全 文 ：猪殃殃抗苯磺隆分子机制研究
张乐乐，李 琦，郭文磊，李 伟，王金信
（山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018）
摘 要：近几年，河南省各地抗苯磺隆猪殃殃(Galium aparine)发生严重，常规剂量苯磺隆已无法防治。
为了明确猪殃殃产生苯磺隆抗性的分子机制，通过提取总DNA、ALS基因扩增和基因测序的方法比对
抗性及敏感种群的ALS保守区序列，明确抗性种群ALS基因突变位点。相比于敏感猪殃殃，抗性种群
的高度保守区(Domain A)197位脯氨酸(Pro)突变为苏氨酸(Thr)和亮氨酸(Leu)，非保守区 457苏氨酸
(Thr)突变为丝氨酸(Ser)3种突变形式。其中，猪殃殃对苯磺隆产生抗药性的原因可能是其197位氨基酸
发生突变。
关键词：猪殃殃；乙酰乳酸合成酶抑制剂；抗药性；基因突变
中图分类号：S481.4 文献标志码：A 论文编号：casb16020069
Molecular Mechanism of Galium aparine Resistance to Tribenuron-Methyl
Zhang Lele, Li Qi, Guo Wenlei, Li Wei, Wang Jinxin
(College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Tai’an Shandong 271018)
Abstract: In recent years, the tribenuron-methylin resistant Galium aparine was serious throughout Henan
Province, and common dose of tribenuron-methyl cannot control Galium aparine any more. The objective of
this study is to understand the molecular mechanism of the Galium aparine resistance to tribenuron-methyl.
Through total DNA extraction, ALS clone and sequencing, the authors found the specific mutation sites in
amino acid sequence of acetolactate synthase (ALS) in the resistant biotype of Galium aparine. Compared with
the susceptible biotype, there were three types of amino acid substitutions in the resistant biotypes, of which,
the amino acid substitution of Pro197 (CCC) to Thr (ACC) and Pro197 (CCC) to Leu (CTC) were located in the
highly conserved region Domain A, Thr 457 (ACC) to Ser (TCC) in the non- conservative region. The
substitution of Pro197 might be the reason for the resistance in the R-biotype of Galium aparine to tribenuron-
methyl.
Key words: Galium aparine; ALS inhibitor; resistance; gene mutation
0 引言
猪殃殃为茜草科一年或越年生杂草，叶轮生，种子
繁殖。在中国，猪殃殃主要分布于黄河以南各省的稻
麦轮作区，华北地区中河南省发生和危害尤为严重，主
要危害冬小麦、冬油菜等作物[1]。近几年，由于麦田杂
草化学防治药剂单一，经过长时间选择，部分地区麦田
中猪殃殃已成长为抗药性极高的恶性杂草。
苯磺隆属于磺酰脲类除草剂，由美国杜邦公司首
先发现，作用靶标为乙酰乳酸合成酶 (acetolactate
synthase，ALS)。作为麦田阔叶杂草的重要除草剂，苯
磺隆具有用量低、低残留、选择性强、杀草谱广以及对
哺乳动物安全的优点[2-3]，但是，由于近几年该类药剂的
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项“杂草抗药性监测及治理技术研究与示范”(201303031)；国家自然科学基金面上项目“基于菵草ACCase
等位基因突变的适合度代价研究”(31471787)。
第一作者简介：张乐乐，男，1990年出生，山东东营人，硕士，研究方向为农药毒理与有害生物抗药性。通信地址：271018山东省泰安市岱宗大街61
号山东农业大学植物保护学院，E-mail：zhangzhaosheng@163.com。
通讯作者：王金信，男，1961年出生，山东胶南人，教授，博士生导师，博士，主要从事农药毒理与应用研究。通信地址：271018山东省泰安市岱宗大街
61号山东农业大学植物保护学院，Tel：0538-8241114，E-mail：wangjx@sdau.edu.cn。
收稿日期：2016-02-21，修回日期：2016-04-21。
中国农学通报 2016,32(25):110-113
Chinese Agricultural Science Bulletin
等：
大量重复使用，且乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂作
用位点单一，故北方大部分地区小麦田杂草均对该类
药剂产生了不同程度的抗药性。
目前杂草对磺酰脲类除草剂抗药性机理的研究主
要集中在除草剂的吸收与传导、除草剂代谢解毒、除草
剂作用靶标的变异3个方面[4]。其中，靶标基因的突变
是杂草对ALS抑制剂产生抗性的主要原因[5-7]。1992
年，Guttieri等[8]首次报道了毒莴苣(Lactuca serriola)和
地肤(Kochia scoparia)因197位脯氨酸突变而导致了抗
药性的产生。目前已发现8种ALS基因突变方式能够
导致杂草对ALS类抑制剂产生抗性。这些位点在拟
南芥ALS氨基酸序列中相应的位置及表达的氨基酸
分别为位于 Domain C 区域的第 122 位丙氨酸
(Ala122)，位于 Domain A 区域的第 197 位脯氨酸
(Pro197)，位于 Domain D 区域的第 205 位丙氨酸
(Ala205)，位于 Domain B 区域的第 574 位色氨酸
(Trp574)，位于 Domain E 区域的第 653 位丝氨酸
(Ser653)和第 654位甘氨酸(Gly654)，以及第 376位天
冬氨酸(Asp376)，第377位精氨酸(Arg377)[9-12]。其中报
道最多的是Domain A的Pro197位点的突变[13]。
目前，猪殃殃在北方各地小麦田对苯磺隆的抗性
已逐渐凸显，不论冬季前还是春季施药，苯磺隆对猪殃
殃的防治效果均不理想，苯磺隆常规剂量已无法有效
控制猪殃殃的发生。本研究通过对河南部分地区研究
员反映的猪殃殃发生抗性严重地块，于2014年进行了
抗性猪殃殃草种采集，针对采集的抗性及敏感猪殃殃
种群进行分子水平的探究，旨在明确导致其产生苯磺
隆抗药性的基因突变位点。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试猪殃殃于2014年采自河南省冬小麦田，包括
8个潜在抗药性生物型及 1个未用药相对敏感猪殃殃
种群生物型。采集地点及编号如下：驻马店汝南 1、2
(RN1、RN2)，南阳唐河1、2、3(TH1、TH2、TH3)，漯河源
汇区 1、2(YH1、YH2)，信阳息县 (XX)，驻马店平舆
(PY)。
供试药剂为75%的苯磺隆水分散性粒剂(WG)，上
海杜邦农化有限公司。
仪器包括：SPX型智能生化培养箱，宁波江南仪器
厂；ASS-4型自动控制农药喷洒系统，国家农业信息化
工程技术中心研制，北京盛恒天宝科技有限公司生产；
GA110型1/10000电子天平，德国赛多利斯公司。
1.2 试验方法
1.2.1 温室盆栽法 每盆面积100 cm2，对各种群猪殃殃
种子进行催芽，播种露白的种子，每盆10粒，重复3次，
置于温室内培养。温室温度白天(25±5)℃，夜间为
(15 ± 5)℃，光照强度为 15000~23500 lx，相对湿度
(75±5)%。待叶片长至3~4轮，用75%苯磺隆WG于定
量喷雾塔上进行茎叶喷雾。经预试验测试，试验中抗
性种群的苯磺隆喷施浓度为 10、50、250、750、1250、
2500 g a.i./hm2，敏感种群的喷施浓度为 0.625、1.25、
2.5、5、10、20 g a.i./hm2，21天后剪取猪殃殃地上部分，称
重，计算其鲜重抑制率，使用DPS软件求出回归方程。
1.2.2 引物的设计合成与 PCR 扩增 从 NCBI 的
GenBank登记的ALS基因序列中找到敏感猪殃殃的基
因序列，其登记号为GU377313，使用Primer Premier 5
软件设计引物序列（表1），扩增长度约为1600 bp，用温
度梯度PCR仪确定引物的最佳退火温度。
PCR 扩 增 使 用 TRANSGEN 公 司 的 试 剂 盒
EasyTaq DNA Polymerase完成，设计 50 µL反应体系
含 ：34.5 µL 的 ddH2O，0.5 µL 的 EasyTaq DNA
Polymerase，4 µL的 2.5 mmol/L dNTPs，5 µL的 10 ×
EasyTaq Buffer，2 µL的 Primer-F(10 µmol/L)，2 µL的
Primer-R(10 µmol/L)，2 µL的 Template DNA。PCR反
应条件设定为：94℃预变性 4 min，94℃变性 30 s，55℃
退火 30 s，72℃延伸 90 s，共 36 个循环，72℃延伸
10 min，最后，4℃保存。扩增产物于1%琼脂糖凝胶中
电泳检测。将 PCR扩增产物送上海生工生物工程技
术服务有限公司进行DNA序列测序工作。
1.3 数据分析
数据采用DPS进行回归分析。以猪殃殃鲜重抑
制率概率值(y)和所使用苯磺隆浓度对数值(x)建立回
归方程(y=a+bx)，求出各处理药剂对各杂草的GR50值、
95%置信限及相关系数。通过比对抗性及敏感种群的
GR50值，得到抗性种群的抗性倍数。
测序结果采用DNAMAN软件分析，比对敏感及
抗性猪殃殃ALS基因、氨基酸的差异性，同时建立与
模式植物拟南芥之间的序列数比对，观察抗性猪殃殃
ALS基因是否存在基因突变。
2 结果与分析
2.1 猪殃殃对苯磺隆抗性水平的测定
如表2所示，河南省采集的8个抗性种群相对于敏
感种群(PY)对苯磺隆均产生了不同程度的抗药性，其
引物
上游引物(F)
下游引物(R)
序列(5′-3′)
GCCACCGTAGCGCCATTA
CGGATTCCCGAGATACGTG
退火温度/℃
55
55
表1 猪殃殃ALS基因扩增引物
张乐乐等：猪殃殃抗苯磺隆分子机制研究 ·· 111
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
种群
PY
RN1
RN2
TH1
TH2
TH3
YH1
YH2
XX
生物型
S
R
R
R
R
R
R
R
R
回归方程
y=4.4038+1.1871x
y=2.4099+0.7372x
y=3.2352+0.5479x
y=3.5670+0.5354x
y=2.9743+0.8292x
y=3.0277+0.5746x
y=3.9664+0.5112x
y=3.3081+0.6793x
y=2.7909+0.6826x
GR50/(g a.i./hm2 )
3.18
3262.46
1662.49
474.94
277.29
2705.71
105.22
309.34
1722.97
95%置信区间
2.08~4.86
650.35~16366.02
402.96~6858.98
290.89~775.44
230.51~333.55
436.33~16778.40
72.18~153.39
206.80~462.74
341.50~8692.83
相关系数
0.9582
0.8882
0.8796
0.9705
0.9952
0.8523
0.9839
0.9780
0.8530
抗性倍数
1.0
1025.9
522.8
149.4
87.2
850.8
33.1
97.3
541.8
生物型
敏感生物型(PY)
RN1、TH3、XX
RN2
生物型
敏感生物型(PY)
YH1
基因位点
195
CAA（谷氨酰胺）
CAA（谷氨酰胺）
CAA（谷氨酰胺）
基因位点
455
TTC（苯丙氨酸）
TTC（苯丙氨酸）
196
GTT（缬氨酸）
GTT（缬氨酸）
GTT（缬氨酸）
456
AAG（赖氨酸）
AAG（赖氨酸）
197
CCC（脯氨酸）
ACC（苏氨酸）
CTC（亮氨酸）
457
ACC（苏氨酸）
TCC（丝氨酸）
198
CGG（精氨酸）
CGG（精氨酸）
CGG（精氨酸）
458
TTT（苯丙氨酸）
TTT（苯丙氨酸）
199
AAA（赖氨酸）
AAA（赖氨酸）
AAA（赖氨酸）
459
GGC（甘氨酸）
GGC（甘氨酸）
表2 猪殃殃对苯磺隆的抗性水平
注：R为抗性种群，均采自河南省多年苯磺隆用药小麦田；S为敏感种群，采自未使用过农药的非农田；GR50为抑制中浓度。
表3 抗性与敏感猪殃殃ALS基因及氨基酸比较
3 结论
笔者首先对河南省采集的抗性及敏感种群进行了
整株水平测定，测定的 8个抗性种群均存在对苯磺隆
不同程度的抗性，经检测，已采集的8个种群抗性倍数
在 33.1~1025.9，抗性倍数较高，这表明猪殃殃已对苯
磺隆产生了较高抗性，单一使用苯磺隆已经不能有效
防治此类猪殃殃，建议更换防治药剂，避免猪殃殃对苯
磺隆抗性水平的持续升高。其次，设计了猪殃殃ALS
基因的扩增引物，对所有种群的ALS基因进行了扩
增，其扩增长度为 1600 bp，包含已报道的所有抗性突
变位点，以明确其ALS基因突变位点及方式。最后，
通过比对NCBI中GenBank登记的敏感猪殃殃ALS基
因序列，发现RN1、TH3和XX第 197位脯氨酸(Pro)突
变为苏氨酸(Thr)；RN2第 197位脯氨酸(Pro)突变为亮
氨酸(Leu)。YH1中位于非保守区的第 457位苏氨酸
(Thr)突变为丝氨酸(Ser)。与其他位点的突变方式相
比，猪殃殃中 197位脯氨酸突变导致其对苯磺隆的抗
性更高。其中未发现已报道突变形式的RN1、RN2、
TH3、XX 4个种群，均具有对苯磺隆不同程度的抗性，
其非靶标抗性存在的可能性需进一步的研究。
4 讨论
本研究中采用的抗性猪殃殃种群采自苯磺隆用药
历史较长的河南省。在实际生产中，各地研究员普遍
反映苯磺隆防效已严重下降。彭学岗等[1]在2008年测
定的河南省猪殃殃对苯磺隆抗性倍数在1.6~4.3，经过
6年时间，猪殃殃对苯磺隆抗性水平增长迅速。孙健
等[13]检测出抗苯磺隆猪殃殃中存在574位色氨酸被甘
氨酸取代的突变方式，同时检测出非保守区 457位苏
注：加粗字体表示敏感及抗性种群突变位点的DNA序列及其氨基酸种类的比较。
中抗性倍数在 500以上的高抗性种群有 RN1、RN2、
TH3、XX 4个，其他4个种群抗性倍数在33.1~149.4。
2.2 猪殃殃ALS基因及其氨基酸信息
与敏感生物型相比较，4个较高抗性猪殃殃种群
均发生了基因突变，RN1、TH3和XX第 197位脯氨酸
(Pro)突变为苏氨酸(Thr)；RN2第 197位脯氨酸(Pro)突
变为亮氨酸(Leu)。YH1中第 457位苏氨酸(Thr)突变
为丝氨酸(Ser)（表3）。其中，第197位的2种氨基酸突
变位于高度保守区Domain A中，而第457位的氨基酸
突变位于非保守区中。
·· 112
等：
氨酸突变为丝氨酸，这与本研究检测出的非保守区基
因突变位点及突变方式一致。本研究测定的ALS氨
基酸序列包含已报道的Ala122~Trp574保守区突变位
点的氨基酸序列，检测出197位脯氨酸存在2种突变方
式，未发现其他位点的突变形式。
基因突变导致杂草抗药性的产生，目前由靶标位
点的氨基酸突变产生的杂草抗性方面的报道较多。概
括起来，一般由8个必需氨基酸中1个或几个氨基酸被
取代从而导致杂草产生对ALS抑制剂的抗性[14-18]，表
现到ALS基因中为第 122位（丙氨酸）的缬氨酸、苏氨
酸及酪氨酸突变，第 197位（脯氨酸）的组氨酸、苏氨
酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰
胺、酪氨酸、谷氨酸、天冬酰胺及异亮氨酸突变，第205
位（丙氨酸）的缬氨酸突变，第 376位（天冬氨酸）的谷
氨酸突变，第377位（精氨酸）的组氨酸突变，第574位
（色氨酸）的亮氨酸、甘氨酸及蛋氨酸突变，第 653位
（丝氨酸）的苏氨酸、天门冬酰胺及异亮氨酸突变，第
654位（甘氨酸）的天冬氨酸突变[19-23]。其中，197位突
变可导致杂草对磺酰脲类除草剂产生较高抗性[24-25]。
本研究中，测定的4个未发生保守区基因突变的种群，
需要进一步的非靶标因素测定，深入研究抗性产生原
因。同时，需要进一步研究猪殃殃产生对苯磺隆的抗
药性是否与位于457位的氨基酸突变相关。
本研究证明了河南省麦田抗性杂草猪殃殃中存在
197位脯氨酸突变为苏氨酸和亮氨酸2种突变形式，且
197位基因突变可能是导致猪殃殃产生苯磺隆高抗性
的重要原因。
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