全 文 ：泰山白花丹参对实验肿瘤细胞体内外生长的抑制作用
焦　鹏 1 , 　夏作理 2＊ , 　常　起3 , 　蔡洪信 1 , 　赵晓民 1
(1.泰山医学院生命科学研究所 ,山东 泰安 271000;2.泰山医学院微循环重点实验室 ,山东 泰安 271000;
3.泰山医学院附属医院 ,山东 泰安 271000)
收稿日期:2008-06-17
基金项目:泰山医学院青年基金项目(2007年)
作者简介:焦　鹏(1979-),女 ,硕士 ,讲师 ,主要从事药用植物与肿瘤的研究。 Tel:13854826934E-mail:jiaopeng196@163.com
＊通讯作者:夏作理 Tel:(0538)6225275-8413
关键词:白花丹参;S180细胞;BGC823细胞;MTT法;凋亡
中图分类号:R285.6　　　　　文献标识码:B　　　　　文章编号:1001-1528(2009)10-1622-02
　　白花丹参(SalviamiltiorrhizaBge.f.alba)为唇形科植物
丹参(Salviamiltiorrhizabge)的白花变型 ,主要分布于山东境
内 , 其他地区较为少见 ,属珍稀濒危药用植物。丹参功同四
物(当归 、熟地 、芍药 、川芎), 具有活血化瘀 、清凉消火 、宁
心安神之功效 , 是祖国药学中应用较广 、价值较高的药物之
一。近年来研究发现 , 丹参可能是一种天然的抗肿瘤药物。
本研究是在本课题组前期工作的基础上 ,通过体外细胞实验
和动物体内实验确定活血化瘀类中药白花丹参的抗肿瘤活
性 , 从而能更好的指导临床和用药 ,为泰山白花丹参的进一
步开发利用提供实验依据。
1　材料
1.1　细胞株 　小鼠移植性肉瘤 180(S180)和人胃癌
BGC823细胞株购于山东省医学科学院 , 在本院生命科学研
究所细胞培养间常规传代培养。
1.2　试剂与药品　白花丹参(产自泰山)由山东大学博士
生导师夏作理教授鉴定;RPMI1640培养基购自 Gibco公司;
新生牛血清购自杭州四季青公司;二甲基亚砜(DMSO), 噻
唑蓝(MTT), 碘化丙啶(PI)均购自 Sigma公司;环磷酰胺购
自山西普德药业有限公司 , 0.2 g/瓶 , 白色结晶体 , 国药准
字:H14023686, 产品批号:20060205。
1.3　仪器　BDFACScalibur流式细胞仪 , 美国 BD公司;
LG16-W高速微量离心机 , 北京医用离心机厂;BIO-RAD
Model550酶标仪 , 日本;MCO-15ACCO2培养箱 , 日本三洋
株式会社。
1.4　实验动物　昆明种小鼠♀♂并用 ,体重 18 ～ 22 g, 购自
山东省生物制品研究所。
2　方法
2.1　中药制备　中药白花丹参(产自泰山)由泰山医学院
微循环重点实验室制备。制备过程如下:称取 100 g自然干
燥的生药白花丹参根 ,剪切成碎块 , 加 1 L双蒸水 ,以温水浸
泡 4 h。文火第 1次煎 1.5 h, 收集煮剂 ,再加双蒸水 1 L, 第
2, 3次各煎 1h,合并煎液 , 200目滤网过滤 , 5 000 r/min离心
10 min, 收集上清液 , 旋转蒸发仪蒸馏浓缩至 100 mL, -60
℃冰冻煮剂后 ,冷冻干燥机干燥 19 h后得到 47g样品 , -20
℃冰箱避光储存备用。每次用时称取适当样品 , 实验前用
RPMI1640培养液(不含血清)稀释成所需浓度 , 0.22 μm滤
膜过滤后 ,用于体外实验;或者用蒸馏水直接稀释为所需浓
度进行体内实验。
2.2　白花丹参对 S180荷瘤小鼠的影响　取健康昆明种小
鼠 40只 ,每只右腋窝皮下接种 107 /mL的S180细胞悬液 0.2
mL, 随机分为 5组 , 每组 8只 , ♀♂各半。即:空白对照组给
生理盐水 , 1次 /d;阳性对照组给环磷酰胺(Cy)30 mg/kg, 1
次 /d;白花丹参制剂高 、中 、低剂量组分别为 5.0、2.5、1.0 g/
kg, 2次 /d, 接种次日给药 , 连续 7 d。给药结束后次日称重
处死小鼠 ,剖取瘤块称重 , 按下式计算抑瘤率 。抑瘤率(%)
=(1-给药组平均瘤重 /对照组平均瘤重)×100%[ 1] 。
2.3　白花丹参对人胃癌 BGC823瘤细胞株体外生长的抑制
作用　选用人胃癌 BGC823瘤细胞株 ,用含新生牛血清浓度
为 100 mL/L的 RPMI1640培养液培养 , 待细胞传至 3 ～ 4代
后取形态良好的对数生长期细胞用于实验。将处于对数生
长期的 BGC823细胞消化传代并制备单细胞悬液以每孔 5 ×
103个细胞 100 μL接种于 96孔培养板中 ,贴壁 24 h后分别
接入不同浓度的无菌的白花丹参制剂溶液 100 μL, 使最终
浓度分别为 2、1.5、1、0.8、0.4 g/L, 各组设 8个重复孔 , 对
照组加 100 μL无血清培养液 , 在 37 ℃, 50 mL/LCO
2
条件
下继续培养 24 h, 实验终止前加入新配制的 5 g/L的 MTT溶
液 20 μL, 混匀 , 再继续培养 4 h, 弃去上清 , 每孔加 DM-
SO200 μL, 充分振荡 30 min, 溶解 MTT沉淀物 , 490 nm测
定每孔的吸光度 A值。计算胃癌细胞相对存活率:相对存
活率 =实验孔 A值 /对照孔 A值 ×100%。
2.4　荧光染色观察细胞凋亡的形态　将密度 5 ×107 /L的
BGC823细胞加入放有盖玻片的 6孔培养板 , 细胞在盖玻片
上贴壁生长 , 2 d更换培养液 ,同时加入不同浓度的白花丹参
制剂 , 作用 24 h后 , 弃培养液 , PBS冲洗 , 0.4%多聚甲醛
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2009年 10月
第 31卷　第 10期
中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
October2009
Vol.31　No.10
(pH7.4, PBS配制)室温下固定 30 min,弃去固定液 , 并用
PBS洗 2次 , 用 1% TritonX-100作用 4 min, 加入适量的 0.5
mg/L4, 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色 20 min, 用
PBS冲洗 3次 , 封片 ,荧光显微镜观察并拍照。
2.5　统计学处理　所有数据以 x±s表示 ,实验组与对照组
比较 , 采用单因素方差分析。 应用 GraphpadPrism 4.0和
GraphpadInstatv3.0统计软件处理 [ 2] 。
3　结果
3.1　体内检测白花丹参抗肿瘤作用　腹腔注射白花丹参发
现 , 白花丹参能够抑制 S180实体瘤的生长 , 并呈剂量依赖效
应(表 1)。实验过程中还观察到 30 mg/kg环磷酰胺处理组
小鼠体重有所下降 , 活动性变差 、皮毛脱落等毒副作用 , 而白
花丹参处理组小鼠没有表现出毒副作用。
表 1　泰山白花丹参对小鼠移植性肉瘤 S180的作用
( x±s, n=8)
组别 体重 /g开始 结束
瘤重
/g
抑瘤率
/%
对照 19.35±1.54 22.01±1.93 1.18±0.23 -
环磷酰胺
30mg/kg 20.86±1.73 18.56±2.01 0.20±0.08＊＊ 83.05
白花丹参
1.0g/kg 20.46±1.68 23.54±1.69 1.04±0.27# 11.64
2.5g/kg 19.72±1.35 21.46±1.89 0.84±0.17＊# 28.81
5.0g/kg 20.83±1.81 22.23±1.98 0.73±0.30＊# 38.14
　　白花丹参组与对照组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01;白花丹参组
与环磷酰胺组比较#P<0.01。
3.2　泰山白花丹参体外抗肿瘤活性　通过体外 BGC823癌
细胞株培养 , 在倒置相差显微镜下观察可见正常组细胞生长
状态好 , 细胞呈多角形贴壁伸展生长于培养瓶中。随着白花
丹参作用浓度和孵育时间的增加 ,贴壁细胞逐渐变圆 , 细胞
体积缩小 , 细胞皱缩 , 折光性和贴壁能力均减弱。 通过四甲
基偶氮唑盐比色法进行药物敏感实验发现中药白花丹参处
理 BGC823细胞后 ,能使细胞存活率明显下降 , 并呈明显的
剂量依赖效应(表 2)。
表 2　 白花丹参对胃癌细胞 BGC823存活率的影响
( x±s, n=8)
白花丹参 /(g/L) 吸光度 /(A) 存活率 /%
0 1.109±0.053 -
0.4 1.017±0.117＊ 91.7±10.6
0.8 0.741±0.057＊ 66.8±5.1
1.0 0.638±0.107＊＊ 57.5±9.6
1.5 0.361±0.081＊＊ 32.6±7.3
2.0 0.326±0.104＊＊ 29.4±9.4
　　白花丹参组与对照组比较＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
3.3　荧光染色观察细胞凋亡的形态　对照组和白花丹参药
物组经 DAPI染色后 , 在荧光显微镜下可见:对照组细胞呈
均匀蓝色 , 核膜完整 , 细胞结构正常 , 表示对照组细胞为生
长状态良好的活细胞;而药物组细胞的细胞核边缘不规则 ,
细胞核染色体浓集 , 着色较重 , 染色质周边化 , 月牙状 ,并伴
有细胞核固缩 ,变形 , 有凋亡小体出现 , 因此从荧光强度及核
形态均可鉴别出细胞发生凋亡的典型特征。表明中药泰山
白花丹参能诱导 BGC823细胞发生凋亡。
4　讨论
现代医学检测证实白花丹参的丹参酮Ⅱ A含量远远超
过一般的丹参而且水溶性成分明显高于丹参 , 约为丹参的 2
倍。现代药理研究证明 , 丹参能改善心脏功能和血液流变
性 ,调节前列环素 /血栓素 A
2
(PGI
2
/TXA
2
)平衡和脂质代
谢 ,广泛用于心脑血管疾病的防治 , 并可提高机体的免疫功
能 ,具有抗肿瘤免疫作用 。白花丹参除具有丹参的作用和用
途外 , 对治疗血栓闭塞性脉管炎具有独特疗效 [ 3] 。 目前对
丹参的药理研究虽然还只是在体外细胞学水平进行 , 但这些
结果却显示出 , 丹参有着广泛的应用前景。近年来国内外
研究也发现 , 丹参不但具有抗肿瘤作用 , 而且可增加抗癌药
物的抗肿瘤效应 [ 4] 。 Liu等 [ 5]报道 , 丹参的水溶性提取物
(SM)能明显抑制人的肝癌细胞株 HepG2细胞的增殖 , 引起
细胞形态的改变 ,最终导致癌细胞的凋亡。这种作用具有时
间和剂量的依赖性。
与以往只是在体外细胞学水平进行丹参的药理研究相
比 ,本研究首次应用泰山白花丹参并通过严格的动物体内实
验观察其对肿瘤细胞的抗肿瘤作用 , 并且对其抗肿瘤机制进
行初步探索。研究结果发现白花丹参抑制人胃癌 BGC-823
细胞的增殖可能与诱导癌细胞凋亡有关 , 且抑制作用存在明
显的量效关系。体内研究确切证实了泰山白花丹参的抑瘤
作用并确定其高效低毒性。因此笔者认为白花丹参有希望
成为一种拥有自主知识产权的 、高效低毒的新型抗肿瘤药
物。笔者将进一步提取其有效单体成分并研究其作用机制。
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及血液流变学的影响 [ J].中药材 , 2007, 30(6):699-701.
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力的影响 [ J] .医药导报 , 2006, 25(10):975-977.
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生物合成途径研究进展 [ J].中草药 , 2004, 35(3):341-344.
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中 成 药
ChineseTraditionalPatentMedicine
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