全 文 ：· 1614 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (11): 1614−1620



白花丹参 HDS 基因的全长克隆与原核表达分析
姜 丹 1, 2, 荣齐仙 2, 袁庆军 2, 张文婧 1, 2, 张永清 1*, 黄璐琦 2*
(1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250355;
2. 道地药材国家重点实验室培育基地, 中国中医科学院中药资源中心, 北京 100700)
摘要: 根据丹参转录组数据库提供的基因片段设计特异性引物, 采用逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 方法,
从白花丹参中克隆 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶基因的全长 cDNA 序列, 命名为 SmHDS, GenBank
注册号 KJ746807。序列长度为 2 529 bp, 含有 2 229 bp的开放阅读框, 推测编码 742个氨基酸, 含有 170 bp的
5 UTR和 130 bp的 3 UTR。利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析, 得出 SmHDS与紫花丹参 HDS
的亲缘关系较近。原核表达分析结果表明 SmHDS在大肠杆菌中表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白, 同时对
影响蛋白表达的 4个因素, 即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的密度 (A600) 进行了优化, 得出
SmHDS蛋白表达的最佳条件为: 温度 30 ℃、诱导时间 20 h、IPTG终浓度 0.2 mmol·L−1、宿主菌的密度 (A600) 值
为 0.6。这为进一步研究 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶在丹参酮类化合物生物合成途径中的作用提
供了理论依据。
关键词: 白花丹参; HDS; 全长克隆; 原核表达
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 11-1614-07
Cloning and prokaryotic expression analysis of HDS from
Salvia miltiorrhiza bge.f.alba.
JIANG Dan1, 2, RONG Qi-xian2, YUAN Qing-jun2, ZHANG Wen-jing1, 2,
ZHANG Yong-qing1*, HUANG Lu-qi2*
(1. College of Pharmacy, Shangdong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;
2. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica,
China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Abstract: According to the designed specific primers of gene fragment based on the Salvia miltiorrhiza
transcriptome data, with the method of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), this study
cloned full-length cDNA sequence of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase gene from Salvia
miltiorrhiza bge.f.alba, this sequence is named as SmHDS and its GenBank registration number is KJ746807.
SmHDS, 2 529 bp long, contains an ORF of 2 229 bp, encodes 742 amino acids, including 5 UTR 170 bp and
3 UTR 130 bp. Using bioinformatics software, having made a homology analysis of the obtained sequence, we
can have a conclusion that SmHDS have a close genetic relationship with HDS of Salvia miltiorrhiza. Analysis
result of prokaryotic expression revealed that in Escherichia coli, SmHDS expressed target proteins which in
size are comparable with the protein predicted. Meanwhile, the 4 factors which can influence the protein
expression were optimized, the 4 factors are inducing temperature, inducing time, IPTG concentrations and
density of inducing host bacterium (A600). The optimal expression conditions of SmHDS were 30 ℃ until the

收稿日期: 2014-05-27; 修回日期: 2014-07-02.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81202872); 国家杰出青年科学基金项目 (81325023).
*通讯作者 Tel: 86-10-84044340, Fax: 86-10-84027175, E-mail: huangluqi01@126.com; zyq622003@126.com
姜 丹等: 白花丹参 HDS基因的全长克隆与原核表达分析 · 1615 ·

A600 is 0.6, and add IPTG to a final concentration of 0.2 mmol·L−1, and the induction time of 20 h. It provides
theoretical basis for the further study of the function of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate
synthase in the biosynthesis of tanshinone compounds.
Key words: Salvia miltiorrhiza bge.f.alba.; HDS; cloning; prokaryotic expression

萜类化合物是自然界中最大的家族之一, 是由
细胞质中的甲羟戊酸途径 (MVA) 和质体中甲基赤
藓醇-4-磷酸途径 (MEP) 合成的 [1−3]。羟甲基丁烯
基-4-磷酸合成酶 (HDS, 又名 1-hydroxy-2-methyl-2-
(E)-butenyl-4-diphosphate synthase 或 GCPE 或 IspG,
EC 1.17.4.3) 催化 2-C-甲基赤藓醇-2, 4-环焦磷酸 (2-
C-methylerythritol 2, 4-cyclodiphosphate, ME-cPP) 转
化生成羟甲基丁烯基-4-磷酸 (hydroxymethylbutenyl
4-diphosphate, HMBPP), 属于 GCPE蛋白家族, 定位
在质体中。目前已经从番茄[1]、拟南芥[4]、长春花[5]、
银杏[6]等植物中克隆出 HDS 基因并对其功能进行了
研究, Altincicek 等[7]、Campos 等[8]在对大肠杆菌的
HDS 的功能研究中, 发现 HDS 是大肠杆菌生长所必
需的基因; Ginis等[9]对长春花 HDS的功能研究发现,
HDS 主要在叶脉的维管束处表达, HDS 的启动子可
以与具有 cis-元件的转录因子特异性的结合, 进而调
控萜类物质前体的合成; 同时对拟南芥突变体 CSB3
的研究也得出, 在MEP代谢途径中 HDS起控制代谢
流的作用, 而且还参与植物的防御机制[10]。丹参酮类
化合物属于二萜醌类化合物, 主要通过 MEP 途径合
成, 所以 HDS 在调控丹参酮类化合物合成中起着非
常重要的作用。
白花丹参 (Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba C.Y.Wu
et H.W.Li) 为唇形科鼠尾草属植物, 是紫花丹参的白
花变型, 研究证明, 白花丹参与紫花丹参的化学成分
基本相同, 含有水溶性成分酚酸类和脂溶性成分丹
参酮类, 但白花丹参水溶性成分明显高于紫花丹参,
约为紫花丹参的 2倍。另外白花丹参中铁、锰、镁等
5种微量元素也高于紫花丹参[11]。因此, 白花丹参具
有重要的医药和经济价值。
本研究以白花丹参为材料, 通过 RT-PCR 的方
法从白花丹参根中获得 SmHDS全长 cDNA序列, 并
构建 pET32a(+)-SmHDS 重组质粒, 转化到大肠杆菌
BL21(DE3) 中进行诱导表达, 对影响蛋白表达的 4个
关键因素: 即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导
时宿主菌的密度 (A600) 进行了优化, 这为进一步研
究 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶在丹参
酮类化合物生物合成途径中的作用提供了理论依据。
材料与方法
材料 白花丹参组培苗、原核表达载体pET32a(+)
为本实验室保存; Trizol 试剂购自 Invitrogen 生物技
术有限公司; 分子质量标准 DL10000 购自 TaKaRa
公司; pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、预染蛋白
Marker 购于北京全式金生物技术有限公司; 反转录
试剂盒购自 Fermentas公司; T4 DNA连接酶、Phusion
超保真 DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶购于 NEB
公司; 氨苄霉素、β-巯基乙醇、IPTG 等化学试剂购
于 Sigma公司; 其他生化试剂均为国产分析纯; 引物
合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。
总 RNA 的提取、检测及 cDNA 的合成 称取
100 mg 白花丹参组培苗的根, 在液氮中研磨, 利用
Trizol 试剂进行总 RNA 的提取, 通过 1% 琼脂糖电
泳检测 RNA的质量。以白花丹参的总 RNA为模板,
oligo (dT) 为引物, 反转录合成 cDNA。
SmHDS 基因的全长克隆 根据丹参转录组数
据库, 用 Primer Premier 5.0 软件设计基因特异性引
物。上游引物: 5-CCTCTGAGTTGGCTTCACTATCT-
3, 下游引物: 5-CAAAATGATGATAAGGTAGCTGC
TC-3, 以反转录的 cDNA 为模板进行扩增。将回收
的特异性扩增片段克隆到 pEASY-Blunt Simple 载体
中, 转化到大肠杆菌 DH5α 上, 挑取阳性克隆进行测
序分析。
将获得的序列在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/) 数据库中, 通过 Blast 搜索蛋白质和核苷酸数
据库进行序列比对和分析, 使用 ORF Finder (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 查找开放阅读
框 (ORF)。采用 Interpro (http://www.ebi.ac.uk/Tools/
InterProScan/) 进行结构域比对, ExPASy在线服务器
的 Compute PI/Mw (http://web.expasy.org/compute pi/)
预测相对分子质量与理论等电点, TargetP 1.1 server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 进行信号肽
分析, Psort (http://psort.hgc.jp/) 和 Wolfpsort (http://
wolfpsort.org/) 分析亚细胞定位, TRMHMMserver v2.0
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 进行跨
膜域分析, predictprotein (http://www.predictprotein.org/)
进行二级结构预测, SWISS-MODEL (http://swissmodel.
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expasy.org/) 进行三维同源建模。用 BioEdit 软件进
行氨基酸序列多重比对, 并参照 NCBI数据库中已公
布的不同物种 (表 1) 来源的HDS的氨基酸序列通过
MEGA5.10软件构建系统进化树, Bootsrap重复次数
为 1 000次, 进行聚类分析。

Table 1 The source of different species of HDS amino acid
sequence
Species Genbank
Salvia miltiorrhiza JN831098.1
Picrorhiza kurrooa AHA11129.1
Camellia sinensis AFQ98370.1
Hevea brasiliensis BAF98296.1
Morus notabilis EXB74654.1
Theobroma cacao XP_007016723.1
Rauvolfia verticillata ADX06907.1
Catharanthus roseus AAO24774.1
Solanum lycopersicum NP_001234648.1
Pyrus bretschneideri AHM26645.1
Stevia rebaudiana ABG75916.2
Siraitia grosvenorii AEM42998.1
Arabidopsis thalianal NP_851233.1
Medicago truncatula XP_003597228.1
Artemisia annua ACT64770.1
Ginkgo biloba ABB78087.1
Oryza sativa Japonica Group NP_001047365.1
Physcomitrella patens XP_001766565.1
Chlamydomonas reinhardtii XP_001690937.1

原核表达载体的构建 对获得的序列进行分析,
设计上游引物 : 5-ttttttgtcgacaaATGGCGACTGGAG
CTGTTCCG-3 (小写字母划线处为 SalⅠ酶切位点);
下游引物 : 5-ttttttttgcggccgcCTCCTCCACTGGTGG
ATCCA-3 (小写字母划线处为 NotⅠ酶切位点)。以
pEASY-Blunt-SmHDS 质粒为模板进行扩增 , 回收
PCR 产物, 用 SalⅠ和 NotⅠ对带有酶切位点的 PCR
产物和表达载体 pET32a(+) 分别进行双酶切, 切胶
回收目的片段与线性化 pET32a(+) 载体片段 , 用
T4DNA 连接酶 16 ℃连接过夜。将连接产物转化到
DH5α 感受态细胞上, 在含氨苄霉素的 LB 培养板上
(终浓度为 100 mg·L−1) 37 ℃培养过夜。挑取单克隆
进行菌液 PCR检测, 双酶切鉴定, 测序。
重组质粒的原核表达及条件优化 将鉴定正确
的重组质粒和表达载体 pET32a(+) 分别转化到大肠杆
菌 BL21(DE3) 中, 挑取重组菌的单菌落接种至含有
氨苄霉素的 LB液体培养基中, 37 ℃培养过夜。然后
按照 1∶100比例稀释到含有氨苄霉素的 LB液体培养
基中, 保持诱导时间 6 h、IPTG浓度为 0.4 mmol·L−1
及 A600为 0.6 不变, 选择 4 个不同的温度 (20、25、
30、37 ℃) 对诱导温度进行优化; 保持诱导温度 30 ℃、
IPTG浓度 0.4 mmol·L−1及 A600为 0.6不变, 选择 4个
时间点 (3、6、8、20 h) 对诱导时间进行优化; 保持
诱导温度 30 ℃、诱导时间 6 h及 A600为 0.6不变, 选
择 4个不同浓度的 IPTG (0.2、0.4、0.8、1.0 mmol·L−1)
对 IPTG浓度进行优化; 保持诱导温度 30 ℃、诱导时
间 6 h及 IPTG浓度 0.4 mmol·L−1不变, 选择诱导时宿
主菌的密度 (A600) 值 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0) 对
A600 进行优化, 分别考察 4 个因素对蛋白表达的影
响。表达后将菌液 5 000 r·min−1离心 10 min, 收集菌
体, 弃上清液后, 加 500 µL双蒸水, 5 000 r·min−1离心
10 min, 收集菌体, 弃上清液后, 每管加入 80 µL双
蒸水、20 µL 5×SDS加样缓冲液悬浮菌体, 95 ℃水浴
5 min, 冰浴 2～3 min, 10 000 r·min−1离心 5 min取上
清液, 用 10% 的 SDS-PAGE 进行分析。电泳完毕后
用考马斯亮蓝 R250 染色 2 h, 然后脱色至条带清
晰, 扫描图片并保存。

结果与分析
1 目的基因的克隆与生物信息学分析
通过已知的丹参转录组数据库中 HDS 基因核
心序列设计特异性引物, 扩增出大约 2 500 bp左右的
条带 (图 1), 与期望大小一致。切胶回收该片段, 将
其与 pEASY-Blunt载体连接, 挑取单克隆, 进行菌液
PCR后, 阳性克隆送至华大基因公司测序。


Figure 1 Agarose gel electrophoresis of pET32a(+)-SmHDS
and pET32a(+) by SalⅠ and NotⅠ digestion. M: DL10000
DNA marker; 1: SmHDS; 2: pET32a(+)-SmHDS by SalⅠ and
NotⅠ digestion; 3: pET32a(+) by SalⅠ and NotⅠ digestion

利用 SeqMan软件对获得的序列进行拼接, 得到
全长为 2 529 bp的 cDNA序列, 通过 ORF finder寻找
姜 丹等: 白花丹参 HDS基因的全长克隆与原核表达分析 · 1617 ·

该基因的开放阅读框, 结果显示在 171～2 399 bp处
包含一个 2 229 bp 的 ORF 框, 包含 170 bp 的 5 非
翻译区和 130 bp 的 3 非翻译区, 推断其编码 742 个
氨基酸。将此基因的 ORF 序列通过 Blast 在线比较,
结果显示该序列与紫花丹参、库洛胡黄连的 HDS 核
酸序列相似性分别为 99.73% 和 84.78%, 氨基酸序列
相似性分别为 99.87% 和 90.78%。因此可推断获得的
cDNA 序列编码的应为一个 HDS 蛋白, 将该基因命
名为 SmHDS, Genbank注册号为 KJ746807。
2 理化性质与 3D结构预测
利用 DNAMAN软件对 SmHDS氨基酸序列的分
析表明, 其蛋白质分子质量为 82.4 kDa, 等电点 (pI)
为 6.24, 表明该蛋白为酸性蛋白。包括 104个酸性氨
基酸 (D, E)、93个碱性氨基酸 (K, R)、251个疏水氨
基酸 (A, I, L, F, W, V) 及 156个极性氨基酸 (N, C,
Q, S, T, Y)。亚细胞定位结果表明定位于叶绿体。信
号肽分析表明为非分泌蛋白, 无信号肽, 跨膜域分析
为非膜蛋白。
SmHDS 二级结构分析结果表明, 该蛋白的二级
结构中 37.32% 为 α-螺旋结构 (helix)、20% 为 β-折叠
结构 (sheet)、42.68% 为反转结构 (loop), 说明反转结
构是 SmHDS 蛋白质二级结构的骨架。利用 SWISS-
MODEL 进行三维结果预测发现, SmHDS 预测编码
蛋白质二级结构与三级结构预测结果相符合 (图 2),
该模型以炭疽杆菌 (Bacillus anthracis) 4mwa.2.D蛋
白为模板, 序列同源性为 45.53%, 用于建立该模型
的氨基酸残基范围为 84～362位。

Figure 2 The predicted protein tertiary structure of SmHDS

3 SmHDS编码蛋白的分子系统进化分析
白花丹参 HDS与 GenBank中的 19种植物的 19
种蛋白进行比对分析, 在软件 MEGA5.1 平台上采用
相邻连接法构建进化树, 进行聚类分析。如图 3所示,
白花丹参 HDS与紫花丹参 HDS聚为一支, 其次与库
洛胡黄连的关系较近, 与植物类聚为一大支, 与苔藓
和绿藻关系最远。
4 pET32a(+)-SmHDS 原核表达载体的构建和重组
质粒的鉴定
用 SalⅠ和 NotⅠ双酶切 SmHDS基因片段, 将该
片段插入到经 SalⅠ和NotⅠ酶切处理的 pET32a(+) 载
体上, 命名为 pET32a(+)-SmHDS; 将其转化至大肠杆
菌 BL21 (DE3) 中, 挑取单克隆若干进行菌液 PCR检
测, 双酶切鉴定有2 229 bp的目标基因片段 (图1); 重
组质粒经再次测序表明, 与所克隆的 HDS 基因 ORF


Figure 3 Phylogenetic tree of SmHDS and their related sequences (value for condensed tree ≥50 %)
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序列完全一致, 未发生移码突变。
5 pET32a(+)-SmHDS原核表达条件的优化
5.1 诱导温度对 pET32a(+)-SmHDS 表达条件的影
响 保持诱导时间 6 h、IPTG浓度为 0.4 mmol·L−1及
A600为 0.6不变, 选择 4个不同的温度 (20、25、30、
37 ℃), 得出温度对 pET32a(+)-SmHDS的表达影响较
明显, 在 20～37 ℃均能够进行重组蛋白的表达, 但
在 20 ℃时蛋白的表达量比较少, 而 37 ℃时蛋白表达
量虽然有所增加, 但和 30 ℃表达量相比却有所降低
(图 4)。表明该蛋白表达的最合适的温度为 30 ℃。


Figure 4 SDS-PAGE of analysis for pET32a(+)-SmHDS in
different temperatures. M: Protein marker; C1−C4: pET32a(+)
at 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃ and 37 ℃, respectively; 1−4: pET32a(+)-
SmHDS at 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃ and 37 ℃, respectively

5.2 诱导时间对 pET32a(+)-SmHDS 表达条件的影
响 保持诱导温度 30 ℃、IPTG浓度 0.4 mmol·L−1及
A600为 0.6 不变, 研究诱导时间对 pET32a(+)-SmHDS
表达的影响, 选择 4个时间点 (3、6、8、20 h) 进行
诱导表达, 得出随着诱导时间的延长, 蛋白表达量也
不断增加, 在诱导 20 h时蛋白表达量最高 (图 5), 说
明诱导时间的延长有利于目的蛋白的表达。
5.3 IPTG 浓度对 pET32a(+)-SmHDS 表达条件的
影响 保持诱导温度 30 ℃、诱导时间 6 h 及 A600
为 0.6 不变, 选择 4 个不同浓度的 IPTG (0.2、0.4、
0.8、1.0 mmol·L−1) 进行诱导表达, 得出随着 IPTG
浓度的增加, 蛋白表达量却降低, 当 IPTG 浓度在
0.2 mmol·L−1 时蛋白表达量最高 , 说明高浓度的
IPTG 不能增加蛋白的表达, 低浓度的 IPTG 浓度反
而有利于 SmHDS表达 (图 6)。
5.4 A600对 pET32a(+)-SmHDS 表达条件的影响 保
持诱导温度 30 ℃、诱导时间 6 h 及 IPTG 浓度 0.4
mmol·L−1 不变, 选择诱导时宿主菌的密度 (A600) 值

Figure 5 SDS-PAGE of analysis for pET32a(+)-SmHDS in
different induction time. M: Protein marker; C1−C4: pET32a(+)
with induction 3, 6, 8, 20 h, respectively; 1−4: pET32a(+)-
SmHDS with induction 3, 6, 8, 20 h, respectively


Figure 6 SDS-PAGE of analysis for pET32a(+)-SmHDS in
different IPTG induction concentrations. M: Protein marker;
C1−C4: pET32a(+) induced in 0.2, 0.4, 0.8 and 1.0 mmol·L−1
IPTG, respectively; 1−4: pET32a(+)-SmHDS induced in 0.2, 0.4,
0.8 and 1.0 mmol·L−1 IPTG, respectively

(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0) 进行诱导表达, 得出宿主
菌的密度对蛋白表达量影响不明显, A600为 0.6 时效
果较好 (图 7)。
综上所述, 本研究通过 RT-PCR从白花丹参根中
获得 SmHDS 全长 cDNA 序列, 长度为 2 529 bp, 包
含一个 2 229 bp 的 ORF 框, 包含 170 bp 的 5 非翻
译区和 130 bp 的 3 非翻译区, 推断其编码 742 个氨
基酸, 与紫花丹参 HDS 的序列相似性最高。同时构
建 pET32a(+)-SmHDS 重组质粒 , 转化到大肠杆菌
BL21(DE3) 中进行诱导表达, 对影响蛋白表达的 4个
关键因素: 即诱导温度、诱导时间、IPTG 浓度和诱
导时宿主菌的密度 (A600) 进行了优化, 最佳表达体系
为: 诱导温度 30 ℃; 诱导时宿主菌的密度 (A600) 为
0.6; IPTG终浓度 0.2 mmol·L−1; 诱导时间 20 h。这为
姜 丹等: 白花丹参 HDS基因的全长克隆与原核表达分析 · 1619 ·

进一步研究 HDS的催化功能提供了理论依据。


Figure 7 SDS-PAGE of analysis for pET32a(+)-SmHDS in
different culture densities before IPTG induction. M: Protein
marker; C1−C5: pET32a(+) induced in 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0
A600, respectively; 1−5: pET32a(+)-SmHDS induced in 0.2, 0.4,
0.6, 0.8 and 1.0 A600, respectively

讨论
丹参对治疗心脑血管疾病、抗氧化和肝损伤保
护 [12]都有显著疗效, 其药理活性成分基本清楚, 作
为最常用的中药之一。此外由于丹参基因组小、染色
体数目少、组织培养和转基因技术成熟、时代周期短、
生命力强的特点, 已成为中药研究的理想药用模式
植物, 为国际传统药物学研究提供模式平台[13, 14]。
本实验分别构建了 pET32a(+)-SmHDS和 pET28a
(+)-SmHDS 重组质粒, 但是在后期的诱导表达中, 发
现 pET32a(+)-SmHDS 表达出的蛋白量较高 , 而
pET32a(+) 属于带有 N-端硫氧还蛋白 (trxA·Tag) 编
码序列融合表达载体, 在 E.coli 中以不溶形式存在
的蛋白, 当和 trxA·Tag序列融合后, 可增加表达蛋白
的溶解性[15]; 此外, 表达宿主菌 BL21(DE3) 可以增
加存在于细胞质中蛋白质的二硫键的形成, 使得蛋
白的可溶性更好[16]。大肠杆菌是常用的融合蛋白质
表达系统之一, 影响融合蛋白表达的因素是多方面
的, 除了合理的选择酶切位点、表达载体、宿主菌、
试剂外, 还可以通过改变培养条件来提高蛋白表达
量, 如改变诱导温度[17]、诱导时间[18]、IPTG 浓度[19]
和诱导时宿主菌的密度[20] (A600) 等。诱导温度对白花
丹参 SmHDS 重组蛋白表达量有明显影响, 在 20 ℃
时蛋白的表达量最少, 不利于蛋白表达, 37 ℃时蛋白
表达量虽然有所增加, 但和 30 ℃表达量相比却有所
降低, 37 ℃培养可能会使一些蛋白积累形成包涵体,
30 ℃培养会形成可溶的、有活性的蛋白[21]。随着诱
导时间的延长, 白花丹参 SmHDS的表达量也随之增
加, 3 h时蛋白表达量过低, 6 h与 8 h时蛋白表达量
没有明显区别, 为了加快实验的周期性, 可以选择 6 h
作为诱导时间。IPTG浓度在 0.2～1.0 mmol·L−1对表
达量影响明显, 随着 IPTG 浓度的增加, 蛋白表达量
却随着减少, IPTG浓度在 0.2 mmol·L−1时蛋白表达量
最高, 原核生物的转录和翻译是同时进行的, 由于较
低的 IPTG 浓度使局部的表达蛋白浓度不会太高, 缓
慢转录使得翻译的蛋白有条件正确的折叠, 因而能
得到较多的可溶性蛋白。
本研究通过 RT-PCR 技术扩增了白花丹参的
HDS, 并在大肠杆菌中得到了成功的表达, 进行了表
达体系的优化, 在诱导温度 30 ℃、诱导时宿主菌的
密度 (A600) 为 0.6、IPTG终浓度 0.2 mmol·L−1、诱 导
20 h 中 SmHDS 能够得到很好地表达。然而, 对于
SmHDS催化功能以及对丹参酮类成分生物合成调控
机制, 还有待于下一步的深入研究。
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