺氧小鼠的存
活时间明显延长 。本实验研究显示梗死前应用白
花丹参根水提物能够使局灶性脑梗死后脑组织
ICAM-1的表达降低 ,中性粒细胞的浸润减少 ,使局
灶性脑梗死梗死体积缩小。这提示减轻局灶性脑
梗死的炎症反应可能是白花丹参根水提物对缺血
性脑血管病的保护作用机制之一。
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