全 文 ：2008 年第 4 期 漳州师范学院学报(自然科学版) No. 4. 2008 年
（总第 62 期） Journal of Zhangzhou Normal University（Nat. Sci.） General No. 62
文章编号:1008-7826(2008)04-0108-05
紫萁组织培养的探讨
张泽宏 1 , 何义发 2 , 周吉源 3 , 张秋萍 1 , 黄 剑 1
（1. 漳州师范学院 生物科学与技术系, 福建 漳州 363000; 2. 湖北民族学院 生物科学与技术学院, 湖北
恩施 445000; 3. 华中师范大学 生命科学学院, 湖北 武汉 430079）
摘 要：紫萁孢子叶小叶整体表面消毒比孢子粉消毒更简便易行，效果也更理想. 不加任何激素与附加低浓度激
素(低于 1.0 mg/L)同样有很高的孢子萌发率，将 MS 培养基中无机盐浓度减半促进孢子萌发，糖浓度在 2%-3%范围内
较合适，低于 2%和高出 4%，孢子萌发率明显降低. 25℃左右是原叶体增值的适宜温度，无机盐浓度对原叶体增殖无
明显影响，培养基中附加少量活性炭和 KH2PO4 对原叶体增殖和生长有促进作用. 6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L、
6-BA1.0mg/L+NAA0.5 mg/L、NAA0.5mg/L+KT 5.0mg/L 和 NAA1.0mg/L+KT5.0mg/L 都能促进原叶体增殖. 6-BA 0.5
mg/L+NAA1.0mg/L 分化假根的能力最强，可作孢子体生根培养基.
关键词：紫萁 ; 无菌培养 ; 孢子粉 ; 孢子叶小叶
中图分类号: Q943.1 文献标识码: A
1 引言
紫萁(Osmunda Japonica Thunb.)是一种具有明显世代交替的多年生蕨类经济植物，无性世代时间长，
切割分蔸进行无性繁殖操作难度大，功效低，繁殖系数不高. 蕨类植物属相对低等的较原始的类群，自然
繁殖能力弱，是因为孢子萌发、原叶体形成、受精、孢子体形成与生长受到许多环境因素的影响，限制性
因素难以在特定时间保证. 何义发[1]在田间运用“三段式”育苗培蔸方法，将孢子粉通过有性繁殖培育出
了孢子体幼苗. 袁艺、田胜尼、张敏等[2-3]都以紫萁孢子体作为外植体得到了试管苗. 目前还没有愈伤组织
诱导成功的报道，但马玉心等[4]对薇菜的的另一个种分株紫萁进行了组织培养研究，成功地诱导出了愈伤
组织，并继代、生根、得到试管苗，对紫萁愈伤组织的诱导很有借鉴意义. 本文利用孢子粉和孢子囊两种
外植体，初步摸索出紫萁原叶体和幼孢子体阶段的无菌培养条件，以期为紫萁野生转家种探讨出一套科学
的人工栽培技术提供理论基础，为探索适用的快速繁殖技术，达到高效、低成本的目的提供技术支持.
2 材料与方法
2.1 试验材料
试验材料均于 5 月份采集孢子囊即将成熟但未散落的孢子叶，将孢子叶抖落于白纸上或剪下装入纸袋
中，自然后熟干燥 1～2 d，收集孢子粉.
2.2 试验方法
由于通过常规愈伤组织途径很难诱导出愈伤组织，本试验仅利用孢子萌发途径探讨紫萁的组织培养技术.
采用以下两种方式：
a. 取孢子囊完好的孢子叶小叶流水冲洗，于70%酒精和0.1%升汞溶液中浸泡，无菌水冲洗数次，切
成0.5～1cm的小段，接种于附加不同激素的MS和1/2 MS培养基上，于25±2℃，光照(40µmol·s-1·m-2，12 h/d)
培养，30d后按下式计算孢子萌发率：
萌发率=孢子囊变绿并长出原叶体的孢子叶块数／接种的孢子叶块数 ×100%

收稿日期: 2008-02-29
基金项目: 湖北省教育厅创新项目(2002D08001)
作者简介: 张泽宏(1981-), 男, 湖北省蕲春县人, 助教, 硕士研究生
通讯作者: 何义发，湖北民族学院教授
DOI:10.16007/j.cnki.issn2095-7122.2008.04.011
第 4 期 张泽宏 ， 何义发 ， 周吉源 ， 张秋萍 ， 黄 剑 : 紫萁组织培养的探讨 109

b. 将后熟散落的孢子粉于水杯中搅拌后静置数分钟，弃上层液和杂质，除去底部沉淀，再在经高温
灭菌的漏斗滤纸中，用 70%酒精和 0.1%升汞分别过滤，达到时间弃去上层多余的消毒液，无菌水浸洗数
次，涂布于 1/2MS 培养基上.
以上所有基本培养基均添加 2.0%蔗糖＋0.6%琼脂粉＋200mg/LKH2PO4＋0.2%活性炭，pH=5.8. 每
次结果重复三次取平均值.
3 结果与分析
3.1 孢子粉与孢子囊消毒效果比较
表 1 不同外植体的消毒效果
材料 升汞消毒时间(min) 污染率(%) 消毒效果
孢子粉 5 100 --------
9 78 色黄绿, 后期有少量褐化或污染
12 14 全部褐化死亡
孢子叶小叶 5 100 --------
9 36 色鲜绿, 后期有少量污染
12 14 全部褐化死亡
由表 1 可知, 孢子粉的消毒效果比孢子叶小叶效果差，不仅污染率高，而且容易褐化死亡，继续培养
无孢子萌发. 小叶的孢子处在孢子囊壳的包被保护之中，受外界病菌侵染程度轻，表面消毒时受消毒液的
影响也较小. 此外，孢子粉个体微小，表面消毒操作难度大，且由于经过干燥散落的后熟过程，夹杂的杂
物较多，生活力会有所降低. 故以孢子叶小叶整体表面消毒比孢子粉消毒要理想的多.
3.2 不同激素对紫萁孢子萌发的诱导效应
表 2 不同激素对紫萁孢子萌发的诱导效应
由表 2 可以看出，培养基中激素的浓度高低对孢子萌发无显著影响，不加任何激素与附加低浓度激素(低
于 1.0 mg/L)，同样有很高的孢子萌发率，但浓度太高(2.0～5.0 mg/L)会抑制孢子萌发. 另一方面，无机盐浓
度对孢子萌发影响较大，较低的无机盐浓度促进孢子萌发，将 MS 培养基中无机盐浓度减半是合适的.
3.3 不同糖浓度对孢子萌发率的影响
由表 3 可知，糖浓度对孢子萌发影响较大，在 2%～3%范围内较合适，低于 2%和高出 4%，孢子萌发
萌发率(%) 激素浓度(mg/L)
MS 培养基 1/2 MS 培养基

6-BA 0 56 96
0.5 60 100
1.0 48 98
1.5 54 88
2.0 34 78
5.0 12 28
NAA 0.5 64 100
1.0 52 96
1.5 60 100
2.0 46 90
5.0 14 22
2,4-D 0.5 54 94
1.0 48 100
1.5 36 90
2.0 30 70
5.0 2 18
KT 0.5 56 94
1.0 58 100
1.5 48 90
2.0 24 82
5.0 20 42
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率明显降低. 以食用白砂糖代替化学纯蔗糖，对孢子萌发率基本上无影响，取材方便，且可降低费用成本.
3.4 不同影响因子对原叶体的增殖效应
3.4.1 温度对原叶体的增殖效应
表 3 不同糖浓度对孢子萌发率的影响(％)
糖浓度(g/L) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
蔗 糖 24 86 96 100 72 66
食用砂糖 20 80 98 98 74 56
表 4 温度对原叶体的增殖效应
培养基 温度(℃) 原叶体生长状况
MS 18℃ 增殖缓慢，色浓绿
25℃ 增殖较快，色浓绿
自然室温 增殖缓慢，色黄绿，少量枯死
1/2 MS 18℃ 增殖缓慢，色浓绿
25℃ 增殖较快，色浓绿
自然室温 增殖缓慢，色黄绿，少量枯黄
由表 4 可知，培养温度对原叶体增殖影响较大，25℃左右是原叶体增值的适宜温度，低于 20℃或昼
夜有温差波动都对原叶体增殖有抑制作用. 无机盐浓度对原叶体增殖无明显影响，MS 和 1/2 MS 培养基均
适合原叶体增殖生长.
3.4.2 活性炭与 KH2PO4 对原叶体的增殖效应
由表 5 可知，培养基中附加少量活性炭和 KH2PO4 对原叶体增殖和生长有促进作用. 原叶体在增殖生
长过程中，对 P、K 元素的需求量大，大棚人工播撒孢子繁殖试验中，在原叶体增殖生长时期隔天喷施
200mg/L KH2PO4 溶液代替浇水，对原叶体旺盛生长有明显的促进作用，在组培中效仿也是合适的. 活性
炭可以吸附培养基中积累的有害物质，从而更利于原叶体的增殖和生长.
表 5 活性炭与 KH2PO4对原叶体的增殖效应
添加物 原叶体生长状况
0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
活性炭 0.2% 增殖较快，片状体碎小，浅绿
KH2PO4 200mg/L 增殖较快，片状体碎小，浓绿
活性炭 0.2%+ KH2PO4 200mg/L 生长旺盛，片状体肥厚，鲜绿
3.4.3 不同激素对原叶体的增殖效应
由表 6 可知，不同激素对原叶体增值的影响较明显. 6-BA 和 NAA 在较低浓度时，对原叶体增殖效果
较好，当浓度高于 2.0 mg/L 时反而对原叶体生长不利，出现白化苗现象；2,4-D 对原叶体增殖效果较好，
但片状体皱褶严重，不舒展饱满；高浓度的 KT 有利于原叶体的增殖和生长.
由表 7 可知，6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L、6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L、NAA0.5mg/L +KT 5.0mg/L
和 NAA1.0mg/L+KT5.0mg/L 都能促进原叶体增殖，并能生长良好. 6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L 分化出假
根的能力最强，可用于孢子体生根培养基.
3.5 炼苗与移栽
孢子囊无菌培养约四个月后，在浓绿肥厚的原叶体上开始出现幼孢子体，在培养基营养供给充足的条
件下，20 d 左右即可进行炼苗. 由于离体条件培养下的再生植株长期在营养丰富的无菌条件下生长，根系
活动能力低，直接移入土壤中栽培对外界环境适应力极差，成活率极低. 在培养室条件下选择 3 条根以上、
根系粗壮、3 叶以上且叶长 3～4cm 的绿色完整植株，置于大量元素稀释 100 倍的培养液浸泡过的干净沙
砾中培养一周，其间要经常用纯净水清洗去根上残余的琼脂，不断补充培养液，使植株逐渐适应外界环境.
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再转移至室内自然条件下培养一周后，接入配备好的砂土中栽植，细心管理，半个月后可移至室外，成活
率可达 80%. 另在遮阳网大棚内保持湿度 90%以上，保持温度 20～28℃，散射光照条件下，以同样基质
炼苗移栽，效果也较好，成活率可达 60%. 炼苗时间过短，砂培改为水培，成活率均有下降.
表 6 单因子激素对原叶体的增殖效应
激素浓度(mg/L) 原叶体生长状况
6-BA 0 增殖缓慢，片状体小，浅绿
0.5 增殖较快，片状体肥厚，鲜绿
1.0 生长旺盛，片状体肥厚，鲜绿
1.5 增殖较快，片状体碎小，浓绿
2.0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
5.0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
NAA 0.5 增殖较快，片状体肥厚，鲜绿
1.0 增殖较快，片状体肥厚，鲜绿
1.5 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
2.0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
5.0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
2,4-D 0.5 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
1.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
1.5 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
2.0 增殖较快，片状体小，浓绿，有皱褶
5.0 增殖缓慢，片状体小，浅绿，少量白化苗
KT 0.5 增殖较快，片状体小，浓绿
1.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
1.5 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
2.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
5.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
4 讨论与小结
紫萁孢子无菌培养途径孢子囊萌发率高，质地均一，生长势良好，没有病害坏死等不良症状，但存在
成本高、耗费人工、炼苗时间较长导致成活率下降等缺点. 无菌培养技术，目前还处在摸索阶段，不能将
被子植物组织培养技术直接照搬. 被子植物从外植体到成苗移栽一般只需 40 天左右，紫萁属较低等的蕨
类植物，有其独特的生活史，自然条件下从孢子成熟到萌发成孢子体需四个月左右，到基本上能移栽到大
田栽培则共需要约六个月. 目前的无菌培养技术和温室基质育苗都很难显著缩短其生活周期，只能作为补
充自然生态环境下资源不足的人工繁殖手段.
孢子粉的消毒效果比孢子叶小叶效果差，不仅污染率高，而且容易褐化死亡，继续培养无孢子萌发. 孢
子叶小叶整体表面消毒比孢子粉消毒要理想的多.
激素浓度高低对孢子萌发无显著影响，不加任何激素与附加低浓度激素(低于 1.0 mg/L)，同样有很高
的孢子萌发率，但浓度太高(2.0～5.0 mg/L)会抑制孢子萌发. 无机盐浓度对孢子萌发影响较大，较低的无
机盐浓度促进孢子萌发，将 MS 培养基中无机盐浓度减半是合适的.
糖浓度对孢子萌发影响较大，在 2%～3%范围内较合适，低于 2%和高出 4%，孢子萌发率明显降低.
以食用白砂糖代替化学纯蔗糖，对孢子萌发率基本上无影响.
温度对原叶体增殖影响较大，25℃左右是原叶体增值的适宜温度，低于 20℃或昼夜有温差波动都对
原叶体增殖有抑制作用. 无机盐浓度对原叶体增殖无明显影响，MS 和 1/2 MS 培养基均适合原叶体增殖生
长. 培养基中附加少量活性炭和 KH2PO4 对原叶体增殖和生长有促进作用.
6-BA 和 NAA 在较低浓度时，对原叶体增殖效果较好，当浓度高于 2.0 mg/L 时反而对原叶体生长不利，
出现白化苗现象；2,4-D 对原叶体增殖效果较好，但片状体皱褶严重，不舒展饱满；高浓度的 KT 有利于原
叶体的增殖和生长. 6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L、6-BA1.0 mg/L+NAA0.5mg/L、NAA0.5mg/L +KT 5.0mg/L
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和 NAA1.0mg/L+KT5.0mg/L 都能促进原叶体增殖，并能生长良好，具体哪一种促进原叶体增殖效果最好，
还有待进一步深入研究. 6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L 分化出假根的能力最强，可用于孢子体生根培养基.
表 7 双因子激素对原叶体的增殖效应
激素浓度(mg/L)
6-BA NAA 2,4-D KT
原叶体生长状况
0.5 1.0 0 0 增殖缓慢，片状体小，浅绿,假根明显
0.5 0.5 0 0 生长旺盛，片状体肥厚，鲜绿
1.0 0.5 0 0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
1.0 1.0 0 0 增殖较快，片状体碎小，浓绿
0 0 0.5 2.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
0 0 0.5 5.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
0 0 1.0 5.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
0 0 1.0 2.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿，有皱褶
0 1.0 0 5.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
0 0.5 0 5.0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
0 0.5 0 2.0 增殖缓慢，片状体小，浓绿
0 1.0 0 2.0 增殖缓慢，片状体小，浓绿
0.5 0 1.0 0 增殖较快，片状体肥厚，淡绿，有皱褶
0.5 0 0.5 0 增殖较快，片状体肥厚，淡绿，有皱褶
1.0 0 0.5 0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
1.0 0 1.0 0 增殖较快，片状体肥厚，浓绿
此外，培养基的质地对原叶体的快速增殖也影响较大. 表面有水渍，质地膨松，轻敲有晃动感，挖去
一小块即有明水填充的培养基，原叶体增殖比质地坚硬的培养基要明显加快，长出孢子体的时间要早 10d
左右，且生长状况良好.
原叶体增殖培养是紫萁孢子萌发途径中最重要的一个环节，只有原叶体生长状况良好，积累足够的养
分，在外界条件合适的情况下，才能完成受精产生孢子体. 如何缩短原叶体增殖周期，尽量节约成本，提
前出苗，将是紫萁孢子萌发培养中的重要议题.
参考文献:
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[2] 袁 艺, 田胜尼, 叶爱华, 等. 紫萁快速繁殖技术的研究[J]. 园艺学报, 2002, 29(3): 247-250.
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[4] 马玉心, 赵 宏. 分株紫萁的生物学特性及组织培养技术[J]. 中国林副特产, 2004, 68(1):16-17.
Study on Tissue Culture of Osmunda Japonica Thunb.
ZHANG Ze-hong１ , HE Yi-fa２ , ZHOU Ji-yuan３ , ZHANG Qiu-ping１ , HUANG Jian１
(1. Department of Biological Science and Technology, Zhangzhou Normal University, Zhangzhou, Fujian 363000, China;
2. College of Biological Science and Technology, Hubei Institute for Nationalities, Enshi, Hubei 445000, China;
3. College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan, Hubei 430079, China)
Abstract: There was better effect on surface disinfection by using sporophyllary leaf than by using spores,and there was high
germination rate of spores while the concentration of hormones were lower than 1.0 mg/L. To half the concentration of
inorganic salt from MS medium was good for spores germination. The concentration of sugar was suitable from 2% to 3% or
the spores germination rate would be very low. The temperature of 25℃ was suitable for prothallium proliferation. The
concentration of inorganic salt could not affect obviously the prothallium proliferation. To add a little activated carbon and
KH2PO4 to medium was good for prothallium proliferation.Hormones of 6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L, 6-BA1.0
mg/L+NAA0.5mg/L, NAA0.5mg/L +KT 5.0mg/L, NAA1.0mg/L+KT5.0mg/L were all good for prothallium proliferation. It
was best to differentiate rhizoid by using the hormones of 6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L.
Key words: Osmunda Japonica Thunb. ; aseptical culture ; spores ; sporophyllary leaf
[责任编辑: 喻玉萍]