全 文 ：第 27卷　第 2期
Vol.27　No.2
中　国　稀　土　学　报
JOURNALOFTHECHINESERAREEARTHSOCIETY
2009年 4月
Apr.2009
单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究
薛　云 1 , 杨利民1 , 王秋泉 1, 2＊
(1.厦门大学化学化工学院化学系 现代分析科学教育部重点实验室 , 福建 厦门 361005;2.海洋环境科学
国家重点实验室 , 福建 厦门 361005)
　收稿日期:2008-12-01;修订日期:2009-01-18
　基金项目:国家自然科学基金项目 (20535020和 20775062), 高技术研究计划项目 (2006AAZ404)和基础研究计划项目 (2009CB421600)资助
　作者简介:薛　云 (1983 -), 女 , 陕西西安人 , 硕士研究生;研究方向:色谱与光谱 /质谱联用技术
＊通讯联系人(E-mail:qqwang@xmu.edu.cn)
摘要:以单叶新月蕨(Pronephriumsimplex, 金星蕨科新月蕨属)为研究对象 , 研究其在自然条件下对稀土元素的超富集能力。其叶片主动富集
的稀土含量高达 1249.37 μg·g-1 , 是母土的 51.8倍 、土壤中生物可利用态的 650.7倍 , 且稀土元素分异现象与母土一致。在 100 μg·ml-1
Nd3+胁迫下 , 单叶新月蕨生长状况良好 , 且体内 Nd含量提高 , 同时结合多肽的表达增加 , 证明单叶新月蕨具超富集稀土元素的特性;Nd结
合多肽经酸处理脱掉 Nd后 , HPLC/ESI-IT-MS的结果显示 632 Da的肽段是 Nd在结合多肽中所处的区域。利用细胞分级 、 HPLC分离纯化 、氨
基酸组成分析以及分子量和酶解肽段的 MALDI-TOF-MS及 ESI-IT-MS测定富集过程中起着重要作用的稀土结合多肽 , 结果显示 , 稀土结合多
肽的分子量为(5.07±0.02)KDa, 其中含有-E-T-M-E-, -P-N-L-L-G-E-, -F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的肽段。
关键词:单叶新月蕨;超富集;多肽;稀土
中图分类号:O614.33;Q946.1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-4343(2009)02-0289-08
　　稀土元素的广泛使用造成潜在的环境和健康
风险已经日益引起人们的关注 [ 1, 2] , 尤其是稀土元
素日允许摄入量与农用安全性探讨已成为最新的
研究热点[ 3, 4] 。稀土含量过高时 , 不论对植物的生
长还是对动物的骨骼 、脑部 、脏器和内分泌系统等
均具有潜在毒性[ 5 ～ 8] 。事实上稀土元素(rareearth
element, 简称 REE)类似于一般毒物 , 对生物体具
有 hormesis效应 [ 9, 10] , 即低剂量时表现促进作用 ,
高剂量时表现抑制作用。相关研究表明 , 轻稀土元
素的离子半径(9.6 ～ 11.5 nm)与 Ca2+(9.9 nm)十
分接近 , 它很容易竞争 Ca2+在生物体内的结合位
点 , 特别是 La3 +还具有 “超钙离子”的别称 , 植物
缺钙症状可通过加入 La3+来缓解[ 11 ～ 13] ;La3+还可
以竞争结合到 PS-I中 Ca和 Mg的结合位点上来影
响光合作用效率 [ 14 ～ 16] 。此外 , 稀土与多糖 [ 17] 和
DNA[ 18]等生物大分子的相互作用 、与细胞壁上的
蛋白通道或主动运载蛋白结合进而通过细胞壁进
入细胞内部 [ 19, 20]的研究也有报道 。近年来出现的
植物修复技术具有成本低 、不破坏生态环境 、不引
起二次污染等优点[ 21] , 为人们提供了一条有效的
污染环境的修复途径。但是与植物超富集重金属
元素的机理研究相比 , 稀土元素超富集植物的研
究相对较少 [ 11 ～ 26] , 大多数研究主要集中于稀土元
素在植物体内分异规律的研究[ 27 ～ 29] , 对于稀土在
植物体内富集的分子机制的研究尚待深入 。
本文以生长在自然保护区内的单叶新月蕨
(Pronephriumsimplex, 金星蕨科新月蕨属)为对象 ,
研究其超富集稀土元素的能力和机制。通过 Nd3+
的胁迫实验 , 检验单叶新月蕨在富集稀土元素过
程中起关键作用的多肽的特性;提取稀土结合多
肽 , 分别利用液相色谱 -电感耦合等离子体质谱联
用技术(HPLC-ICPMS)、基质辅助激光电离 -飞行
时间质谱(MALDI-TOF-MS)以及电喷雾电离-离子
阱质谱(ESI-IT-MS)对其进行鉴定;尝试从分子水
平上探讨蕨类植物耐受和超富集稀土元素的作用
机制。
1　实　验
1.1　仪器与试剂
PerkinElmerELANDRCIICP-MS(SCIEX, 加
拿大 )用 于测定稀土元素的 含量;Shimadzu
LC10ADvpHPLC(Kyoto, 日本)用于分离纯化稀土
中　国　稀　土　学　报 27卷
结合多肽;BrukerReflexIIMALDI-TOF-MS(Bre-
men, 德国)用于稀土结合多肽的分子量及纯度鉴
定;BrukerESQUIRE-LCTM-IT-MS(Bremen, 德国)
用于分析酶解片断;HermleZ36 HK型高速冷冻离
心机(Hermle, 德国)用于离心分离多肽;Christ
ALPHA1-2 LDplus冷冻干燥机(Christ, 德国)用于
冻干浓缩稀土结合多肽。
稀土氧化物(纯度 >99.9999 %)购自中国科
学院长春应用化学研究所;2-巯基乙醇 、牛血清白
蛋白(BSA, 纯度≥99 %)购自 Sigma(美国);十二
烷基磺酸钠(SDS, 色谱纯)购自 TCI(日本);苯甲
基磺酰氟酶抑制剂 (PMSF, 纯度 >99%)购自
AMESCO(美国);异硫氰酸苯酯 (PITC, 纯度 ≥
99.0%)购自中国医药集团上海化学试剂公司 , 用
于氨基酸标记;18种氨基酸标准品购自 BDH
ChemicalsLtd.Poole(英国);经甲苯磺酰苯丙氨酰
氯甲酮(TPCK)处理的胰蛋白酶用于蛋白酶解(Se-
quencingGrade, Promega, 美国);Endoproteinase
Glu-C(SequencingGrade, RocheAppliedScience,
瑞士);考马斯亮蓝 G-250购自上海蓝季科技发展
有限公司;其他试剂纯度均为 AR级。
1.2　样品采集及稀土含量测定
样品采集自福建省漳州市南靖乐土亚热带雨
林自然保护区 , 采样地点位于东经 117°12′940″,
北纬 24°54′501″, 海拔 327 m。以随机方式采样 ,
采集完整的金星蕨科新月蕨属单叶新月蕨的植株
以及根系周围的土壤 。
消解单叶新月蕨方法参照文献 [ 26] , 分为叶 、
叶柄 、茎 、根 , 105 ℃的条件下烘 24 h后分别准确
称取 0.2 g, 加入 5 ml浓 HNO3 , 室温预消解 12 h,
然后加入 1 mlHClO4消解;土样自然风干后 , 研
磨 , 过筛 , 使粒度控制在 100 ～ 120目范围 , 准确称
取 0.2 g, 加入 5 ml浓 HNO3 , 1 mlHF室温预消解
12 h, 然后加入 1 mlHClO4消解 , 消解至溶液呈无
色或淡黄色 , 并将酸液蒸发至无白烟冒出。最后用
2% HNO3溶解根 、茎 、叶 、叶柄和土壤消解残渣 ,
定容到 25 ml容量瓶中 , 用 ICP-MS测定稀土元素
的含量。参照文献 [ 30]提取土壤中生物可利用态
稀土 , 准确称取 0.8 g研细的土样 , 用 32 ml0.11
mol·L-1 HAc作浸取剂 , 在(25 ±0.1)℃的恒温振
荡器中连续振荡浸取 16 h, 离心后 , 取上清液 , 用
ICP-MS测定稀土元素的含量 。
1.3　单叶新月蕨的 Nd3 +胁迫培养
虽然选用混合稀土进行胁迫培养实验更接近
于自然条件 , 但情况将会很复杂 , 不利于单叶新月
蕨富集特性的基础研究。本研究采用单个稀土元
素 Nd对单叶新月蕨进行胁迫实验 , 首先考虑到
Nd的天然丰度较高 , 并且其具有较多同位素 , 便
于后续质谱的检测和鉴定。将单叶新月蕨分别放
入含 0, 100和 500 μg·ml-1 Nd3+的 Knop植物培养
液中培养 , 其中含有 1000 μg·L-1 Ca(NO3 )2 ,
250 μg·L-1MgSO4·7H2O, 120 μg·L-1 KCl, 2.86
μg·L-1H3BO3 , 0.22 μg·L-1 ZnCl2 , 0.08 μg·L-1
CuSO4·5H2O, 0.02 μg·L-1 H2MoO4 , 0.08 μg·L-1
MnCl2 , 4 μg·L-1 FeSO4·7H2O(Fe2+转化为 Fe-ED-
TA)。为了补充植物生长所需要的磷 , 同时又要防
止稀土磷酸盐沉淀 , 采用 250 μg·L-1 KH2PO4叶面
喷施。每 3 d更换一次培养液以保证培养液中
Nd3+的浓度 , 培养时间为 4周 。根据文献 [ 26]改
进的细胞分级提取方法 II, 对单叶新月蕨培养前 、
后的叶片细胞分级 , 分别得到脂类 、蛋白类 、多糖
类及组成细胞壁的纤维素和果胶 , 消解后用 ICP-
MS对每一部分中的稀土的含量及分布进行分析。
1.4　稀土结合多肽的提取纯化和鉴定
称取适量叶片 , 加入液氮 , 低温下研磨至粉末
状 。用 pH值为 6.5, 含 50 mmol·L-1 NH4HCO3 ,
1 mmol·L-1 PMSF, 1 mmol·L-1 EDTA, 1 mmol·L-1
SDS, 20 mmol·L-1 2-巯基乙醇的蛋白提取液分 3次
充分研磨提取。离心后 , 用冰乙醇沉淀上清液中蛋
白 , 缓冲液溶解后 , 采用 SuperdexPeptide10/
300GL尺寸排阻层析柱纯化 (流动相为 pH7.8的
50 mmol·L-1 NH4HCO3), UV在线监测多肽组分 ,
ICP-MS测定其中稀土含量 , 确定稀土含量最高的
多肽馏分 , 并收集该馏分 , 然后采用反相 ZORBAX
EclipseXDB-C8色谱柱进一步分离纯化 , 流动相在
8 min内乙腈(ACN)从 3.5%线性增加到 70%, 再
以 70%ACN洗脱至 15 min;离线 ICP-MS检测 , 并
进行 MALDI-TOF-MS表征鉴定。
将纯化得到的单叶新月蕨稀土结合多肽用 G-
250法 [ 31]进行定量 。配制 0.1 mg·ml-1的牛血清白
蛋白(BSA)标准溶液;称取 0.1 g考马斯亮蓝 G-
250, 溶于 50 ml90%乙醇中 , 加入 85%(m/V)的
290
2期 薛　云等　单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究
磷酸 100 ml, 最后用蒸馏水定容到 1 L, 即得 1%考
马斯亮蓝 G-250染色液。配制 0, 10, 20, 30, 40,
60 , 80 , 100 μg·ml-1BSA标准溶液 , 分别加入 5 ml
考马斯亮蓝 G-250染色液 , 室温静置 5 min后 , 在
595 nm下比色测定 , 绘制 BSA标准曲线用于测定
单叶新月蕨稀土结合多肽的含量。
前期研究结果表明 , 稀土结合多肽的等电点约
为 3.7[ 32] , 是酸性多肽。因而在含有 6mol·L-1尿素 、
50 mmol·L-1碳酸氢铵(pH7.8)和 2 mmol·L-1 2-巯
基乙醇的变性液中 , 加热至 95 ℃变性 20 min;然
后加入乙酸至等电点沉淀多肽并脱去稀土元素 。
将含有稀土元素的乙酸上清液进行 HPLC-ESI-MS
分析 , 另将脱去稀土的多肽进行 MALDI-TOF-MS
和 ESI-MS鉴定 , 并进一步采用 TPCK修饰的胰蛋
白酶及 EndoproteinaseGlu-C(V8)蛋白酶 , 酶与多
肽的比例为 1∶50 (w/w), 分别在 37和 25 ℃酶解
18 h后 , HPLC-ESI-MS联用分析肽段的序列信息 。
同时 , 在稀土结合多肽和 18种标准氨基酸混合样
品中分别加入 5.7 mol·L-1 HCl(含有 2%2-巯基乙
醇 , 1%苯酚和 1%草酸), 超声除气后 110 ℃水解
22 h[ 33] 。水解液经 N2吹干 , 加入异硫氰酸苯酯
(PITC)∶乙醇∶三乙胺∶水 =1∶7∶1∶1的氨基衍生剂
进行柱前衍生 , 室温下避光反应 20 min。衍生产物
蒸发干燥 , 残留物溶解离心后 , 取上清液用 HPLC
进行氨基酸组成分析 , 254 nm紫外检测 , 不稳定
氨基酸的损失通过标准氨基酸测定值来校正。
2　结果与讨论
2.1　自然条件下单叶新月蕨的稀土元素超富集特性
单叶新月蕨叶 、叶柄 、茎 、根 、母土及土壤生物
可利用态(HAc-soil)的稀土元素含量测定结果显示 ,
单叶新月蕨叶片内的稀土含量为 1249.37 μg·g-1 ,
是母土稀土含量(24.13 μg·g-1)的 51.8倍 , 是土壤
中生物可利用态稀土含量的 650.7倍(图 1);根据
稀土元素超富集植物的定义 [ 34] , 单叶新月蕨具有超
富集稀土元素的特性 , 有望成为稀土污染植物修
复的材料 。此外 , 天然的单叶新月蕨叶片中 Ce的
含量最高 , 其次是 La和 Nd, 这是因为 La和 Ce在
土壤中的天然丰度较高 , 单叶新月蕨生长的母土
中 La, Ce和 Nd的含量分别为 5.14, 10.19和 2.33
μg·g-1(表 1)。叶片细胞分级实验表明尽管单叶新
月蕨叶片中 60%以上的稀土元素滞留在细胞壁上 ,
但仍有超过 30%的稀土元素与粗蛋白结合 , 虽然
多糖和脂肪中也存在一定的稀土离子 , 但含量很
低 , 不会导致稀土元素体内的超富集。蛋白质是一
类在信息传递 、能量转化和物质代谢等生命活动
中占有极其重要地位的生物大分子 , 能主动结合
高浓度的稀土离子 , 表明蛋白分子在植物体内起
络合钝化或运输载体等重要作用。
图 1　单叶新月蕨叶 、 叶柄 、茎 、 根 、母土及土壤生物可利
用态中 15种稀土元素的总含量∑REEs(μg·g-1)
Fig.1　∑REEscontents(μg·g-1)inlamina, petiole, stem,
root, hostsoilandbioavailablefraction(HAc-soil)of
thehostsoilofP.simplex
表 1　单叶新月蕨叶 、 叶柄 、茎 、 根 、母土及土壤生物可利
用态中 15种稀土元素的含量 (μg·g-1)
Table1　REEscontents(μg·g-1)inlamina, petiole,
stem, root, hostsoilandbioavailablefraction
(HAc-soil)ofthehostsoilofP.simplex
REEs Lamina Petiole Stem Root HAc-soil Hostsoil
La 261.50 18.54 113.35 15.29 0.26 5.14
Ce 491.46 34.84 216.91 37.15 0.47 10.39
Pr 63.52 11.97 31.43 8.74 0.11 4.18
Nd 231.89 15.32 95.43 12.08 0.22 2.33
Sm 53.35 4.28 26.76 6.54 0.09 0.62
Eu 5.33 2.68 8.55 1.41 0.04 0.17
Gd 23.04 3.26 14.12 2.32 0.12 0.08
Tb 3.39 2.48 6.95 1.05 0.06 0.13
Dy 14.30 1.17 11.86 1.23 0.07 0.05
Ho 15.86 1.12 9.64 1.13 0.05 0.06
Er 10.94 1.04 9.47 1.45 0.06 0.03
Tm 2.96 0.52 6.56 0.26 0.05 0.05
Yb 17.32 0.55 5.68 0.48 0.06 0.03
Lu 4.92 0.20 3.89 0.45 0.05 0.07
Y 49.56 5.66 23.34 5.36 0.21 0.80
∑REE 1249.37 103.63 583.94 94.93 1.92 24.13
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中　国　稀　土　学　报 27卷
2.2　稀土结合多肽的分离纯化及鉴定
采用 SEC-UV/ICPMS联用分析单叶新月蕨叶片
中的稀土结合多肽 , 发现在保留时间为 13.5 min时
(图 2), 有一个稀土含量最高的组分 , 因而我们将
它作为主要研究对象;进一步经过 HPLC纯化 ,
ICPMS离线检测 , 紫外吸收显示主要有 3个多肽组
分 , ICPMS检测结果表明前两个峰含有稀土(图 3),
峰 1的保留时间是色谱的死时间 , ICPMS检测的稀
土中包含无机态的稀土离子和一些不保留的稀土结
合组分 , 因而收集保留时间为 10 min的峰 2进行
MALDI-TOF-MS鉴定。得到的质谱峰半峰宽较大 ,
原因可能是稀土元素质量性质相近 , 并且常常是结
伴共存 , 因而我们读取峰值得到单叶新月蕨主要的
稀土结合多肽分子量为 5072 Da, 与 ESI-IT-MS的鉴
定结果非常接近 [ 26, 32] , 可认为稀土结合多肽的分子
量为(5.07 ±0.02)KDa;ICPMS分析发现其中 Ce含
量很高 , 分别是 La和 Nd的 10.5和 9.7倍。
2.3　Nd胁迫培养后单叶新月蕨的耐受能力和富
集行为
　　通过含有不同浓度的 Nd3+胁迫培养实验证
明 , 在含 100 μg·ml-1 Nd3+营养液胁迫培养下 , 单
叶新月蕨能够保持旺盛的生命力 , 而且随着培养
液中 Nd3+浓度的增加 , 叶片中富集的稀土也成倍
增长;在 500 μg·ml-1 Nd3+胁迫下 , 单叶新月蕨仍
能生存 , 且叶中可富集高达 52.62 mg·g-1的钕 。说
明单叶新月蕨不仅具有超强的富集能力 , 还有很
强的耐受性。由图 4看出 , 单叶新月蕨叶片内的
Nd含量在胁迫下不断增加的同时伴随着 Ce含量
的逐渐降低 , 胁迫第 8天时叶片内 Nd含量达到最
高 。此外 , 我们对叶片内产生的粗蛋白进行了含量
测定 , 发现随着培养过程的进行 , 叶片中的蛋白含
量也随 Nd的变化呈逐渐增加的趋势 , 说明 Nd不
但可以通过细胞壁被吸收进入叶片细胞 , 还可以
促进结合多肽的表达 。近期研究表明 , Ce胁迫后
水鳖叶片也可以被诱导出分子量为 33.0和 20.7
kD的新蛋白[ 35] , 可见稀土元素确实能够诱导和促
进多肽的表达。叶片细胞分级结果(图 5)表明经过
胁迫培养的叶片蛋白中 Nd含量增加为原来的近 5
倍 , Ce的含量降低为原来的 1/2, 表明 Nd取代了
一部分蛋白中原来结合的 Ce。胁迫培养实验证明 ,
单叶新月蕨不但对稀土元素具有富集能力 , 而且
对稀土元素具有选择性;另一方面 , 蛋白含量和
Nd含量的协同增加表明蛋白参与了稀土元素富集
的过程 。
图 4　单叶新月蕨叶片中蛋白含量 、 Nd和 Ce的含量随胁
迫时间的变化
Fig.4　VariationofProteincontent, NdandCecontentsinthe
laminasofP.simplexinprocessoftime
292
2期 薛　云等　单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究
图 5　胁迫培养前 、后单叶新月蕨叶片的细胞物质组成中轻稀土元素含量(μg·g-1鲜重)
Fig.5　LREEscontentsinsomecompositionsofcellofP.simplexlaminasbeforeandafterNdstress(μg·g-1 freshlaminaweight)
2.4　Nd胁迫前后稀土结合多肽的对比
2.4.1　Ce和 Nd结合多肽的结构推测　　从胁迫
培养后的叶片中提取出的稀土结合多肽 , 经 ICPMS
鉴定其 Nd含量最高 , 分别是 La和 Ce的 94.1和
57.9倍(图 6)。可见在高浓度 Nd的胁迫下 , 与培
养前相比 , Nd取代了多肽中结合的大部分 Ce, 胁
迫后的叶片中提取的稀土结合多肽主要为 Nd结合
多肽 , 其 MALDI-TOF-MS鉴定的质谱峰值为 5076
Da, 与 Ce结合多肽仅相差 4 Da, 等于 Nd与 Ce的
原子质量之差。稀土结合多肽变性后 , 加入乙酸脱
去稀土 , Ce和 Nd结合多肽的分子量分别减少了
628和 632 Da, 最终均为 4444 Da。ICPMS检测发
图 6　Nd胁迫前后单叶新月蕨多肽中的稀土含量
Fig.6　ContentsofREEsinbindingpeptidebeforeandafter
Ndstress
现 4444 Da的多肽中稀土含量仅剩原稀土结合多
肽中的 4.2%, 几乎全部被脱去留在上清液中 。从
上清液的 HPLC/ESI-IT-MS的谱图 (图 7)可以看
出 , 该 632 Da的多肽片段与 Nd结合多肽脱稀土前
后减少的分子量一致 , 且其主要信号(m/z632.9,
633.9, 634.9, 635.9, 636.9, 640.9)的同位素分
布呈现 Nd的同位素分布 (142 Nd27.2%;143 Nd
12.2%;144Nd23.8%;145Nd8.3%;146Nd17.2%;
150Nd5.6%), 仅有 639.0的信号与同位素分布相
比有些异常增高。说明在变性酸化脱稀土元素的
过程中 , 这一肽段与 Nd一起从结合多肽中脱掉 ,
是稀土元素与多肽的结合区域 。
2.4.2　稀土结合多肽的序列测定　　氨基酸分析
结果显示该多肽的赖氨酸和精氨酸含量少 , 约占
氨基酸总量的 1.5%, 因而选用胰蛋白酶水解该多
图 7　Nd结合多肽片断的 HPLC-ESI-MS谱图
Fig.7 HPLC-ESI-MSchromatogramofNdbindingpeptidefragment
293
中　国　稀　土　学　报 27卷
图 8　EndoproteinaseGlu-C酶解肽段的 HPLC/ESI-IT-MS分析结果
Fig.8　HPLC/ESI-IT-MSresultsofthepeptidecleavagedbyEndoproteinaseGlu-C
肽时 , 没有得到有用的序列信息。选用 V8蛋白酶
酶解得到 4个肽段 m/z776, 908, 670和 693(图
8), 选用 MASCOT检索网站中的 PeptideMassFin-
gerprint肽质量指纹图谱数据库进行检索与比
对 [ 36] , 发现覆盖率数据均低于 30%, 原因可能是
数据库中还没有该多肽的数据信息 。对酶解肽段
进行解析得到该稀土结合多肽中含有-E-T-M-E-,
-P-N-L-L-G-E-, -F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的肽段。其
中亮氨酸和异亮氨酸的含量较高 , 缬氨酸和苯丙
氨酸的含量也较高 , 氨基酸组成分析的结果显示
亮氨酸和异亮氨酸的含量为 12.4%, 缬氨酸和苯
丙氨酸的含量分别为 6.0%和 3.2%, 与序列分析
结果吻合。同时该多肽含有较多的天冬氨酸和谷
氨酸 , 占氨基酸总量的 15.5%, 这二者不但均为酸
性氨基酸 , 还能为稀土结合提供可能的结合位点 。
脯氨酸的含量最高 , 占氨基酸总量的 10.5%, 也是
稀土结合的可能位点。对该多肽的进一步结构的
研究仍在进行中 , 多肽序列结构的鉴定将对稀土
富集机制的解释起到至关重要的作用 。
3　结　论
自然生长的单叶新月蕨叶片的稀土含量高达
1249.37 μg·g-1 , 是母土的 51.8倍 , 是土壤中生物
可利用态稀土含量的 650.7倍 , 对稀土元素具有较
强的富集能力 , 且叶片中的稀土分异规律与母土
一致 , Ce的含量均最高 , 其次是 La和 Nd。单叶新
月蕨具有很强的耐受性 , 在 500 μg·ml-1 Nd3+胁迫
下仍能生存;此外伴随 Nd含量的增加 , Ce含量降
低而叶片中的结合多肽的表达增加 , 表明 Nd可以
被吸收进入叶片细胞内部诱导多肽的表达并与之
结合。胁迫前后的稀土结合多肽分子量相差 4 Da,
是 Nd取代了多肽中原来结合的 Ce所产生的结果 ,
证明单叶新月蕨对于稀土元素的特异性富集是客
观存在的。
胁迫前的单叶新月蕨稀土结合多肽 , Ce含量
很高 , 分别是 La和 Nd的 10.5和 9.7倍 。胁迫后
其 Nd含量最高 , 分别是 La和 Ce的 94.1和 57.9
倍 , 其分子量为 5076 Da, 可以认为是 Nd结合多
肽 。胁迫前后的稀土结合多肽变性酸化脱掉稀土
后分子量均为 4444 Da, 分别减少 628和 632 Da,
632 Da的肽段是 Nd在结合多肽中所处的区域;该
4444 Da肽段中含有 --E-T-M-E-, -P-N-L-L-G-E-,
-F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的片段 。稀土结合多肽鉴定
研究的进一步开展不但有助于理解单叶新月蕨富
294
2期 薛　云等　单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究
集稀土的机制 , 而且对建立稀土结合多肽的 cDNA
文库进而通过转基因技术培育大生物量的稀土污
染修复植物是十分重要的 。
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HyperaccumulationAbilityofPronephriumSimplextoRareEarthElementsand
CorrespondingREEBindingPeptides
XueYun1 , YangLimin1 , WangQiuquan1, 2＊(1.DepartmentofChemistry＆theMOEKeyLaboratory
ofAnalyticalSciences, CollegeofChemistryandChemicalEngineering, XiamenUniversity, Xiamen
361005 , China;2.StateKeyLaboratoryofMarineEnvironmentalScience, Xiamen361005 , China)
Abstract:Pronephriumsimplex(P.simplex)wasin-
vestigatedforitshyperaccumulationabilitytoREEsin
thenaturalenvironment.ThecontentofREEsinthe
laminawasupto1249.37 μg·g-1 , whichwasrespec-
tively51.8 and650.7 timeshigherthanthoseinits
hostsoilandbioavailablefractionsofthesoil.Cultiva-
tionresultsshowedthatP.simplexcouldlivewelun-
der100 μg·ml-1 Ndstress.BoththecontentsofNd
andthepeptideinthelaminaincreasedalongwiththe
increaseofNd3+ concentrationintheculturesolution
whiletheCecontentdecreasedcomparedwiththatin
thenaturalgrowingP.simplex, indicatingthehyper-
accumulatingcharacteristic ofP.simplextoward
REEs.AfterNddisassociatedfrom theNd-binding
peptide, theresultofHPLC/ESI-IT-MSshowedthata
fragmentof632 DawastheNdbindingregioninthe
peptide.Combinedtheresultsobtainedviatheexperi-
mentsofcelularcompositionfractionation, HPLCsep-
arationandpurificationandaminoacidsanalysisas
welasMALDI-TOF-MSandESI-IT-MSoftheproteo-
lyticpeptidefragments, themolecularweightofthe
REE-bindingpeptidewas(5.07±0.02)KDa, which
containedfourpeptidefragmentsof-E-T-M-E-, -P-N-
L-L-G-E-, -F-V-I-Y-E-and-F-V-I-A-.
Keywords:pronephriumsimplex;hyperaccumulation;polypeptide;rareearths
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