全 文 ：收稿日期:2007-10-23;　修订日期:2008-10-26
作者简介:韩琳娜(1978-),女(汉族),山东淄博人 ,现任山东中医药大学讲
师 ,硕士学位 ,主要从事生物化学 、细胞生物和分子生物学的教学科研工作.
白花丹参和紫花丹参生化标记分析
韩琳娜 1 ,李红梅 2
(1.山东中医药大学 ,山东 济南　250035;　2.山东省科学院 ,山东 济南　250035)
摘要:目的 分析白花丹参和紫花丹参在蛋白水平的遗传差异。方法 利用叶片过氧化物酶和种子贮藏蛋白两种生化标
记对白花丹参和紫花丹参进行了分析。结果 同工酶分析表明 , 两种丹参间过氧化物酶同工酶谱存在差异;贮藏蛋白分
析表明 , 丹参种子蛋白主要是以盐溶性蛋白为主 , 水溶蛋白和醇溶蛋白较少 , 碱溶性蛋白更少;两种丹参种子贮藏蛋白谱
带之间的差异性不明显 。结论 二者在蛋白水平存在一定差异。
关键词:紫花丹参;　白花丹参;　贮藏蛋白;　同工酶;　聚丙烯酰胺凝胶电泳法;　生化标记
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)01-0211-01
BiochemicalMarker Character Analysis ofWhite Flower Danshen and Violet
FlowerDanshen
HANLin-na1 , LiHong-mei2
(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine, Jinan250355, China;2.ShandongAcademyofSci-
ences, Jinan250014, China)
Abstract:ObjectiveToanalyzewhiteflowerDanshenandvioletflowerDanshenintheir2biochemicalmarkers(perodiaseand
storageprotein).MethodsTwobiochemicalmakersofperodiaseandstorageproteinwereanalyzed.ResultTherewasdiference
inperoxidasePAGE-bandingpateerns.SeedproteinsofwhiteflowerDanshenandvioletflowerdanshenwererespectivelyextrac-
tedusingdistiledH2O, 2.5%NaCl, 0.2%NaOHand75%alcohol.Basedonacrylamidegelelectrophoresis, mostofstoragepro-teinsweresalt-soluble, water-solubleandaclohol-solubleproteinswasless.Therewasalitlealkali-solubleprotein.Con-
clusionThereisdiferenceinstorgeproteinbetweenwhiteflowerDanshenandvioletflowerDanshen.
Keywords:WhiteflowerDanshen;　VioletflowerDanshen;　Storageprotein;　Isozyme;　PAGE;　Biochemicalmarker
　　丹参 Salviamiltiorrhiza味苦 、性微寒 ,功能活血祛淤 , 安神宁
心 , 排脓止痛 [ 1] ,临床应用范围较广。就其形态学性状而言 , 可
分白花 、紫花两种。传统育种中的形态学鉴定只能揭示外观差异
且受环境影响较大 , 不能完全揭示品种间的遗传差异。生化标记
是以基因表达产物蛋白质作为遗传标记 , 主要包括贮藏蛋白 、同
工酶和等位酶标记 [ 2] 。生化标记分析是一种快速 、简便 、有效的
遗传检测手段。作为生化标记的同工酶 、非酶形式的蛋白质 ,已
经被广泛地应用于遗传种质的分离 、筛选 、品种鉴定以及生物多
样性 、杂种优势的研究中 [ 3 ～ 6] 。
本研究利用贮藏蛋白和过氧化物酶同工酶两种生化标记对
白花丹参和紫花丹参进行了分析 ,以期了解其在蛋白质性状水平
的遗传差异 , 为种质资源的收集和二者药效成分上的比较提供
理论依据。
1 　材料与方法
1.1　材料 供试材料白花丹参和紫花丹参均由山东中医药大学
药圃提供。
1.2　 方法
1.2.1　过氧化物酶提取 称取 1g鲜材料 , 冰浴研磨 , 加入 1 ml
稀释 4倍的浓缩胶缓冲液(pH=6.7), 冰浴超声提取 15 min,
8 000 r/min, 0℃离心 20 min。上清液加入等体积 40%蔗糖溶液
混匀 , 作为供试溶液 ,可在 4℃冰箱内储存备用。
1.2.2　蛋白质提取 蛋白质提取分为分步提取和一次性提取两
种。分步提取主要研究丹参种子中各类蛋白质的组成及比例;一
次性提取主要比较在不同提取液的情况下 ,蛋白质谱带的带型。
分步提取方法:取丹参种子粉碎后称取 0.1 g, 加入 600 μl
水 , 在 60℃水浴中提取 40 min, 10 000 r/min离心 5 min, 取上清
液备用 , 再用水按同样方法冲提 1次 , 离心弃掉上清液。 然后加
入 600 μl2.5% NaCl溶液 , 用同样方法提取上清液备用 , 再用
2.5%NaCl冲提 1次 , 离心弃掉上清液 , 用水冲洗 1次。再加入
400 μl的 50%异丙醇提取液 ,在同样条件下 , 提取上清液备用。
最后加入 400 μl0.2%NaOH,同样条件 ,提取上清液备用。最后
提取的各种蛋白质溶液 ,和样品处理液(20%甘油 , 0.1%溴酚蓝 ,
20%浓缩胶缓冲液)等体积混合后用于电泳分析。
一次性提取方法:丹参种子粉碎后分别称取 0.05 g, 分别加
入 600 μl水 , 600 μl2.5%盐溶液 , 600 μl50%异丙醇和 600 μl
NaOH,在 60℃水浴中提取 40 min,离心取上清液。按分步提取法
加入样品处理液后电泳 [ 7]。
1.2.3　 电泳方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对过氧化物酶
和贮藏蛋白进行电泳分析。 DYY-III30稳压 、稳流型电泳仪(北
京六一仪器厂), YY0155 -94型电泳槽 , 采用垂直板凝胶电泳 ,
凝胶板 22cm×10 cm。凝胶为 30%丙烯酰胺 、 1%甲叉双丙烯酰
胺 , 分离胶 10%,浓缩胶 3%,以 TEMED和过硫酸铵为催化系统 ,
以 Tris-甘氨酸为电极缓冲液 , 150V稳压条件下电泳 4h。
1.2.4　染色 胶板剥离后 , 用于跑过氧化物酶的胶放在联大茴
香胺染色液中 ,间歇性摇动 , 染色 2h, 拍照。蛋白电泳的胶放在
考马斯亮蓝染色液(0.08%考马斯亮蓝 , 10%三氯乙酸)中染色
2 h。
1.2.5　脱色 种子贮藏蛋白电泳的胶放至 25%甲醇 , 10%乙酸
溶液中脱色直到看到电泳条带 ,拍照。
2 　结果
2.1　丹参叶片过氧化物酶同工酶分析 白花丹参在 5.1, 7.9,
8.7 cm处各有 1条带 , 共 3条;而紫花丹参在 6.3, 7.5, 8.2, 8.7
cm处各有 1条带 ,共 4条(见图 1)。 说明不同表型的丹参品种
间在同工酶分析上存在着差异 ,理论上可以以此作为品种划分的
依据之一。
2.2 　丹参种子蛋白质种类的分析 用分步提取法对白花丹参和
紫花丹参两品种种子提取得到的水溶性蛋白 、盐溶性蛋白 、醇溶
性蛋白和碱溶性蛋白电泳结果见图 2。由分析结果看出 , 在丹参
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.1 时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期
种子中以盐溶性蛋白为主 ,水溶性蛋白和醇溶性蛋白较少 , 碱溶
性蛋白含量极少 , 在电泳时难以区分。所以在研究丹参种子贮藏
蛋白时应以盐溶性蛋白为主。
1.紫花丹参　 2.白花丹参
图 1　丹参叶片过氧化物酶同工酶分析
Ⅰ :分步提取　Ⅱ:分别提取　 1～ 4:白花丹参
5～ 8:紫花丹参　1、5:水溶蛋白　 2、 6:2.5%NaCl盐溶蛋白
3、7:50%异丙醇醇溶蛋白　 4、 8:0.2%NaOH碱溶蛋白
图 2　丹参种子贮藏蛋白分析
2.3 　不同提取液单一提取蛋白质分析 对于同一材料 , 分别用
不同提取液一次性提取 ,然后电泳。水溶性蛋白 、盐溶性蛋白 、醇
溶性蛋白的电泳谱带见图 2。结果表明:①不同提取液比分步提
取法可得到较清晰的电泳谱带 ,说明单一提取蛋白含量较高。以
盐溶性蛋白的谱带最清晰。②各种提取液提取的蛋白质电泳谱
带的条数不同 , 2.5%NaCl提取的蛋白谱带最多 , 为 5条 , 分别在
2.7, 3, 3.6, 4.2和 4.6 cm处;水和 50%异丙醇提取的蛋白谱带
为中等 ,均为 3条;0.2%NaOH提取的蛋白谱带最少 ,为 1条。 ③
各种提取液得到的蛋白质谱带在白花丹参和紫花丹参之间几乎
没有差异。
3　讨论
丹参叶片的过氧化物同工酶分析表明白花丹参和紫花丹参
间存在谱带差异 ,可以为二者之间在生化标记水平上的差异提供
实验依据。但同时也存在着实验重复性不稳定的问题。
丹参种子蛋白以盐溶性蛋白为主 ,水溶性 、醇溶性蛋白较少 ,
碱溶性蛋白最少。电泳分析丹参种子贮藏蛋白时应以盐溶性蛋
白为主 。不同电泳方法所分离出的蛋白谱带条数 、带型和清晰度
有较大差异。利用同一电泳方法 , 电泳条件不同如 pH、离子强
度 、缓冲系统等的差异 , 也会造成分离效果的差异 ,所以会得出不
同结论 。赵华英等 [ 8]对不同丹参种间根茎的蛋白进行比较研究
得出不同产地不同丹参品种间水溶性蛋白种类和含量有差异。
参考文献:
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药大学学报 , 1998, 14(4):255.
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农业技术学院学报 , 2000, 13(4):58.
[ 4 ] 　王沛政 ,赖相红 ,李　涛 ,等.蛋白质电泳技术在品种真伪和纯度检
验上的应用 [ J] .新疆农业科学 , 2003, 40(5):296.
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水稻科学 , 1997, 11(3):129.
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[ J] .种子 , 2004, 23(2):24.
[ 7 ] 　张春庆 ,尹燕枰 ,高荣岐 ,等.棉花种子蛋白多态性与品种鉴定方法
的研究 [ J] .中国农业科学 , 1998, 31(4):16.
[ 8 ] 　赵华英 ,陈永林.苋科 6种种子类药材的蛋白电泳鉴别 [ J] .中国中
药杂志 , 2000, 25(1):53.
临床报道
收稿日期:2007-11-23;　修订日期:2008-01-25
作者简介:王丽鸣(1967-),女(汉族),吉林长春人 ,现任长春中医药大学
第一附属医院第一临床医院(吉林省中医院)耳鼻喉科副主任医师 ,硕士
学位 ,主要从事中医耳鼻咽喉科临床与教学工作.
急性分泌性中耳炎的中医药规范化治疗
王丽鸣
(吉林省中医院 ,吉林 长春　130021)
摘要:目的 观察中医药规范化治疗急性分泌性中耳炎的临床疗效。方法 将门诊的急性分泌性中耳炎患者随机分为治
疗组和对照组 , 每组 50例 , 治疗组给予中医药规范化治疗 ,对照组给予抗生素口服 ,同时配合鼻腔喷药。结果 一个疗程
治愈好转率 , 治疗组为 96%,对照组为 84%。经统计学处理 , 两组总有效率差异有统计学意义。结论 中医药规范化治疗
急性分泌性中耳炎疗效更好。
关键词:急性分泌性中耳炎;　中医药规范化治疗
中图分类号:R76　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)01-0212-01
　　急性分泌性中耳炎是以传导性耳聋及鼓室积液为主要特征
的中耳非化脓性疾病 , 病人多有感冒病史 , 继之出现听力下降 ,自
声增强 , 耳痛 ,耳闭塞感 ,耳鸣 ,患耳周围皮肤麻木感等症状。主
要病理变化为中耳黏膜血管扩张 ,通透性增加 , 血浆蛋白外渗 ,与
咽鼓管功能障碍 、感染和免疫反应有关。笔者对 50例急性分泌
性中耳炎患者给予中医药规范化治疗 , 另 50例患者给予抗生素
口服 , 同时配合鼻腔喷药 , 观察中医药规范化治疗急性分泌性中
耳炎的疗效。
1　一般资料
1.1　病例资料 选取 2005-01 ～ 2007-01在吉林省中医院耳鼻咽
喉科就诊的急性分泌性中耳炎患者 100例。 100例患者均为初
次患病 ,年龄 3 ～ 64岁 , 平均 14.5岁;病程 1 d～ 4周。 100例患
者按随机数字法分成治疗组和对照组 , 每组 50例。 15 d为 1个
疗程 , 治疗前和治疗后行纯音测听及鼓室导抗图检查。
1.2　临床表现 患者自觉耳微痛和(或)耳鸣 、堵塞感 、听力下
降 , 病程 1 d～ 4周。耳镜检查:鼓膜微红 、内陷或有液平面 。纯
音测听:语言频率平均骨气导差(听力级)15 ～ 30dB;鼓室导抗图
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.1