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白花丹参提取物对脂多糖损伤内皮祖细胞周期与凋亡的影响
焦 鹏， 杨娜娜， 唐瑜菁， 秦树存*
(泰山医学院 动脉粥样硬化研究所，山东 泰安 271000)
收稿日期:2013-03-18
基金项目:山东省中医药科技发展计划项目 (2011-228) ;山东省自然科学基金 (Z2008C03) ;国家自然科学基金 (30971098) ;山东
省自然科学基金 (ZＲ2012HL18)
作者简介:焦 鹏 (1979—) ，女，讲师，硕士，研究方向:细胞生物学。Tel:13854826934 E-mail:jiaopeng196@ 163． com
* 通信作者:秦树存，教授，研究方向:脂质代谢与动脉粥样硬化。
摘要:目的 探讨白花丹参提取物对脂多糖损伤内皮祖细胞周期与凋亡的作用。方法 以 10 μg /mL 脂多糖诱导内皮
祖细胞损伤，制备内皮祖细胞损伤模型后用不同质量浓度白花丹参提取物干预，用 MTT 比色法检测各组细胞活性，
用 AnnexinV /PI双染法检测细胞凋亡变化，碘化丙啶单染流式细胞仪检测各组细胞周期。结果 与正常对照组比较，
模型组细胞增殖活性明显下降，细胞凋亡率明显增加，S 期细胞比率降低，G0 /G1 期细胞比率增加。与模型组比较，
白花丹参组细胞存活率升高，细胞凋亡率下降，且呈剂量依赖性，G0 /G1 期细胞比率降低，S 期及 G2 /M 期细胞比率
均增加。结论 白花丹参对脂多糖损伤的血管内皮祖细胞有保护作用，其机制可能是通过保护细胞周期正常进行、抑
制细胞凋亡实现的。
关键词:白花丹参;内皮祖细胞;细胞周期;凋亡;增殖
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)01-0022-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 01. 006
Effect of Salvia miltiorrhiza Bunge． f． alba extract on cell cycle and apoptosis of
endothelial progenitor cells injured by LPS
JIAO Peng， YANG Na-na， TANG Yu-jing， QIN Shu-cun*
(Institute of Arteriosclerosis，Taishan Medical College，Taian 271000，China)
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中 成 药
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Vol． 36 No． 1
ABSTＲACT:AIM To explore the effect of Salvia miltiorrhiza Bunge． f． alba extract on the cell cycle and apopto-
sis of endothelial progenitor cells injured by lipopolysaccharide (LPS)． METHOD The injury to endothelial pro-
genitor cells was induced by 10μg /mL LPS and Salvia miltiorrhiza Bunge. f. alba extract had been intervening in
endothelial progenitor cells． Changes of cellular morphology were detected with microscope． The viability of the
cells in each group was examined by MTT method． Flow cytometry Annexin V /PI staining was used for apoptotic
changes and PI staining for analysis of the effect of the cell cycle． ＲESULTS Compared with the control group，
LPS decreased the proliferative activity and increased the rate of cell apoptosis． Flow cytometry PI staining showed
there were more cells arrested at G0 /G1 stage and less cells at S stage in LPS damage group，rather the other way
around in Salvia miltiorrhiza Bunge． f． alba extract group． CONCLUSION Salvia miltiorrhiza Bunge． f． alba ex-
tract may have significant protective effect on the endothelial progenitor cells injured by LPS and related to the pro-
tection of normal cell cycle and the decrease in the cell apoptosis．
KEY WOＲDS:Salvia miltiorrhiza Bunge． f． alba;endothelial progenitor cells;cell cycle;apoptosis;proliferation
我国近年来动脉粥样硬化的发病率呈现逐年上
升和年轻化趋势［1］。血管内皮细胞功能受损是导
致动脉粥样硬化形成的始动环节，保护血管内皮功
能是防治动脉粥样硬化的重要手段之一［2-3］。内皮
祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管
细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到
外周血参与损伤血管的修复［4-5］。丹参是唇形科鼠
尾草属植物，是治疗心脑血管病的常用中药，其活
性成分主要包括脂溶性和水溶性两大类，这两类成
分在动脉粥样硬化发生的各个阶段均具一定作
用［6］。本研究所使用的白花丹参采自泰山，属稀
有罕见的名贵中药材，是丹参族中的极品。本实验
拟在脂多糖致血管内皮祖细胞损伤模型上研究白花
丹参水溶性提取物对受损内皮祖细胞的影响。
1 材料
1. 1 药物和细胞 白花丹参 Salvia miltiorrhiza
Bunge． f． alba采自泰山，白花丹参提取物的制备和
人脐血内皮祖细胞的培养和鉴定参照本课题组发表
的文献，即参考文献 ［7］。
1. 2 试剂 EBM-2 培养基购自 Lonza 公司;MTT，
PI，AnnexinV /PI染色试剂盒均购自南京凯基生物
科技公司;脂多糖，DMSO购自 Sigma公司。
1. 3 仪器 流式细胞仪 (BD FACSCalibur，美
国)，ＲE-52A 型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器
厂) ，SHBⅢ型循环水式多用真空泵 (郑州长城科
工贸有限公司) ，酶标仪 (550 型，美国 BIO-ＲAD
公司)，图 像 分 析 系 统 Lasersharp2000 软 件
(v4. 5. 3，美国 BIO-ＲAD公司)。
2 方法
2. 1 实验分组 将体外培养的脐血内皮祖细胞随
机分为 3 组:正常对照组不予任何处理，脂多糖损
伤组用 10 μg /mL 脂多糖处理 12 h诱导内皮祖细胞
损伤，白花丹参干预组用脂多糖诱导内皮祖细胞损
伤后用不同质量浓度 (0. 2、0. 4、0. 8 g /L)白花
丹参提取物干预 12 h。
2. 2 细胞活力的检测 将处于对数生长期的细胞
以 1. 2 × 104 个 /孔的密度加入 96 孔板中，每孔 100
μL培养基，每组设 6 个复孔，生长过夜后，分别
按以上分组处理，12 h 后弃原培养基，各孔加入
含 0. 5 mg /L MTT的培养液，继续孵育 4 h 后弃上
清，每孔加 DMSO 150 μL，充分振荡 30 min 后在
490 nm测定每孔的吸光度 A 值，对结果进行统计
分析。
2. 3 细胞凋亡的检测 按分组处理细胞后，分别
收集各组漂浮细胞和用胰酶消化下的细胞，PBS 洗
2 次，1 100 r /min离心 5 min 后去上清，按照试剂
盒的说明书进行 AnnexinV /PI 染色后，立即进行流
式细胞仪检测，实验重复 3 次。
2. 4 流式细胞仪检测细胞周期 胰酶消化实验组
和对照组细胞制备单细胞悬液，加入 75%的冰乙
醇，4 ℃固定过夜，1 100 r /min 离心 5 min，细胞
用 PBS洗 2 次后加入 10 μg /mL 的 ＲNaseA，37 ℃
作用 30 min，加入 10 μg /mL 的碘化丙啶染料，4
℃闭光染色 30 min 后上机检测，用 CellQuest 软件
获取细胞后用 Modifit 软件分析各组细胞的周期分
布，分析 G0 /G1 期、S 期和 G2 /M 期细胞所占
比例［8］。
2. 5 统计学处理 实验数据以 x ± s 表示。采用
SPSS 11. 5 软件包对实验数据进行分析。
3 结果
3. 1 内皮祖细胞的活力检测 不同质量浓度白花
丹参提取物对脂多糖损伤后内皮祖细胞活力的影
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响见图 1。结果显示，10 μg /mL 脂多糖作用内皮
祖细胞后，细胞活力受到明显的抑制，不同质量
浓度白花丹参干预后细胞活性高于单纯损伤组，
白花丹参提取物质量浓度在 0. 8 g /L 时达到最大
效应(图 1)。
与正常对照组比较，* P ＜ 0. 01;与脂多糖损伤组比较， #P ＜
0. 05，# # P ＜ 0. 01 (图 3 同)
1. 正常对照组 2. 脂多糖损伤组 3. 0. 2 g /L白花丹参 +脂多
糖 4. 0. 4 g /L 白花丹参 +脂多糖 5. 0. 8 g /L 白花丹参 + 脂
多糖
图 1 内皮祖细胞的活力检测
Fig. 1 Endothelial progenitor cells viability test
3. 2 内皮祖细胞的凋亡检测 内皮祖细胞的凋亡
通过流式细胞仪 AnnexinV-FITC /PI 染色法来检测。
结果如图 2，AnnexinV-FITC /PI 凋亡检测结果表
明，没有经过处理的内皮祖细胞只有一小部分细胞
发生凋亡，而 10 μg /mL 脂多糖与内皮祖细胞孵育
12 h后能明显诱导细胞凋亡，而 0. 8 g /L白花丹参
处理后能明显抑制脂多糖引起的细胞凋亡 (图 2)。
3. 3 内皮祖细胞的周期检测 流式细胞仪检测不
同分组处理后内皮祖细胞的 DNA 水平揭示了内皮
祖细胞周期分布的变化。如图 3，10 μg /mL 脂多
糖处理细胞后，G0 /G1 期细胞比率较正常对照组明
显增加，S期细胞百分比低于对照组 (P ＜ 0. 01)。
因此，脂多糖对内皮祖细胞生长的抑制作用可能是
通过 G0 /G1 期阻滞来实现的。与模型组比较，白花
丹参组细胞 G0 /G1 期细胞比率降低，S 期及 G2 /M
期细胞比率均增加，0. 8 g /L 白花丹参处理后，S
期细胞比率与模型组比较有显著差别，且白花丹参
提取物高、低质量浓度药物组的 G0 /G1 期与正常
图 2 流式细胞仪 AnnexinV-PI双染检测内皮祖细胞的凋亡率
Fig. 2 Flow cytometry Annexin V-PI double staining detected apoptosis of endothelial progenitor cells
A. 直方图 B. 柱状图 (显示 3 次试验统计结果)
图 3 流式细胞仪 PI染色不同分组处理后内皮祖细胞的周期分布
Fig. 3 PI staining flow cytometry detection of different groups of endothelial progenitor cycle distrihution
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对照组差异无统计学意义 (P ＞ 0. 05)。见流式细
胞仪 PI染色 DNA 倍体分析结果 (图 3A)及统计
分析结果 (图 3B)。
4 讨论
从学术角度分析，内皮祖细胞的概念虽然提出
仅仅十几年，但研究进展迅速，业已证明内皮祖细
胞在血管内皮系统保护和损伤修复中发挥关键作
用［9-10］。本课题组的前期工作已经证明氧化低密度
脂蛋白可以损伤内皮祖细胞的功能，而新近有文献
报道丹参提取物可以提升外周血中内皮祖细胞的数
量［11］。国内研究发现丹参对高胆固醇血症患者外
周血内皮祖细胞数量无显著影响但显著提高内皮祖
细胞的功能，但其机制尚不清楚［12］。因此，丹参
对心血管系统的保护作用，可能部分地与增加了内
皮祖细胞数量、提高其功能有关，极有可能亦促进
内皮祖细胞的损伤修复功能［13］。
丹参中水溶性的活性成分主要为酚酸类化合
物，Chan等研究发现，在丹参水提物修复内皮细
胞功能失调的过程中，不同类型的成分表现出较大
差异，水提物的作用效果优于丹参素、原儿茶酸等
化学单体［14-15］。本研究在前期研究工作的基础上，
在动脉粥样硬化的独立危险因素之一脂多糖致血管
内皮祖细胞损伤模型上，进行拓展性研究，评价动
脉粥样硬化的危险因素存在下白花丹参对受损内皮
祖细胞的保护作用。本实验观察到泰山白花丹参水
提物在 MTT实验中所获得的最强药效浓度下对脂
多糖 (10 μg /mL)诱导的内皮祖细胞凋亡具有明
显的抑制作用而且对脂多糖造成的细胞周期阻滞现
象有明显改善作用，为白花丹参发展为血管保护药
物提供新的实验数据和理论依据。由于中药在使用
过程中多以复合物而非纯品的形式存在，丹参在体
内可能涉及到多种成分的相互作用，因此多种丹参
成分之间的协同作用机制在动脉粥样硬化治疗过程
中具有更加重要的意义。
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