全 文 ：北方园艺２０１４（１９）：９３～９８ ·生物技术·
第一作者简介：王阳（１９８９－），女，硕士研究生，研究方向为野生植
物引种驯化。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｏｕｎｇ０６０８＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：董然（１９６６－），女，吉林长春人，博士，教授，现主要从事
野生植物引种驯化等研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｒ９９９＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划资助项目（２０１２ＢＡＤ２２Ｂ０４０１）；
吉林省科技发展计划资助项目（２０１１０２６２）。
收稿日期：２０１４－０６－１０
东北对开蕨孢子体诱导技术的研究
王 阳，董 然，顾 德 峰，刘 美 彤
（吉林农业大学 园艺学院，吉林 长春１３０１１８）
摘 要：以东北对开蕨孢子为试材，采用无菌培养及常规繁殖的方法，研究了常规条件和无
菌条件对孢子体诱导的影响。结果表明：孢子最佳萌发培养基为１／４ＭＳ无糖培养基；最佳增殖培
养基为ＭＳ＋１５ｇ／Ｌ蔗糖；最佳孢子体无菌诱导培养基为 ＭＳ培养基；最适宜的常规诱导条件是
以草炭为最适宜基质，温度２０～３０℃，空气湿度９５％。
关键词：东北对开蕨；孢子体诱导；孢子繁殖
中图分类号：Ｓ ６８２．３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１４）１９－００９３－０６
东北对开蕨（Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｋｏｍ．）属铁角蕨科
（Ａｓｐｌｅｎｉａｃｅａｅ）对开蕨属（Ｐｈｙｌｉｔｉｓ）林下多年生常绿草本
植物，又称日本对开蕨、对开蕨，在中国仅一属一种［１］。
它的自然分布范围十分狭窄，仅少量分布于长白山南麓
和西部局部地区［２］，对生境要求严格，由于近年来环境
破坏严重且人为野外大量采挖，导致其自然储存量逐年
减少，已经濒临灭绝，是世界稀有物种，属于我国国家二
级珍稀濒危保护植物。
近年来，国内外学者就东北对开蕨已开展细胞学、
繁殖栽培及生理等方面的研究［３－１８］。该试验应用保存于
吉林农业大学苗圃基地内的东北对开蕨组培苗，进行孢
子无菌培养，研究其常规转化和无菌转化的技术，以期
为东北对开蕨的资源保护和进一步开发利用提供技术
支持。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试东北对开蕨（Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｋｏｍ．）孢子采
自吉林农业大学苗圃基地内。选取栽培３～４ａ长势健
壮良好的东北对开蕨组培苗，挑选叶片背面孢子囊群成
熟且已经变为褐色的叶片，整片剪下，置于洁净的硫酸
纸袋中，在４℃冰箱内密封保存备用。
取东北对开蕨带孢子囊叶片整片，先用蒸馏水浸泡
３０ｍｉｎ，再用脱脂棉占取饱和洗衣粉溶液擦洗叶片，要避
免触及孢子囊，然后用蒸馏水再次擦去叶片表面的洗衣
粉溶液。在超净工作台上将叶片顺着孢子囊群生长方
向切成１ｃｍ×１ｃｍ带孢子囊的小片，用含有吐温－２０的
０．１％ＨｇＣｌ２溶液浸泡４ｍｉｎ灭菌，灭菌后用无菌水冲洗
６～８次，使用无菌滤纸吸干表面分后准备接种。
１．２ 试验方法
１．２．１ 孢子的萌发 以 ＭＳ为基本培养基，设置 ＭＳ、
１／２ＭＳ、１／４ＭＳ ３个处理，分别设置０、１５、３０ｇ／Ｌ ３个蔗
糖浓度水平，共９个处理，ｐＨ ５．８，琼脂浓度７．０ｇ／Ｌ，经
过１２１℃高压蒸汽灭菌锅灭菌２０ｍｉｎ后分装至５０ｍＬ
三角瓶中。每瓶接种１片带孢子囊小叶片（图１），每个
处理２０瓶，３次重复。培养条件为温度（２５±２）℃，光照
强度１ ０００～１ ５００ｌｘ，光周期１２ｈ／ｄ。
图１ 孢子无菌接种时的状态
Ｆｉｇ．１ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｐｏｒｅ
１．２．２ 原叶体的增殖 在１．２．１的基础上，进行原叶体
的继代增殖。切取约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ原叶体团，每瓶接
种１０团，每个处理５瓶，３次重复。采用 ＭＳ为基本培
养基，ｐＨ ５．８，琼脂７．０ｇ／Ｌ。设置ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、
Ｎ６ ４个处理，分别设置０、１５、３０、６０ｇ／Ｌ ４个蔗糖浓度水
平，９０ｄ后将原叶体取出称重，记录每瓶的总鲜重后，设
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·生物技术· 北方园艺２０１４（１９）：９３～９８
置６０℃恒温烘干６ｈ，记录每瓶总干重。每天观察各处
理中原叶体的发育情况。自第１片孢子体转化成功开
始，３０ｄ后进行数据分析。
１．２．３ 孢子体的常规转化 基质的筛选：设腐殖土、草
炭、园土、河沙和混合基质（草炭∶腐殖土＝１∶１）５种基
质，基质分别过２４目筛，１２１℃高压蒸汽灭菌３０ｍｉｎ，置
于口径１２ｃｍ的塑料花盆中，底部垫少量泡沫防止积水，
放入约２／３基质后压实整平，整盆浸水直至基质表面湿
润。切取未经受精的原叶体团１ｃｍ×１ｃｍ大小，每盆均
匀栽植１０块（图２），每个处理５盆，３次重复。放入
ＧＺＸ－３５０Ｄ光照培养箱中，培养条件为１２ｈ周期性光照，
光照强度２ ０００ｌｘ，温度１５／２５℃，加保鲜膜封口保湿，每
１０ｄ喷１次水。温度的筛选：以草炭为基质，基质灭菌
方式、装盆和原叶体团的栽植同上，每个处理５盆，３次
重复。白天设置温度１５、２０、２５、３０、３５℃５个梯度，夜晚
温度均为１５℃。放入ＧＺＸ－３５０Ｄ光照培养箱中，培养条
件为１２ｈ周期性光照，光照强度２ ０００ｌｘ，温度１５／２５℃，
加保鲜膜封口保湿，每１０ｄ喷１次水。光照的筛选：以
图２ 原叶体常规转化接种时的状态
Ｆｉｇ．２ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｒｏｔｈａｌｕｓ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
草炭为基质，基质灭菌方式、装盆和原叶体团的栽植同
上，每个处理５盆，３次重复。放入ＧＺＸ－３５０Ｄ光照培养
箱中设置温度１５／２５℃，每天１２ｈ周期性，光照强度
１ ０００、２ ０００、３ ０００ｌｘ ３个光照强度，加封口膜保湿，每
１０ｄ喷１次水。相对空气湿度的筛选：以草炭为基质，基
质灭菌方式、装盆和原叶体团的栽植同上，每个处理５
盆，３次重复。试验环境条件为温室内搭建有人工生长
箱（３００ｃｍ×１５０ｃｍ×１００ｃｍ），加盖遮阳网，每个生长箱
内均装有温湿度传感器，通过ＸＭＴ－９００７温湿度控制仪
对湿度进行自动控制，用超声波加湿器来提高空气湿
度。室内温度为白天２２～２５℃，夜间１３～１５℃；光照
条件为０～７ ７００ｌｘ；棚内相对湿度设置９５％、８５％、７５％
３个湿度梯度；以温室内４０％左右的相对湿度作为对照，
每２ｄ喷１次水。以上处理自第１片孢子体转化成功开
始，记录转换日期，３０ｄ后统计其转化率。
１．２．４ 孢子体的无菌转化 无机盐浓度与蔗糖浓度的
配比：以ＭＳ为基本培养基，设置ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、Ｎ６
４个处理，分别设置０、１５、３０ｇ／Ｌ ３个蔗糖浓度，共１２个
处理，ｐＨ ５．８，琼脂７．０ｇ／Ｌ。每瓶３０片原叶体，每个处
理１０瓶，３次重复。培养条件为（２５±２）℃，光照强度
１ ０００～１ ５００ｌｘ，光周期为１２ｈ／ｄ，自第１片孢子体转化
成功开始，３０ｄ后进行数据分析。生长调节剂的配比：
将增殖后的原叶体分成２０片左右的小块，接种到分别
含有不同浓度（０、５、１０、１５、２０ｍｇ／Ｌ）ＧＡ３和不同浓度（０、
０．５、１．０、１．５、２．０）ＮＡＡ和６－ＢＡ的 ＭＳ培养基中，每瓶
接种１０块，每个处理５瓶，３次重复。自第１片孢子体
转化成功开始，３０ｄ后统计其转化率。
２ 结果与分析
２．１ 不同培养基与不同蔗糖浓度对孢子无菌培养的
影响
由表１可知，在３种不同培养基中孢子萌发率存在
差异，１／２ＭＳ与１／４ＭＳ培养基对孢子萌发率有明显的
促进作用。而蔗糖浓度对萌发时间也有着较为明显的
影响，随着蔗糖浓度的升高，３种培养基下的孢子萌发率
呈现下降趋势，不添加蔗糖的孢子萌发率最高。因此最
适宜孢子无菌萌发的培养基为１／４ＭＳ无蔗糖培养基。
表１ 不同培养基与不同蔗糖浓度对
孢子无菌培养的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａｓ ａｎｄ
ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
培养基
Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉａ
蔗糖浓度
Ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／（ｇ·Ｌ－１）
萌发时间
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ／ｄ
心形原叶体出现时间
Ｄａｙｓ ｏｆ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ／ｄ
萌发率
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ／％
０ ６５ ８０ ３７．６
ＭＳ １５ ９０ １０５ ３３．４
３０ １２０ １３０ １６．３
０ ６０ ８０ ４２．９
１／２ＭＳ １５ ８５ ９５ ４０．５
３０ １０５ １１５ ３４．６
０ ６０ ７０ ７６．２
１／４ＭＳ １５ ７０ ８０ ７２．７
３０ １００ １１５ ５５．６
２．２ 不同培养基与不同蔗糖浓度对原叶体增殖的影响
表２表明，虽然在Ｎ６培养基中，对开蕨增殖系数最
好，但原叶体结团生长，不利于进一步增殖和转化；在
１／２ＭＳ、１／４ＭＳ培养基又均出现褐化现象，因此最适宜
的增殖基本培养基为ＭＳ培养基，原叶体为深绿色，生长
平展较大（图３）。
在研究了培养基与蔗糖浓度对对开蕨孢子萌发的
影响后，接种于不同蔗糖浓度的ＭＳ培养基的原叶体团，
１０ｄ后即可长出新的原叶体，以３０ｄ为１个继代周期，
由表３可知，蔗糖浓度为１５ｇ／Ｌ的增殖系数最好，且原
叶体团始终保持翠绿色且生长良好（图３）。
４９
北方园艺２０１４（１９）：９３～９８ ·生物技术·
表２ 不同培养基对原叶体增殖的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａｓ ｔｏ
ｔｈｅ ｐｒｏｔｈａｌｕｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
培养基
Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉａ
鲜质量
Ｆｒｅｓｈ
ｗｅｉｇｈｔ／ｇ
干质量
Ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
／ｇ
增殖系数
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ
生长状态
Ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｅ
ＭＳ １２．３８±２．８４ｂ １．２８±０．２７ｂ ３．４０ 平展较大
１／２ＭＳ １２．３０±２．１５ｂ １．５７±０．１３ｂ ５．８８ 少量褐化
１／４ＭＳ １１．９０±４．９４ｂ ０．８５±０．２３ｂ ３．２９ 多褐化
Ｎ６ ２６．１０±３．５２ａ ４．８１±２．７３ａ ６．８７ 结团，生长慢
注：同一行（或同一列）不同字母的数值之间有显著差异（α＝０．０５）。下同。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｗｉｔｈｉｎ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ（ｒｏｗ）ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ（α＝
０．０５）．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图３ 原叶体增殖接种时的状态
Ｆｉｇ．３ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｒｏｔｈａｌｕｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
表３ 蔗糖浓度对原叶体增殖的影响
Ｔａｂｌｅ ３ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｔｏ
ｔｈｅ ｐｒｏｔｈａｌｕｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
蔗糖浓度
Ｓｕｃｒｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／（ｇ·Ｌ－１）
鲜质量
Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ
／ｇ
干质量
Ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ
／ｇ
增殖系数
Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔ
生长状态
Ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｅ
０ １３．８７±２．３０ａ ４．８１±２．７３ａ ４．９９ 翠绿色、一般
１５ １５．４１±１．７７ａ １．１８±０．１３ｂ ７．６１ 翠绿色、良好
３０ １２．３８±２．８４ａ １．２８±０．２７ｂ ３．４０ 深绿色、好
６０ ９．１９±１．１１ｂ １．１３±０．１８ｂ ２．９４ 暗绿色、一般
２．３ 不同基质对孢子体转化的影响
由表４可知，在河沙基质上的转化试验原叶体生长
缓慢，后期无法正常进行受精作用，孢子体无法生长；园
土完成转化的时间最长；混合基质和腐殖土作为基质相
对于园土和草炭的转化率均不高；从转化时间和转化率
两方面考虑，最适宜东北对开蕨原叶体转化的基质为
草炭。
２．４ 白天温度对孢子体转化的影响
从表５可以看出，在变温变光的试验条件下，原叶
体在不同白天温度条件下的发育状况存在明显差异。
２５℃白天温度下原叶体受精成苗率最高，孢子体转化率
最高，孢子叶出现时间也较早；而在温度偏低和偏高的
１５℃和３５℃条件下，虽然也有转化但孢子体出现时间晚
表４ 不同基质对孢子体转化的影响
Ｔａｂｌｅ ４ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍｓ ｔｏ
ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
基质
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
第１株孢子体出现时间
Ｆｉｒｓｔ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｔｉｍｅ／ｄ
孢子体转化率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｔｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
腐殖土Ｈｕｍｕｓ ｓｏｉｌ ９０ ４７．５
园土Ｓｏｉｌ ９５ ８０．５
草炭Ｔｕｒｆ ７５ ８４．２
河沙Ｓａｎｄ － －
混合基质 Ｍｉｘ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｅｒｉｏｄ ８５ ６０．２
注：“－”表示１５０ｄ后仍然没有出现孢子体转化。
Ｎｏｔｅ：‘－’ｓｈｏｗｓ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ａｆｔｅｒ １５０ｄａｙｓ．
表５ 不同白天温度对孢子体转化的影响
Ｔａｂｌｅ ５ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｄａｙ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｔｏ
ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
白天温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃
第１株孢子体出现时间
Ｆｉｒｓｔ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｔｉｍｅ／ｄ
孢子体转化率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｔｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
１５ １２０ ４５．０
２０ ８５ ８２．６
２５ ７５ ８４．２
３０ ８０ ８０．２
３５ ９５ ６２．５
且转化率也并不理想。因此最适宜的转化环境温度应
控制在２０～３０℃，最适宜的白天温度为２５℃。
２．５ 光照强度对孢子体转化的影响
由表６可知，在以荧光光源为主要光源的变温变光
条件下，各个光照强度下对开蕨原叶体转化为孢子体的
转化时间和转化率差异均不大，转化率均能达到８０％
以上。
表６ 光照强度对孢子体转化的影响
Ｔａｂｌｅ ６ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｉｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｔｏ
ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
光照强度
Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ
ｉｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ／ｌｘ
第１株孢子体出现时间
Ｆｉｒｓｔ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｔｉｍｅ／ｄ
孢子体转化百分率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｔｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
１ ０００ ７５ ８０．５
２ ０００ ７５ ８４．２
３ ０００ ８０ ８０．２
２．６ 相对空气湿度对孢子体转化的影响
从表７可以看出，湿度在东北对开蕨原叶体受精作
用和孢子体生长中起到了决定性的作用，随着湿度的升
高转换率明显提升，在相对湿度达到９５％左右，转化率
可以达到８７．６％（图４）；转化时间也相对上述试验有所
缩短，７０ｄ第１株孢子体就出现了。
２．７ 不同培养基与不同蔗糖浓度对孢子体诱导的影响
将增殖后的原叶体分成２０片左右的小块，将原叶
体团接种到不同培养基与不同蔗糖浓度培养基中，培养
９０ｄ后开始有孢子体出现，１２０ｄ后开始有大量孢子体
出现，从表８可以看出，转化率最高的组合为１／４ＭＳ无
５９
·生物技术· 北方园艺２０１４（１９）：９３～９８
图４ 原叶体常规转化３０ｄ后的状态
Ｆｉｇ．４ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｒｏｔｈａｌｕｓ ｉｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｆｔｅｒ ３０ｄａｙｓ
表７ 相对空气湿度对孢子体转化的影响
Ｔａｂｌｅ ７ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ａｉｒ ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｔｏ
ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
空气湿度
Ａｉｒ ｈｕｍｉｄｉｔｙ／％
第１株孢子体出现时间
Ｆｉｒｓｔ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ
ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｔｉｍｅ／ｄ
孢子体转化率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｔｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
４０（ＣＫ） １２０ ３２．７
７５ ８０ ７８．５
８５ ７０ ８７．３
９５ ７０ ８７．６
糖培养基，但生长过程中原叶体团出现大量褐化，长势
不良，因此最适宜基础培养基为 ＭＳ无蔗糖培养基
（图５）。
图５ 接种９０ｄ后孢子体转化的状态
Ｆｉｇ．５ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ａｆｔｅｒ ９０ｄａｙｓ
２．８ 生长调节剂对孢子体诱导的影响
将原叶体团接种到添加不同的生长调节剂的 ＭＳ
无蔗糖培养基，培养９０ｄ后开始有孢子体出现，１２０ｄ后
开始有大量孢子体出现，由表９可知，仅添加５ｍｇ／Ｌ和
１０ｍｇ／Ｌ赤霉素诱导产生少量孢子体，添加 ＮＡＡ和
６－ＢＡ均没有孢子体产生。
表８ 不同培养基与不同蔗糖浓度对
孢子体诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ８ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｓｐｏｒｏｇｏｎｉｕｍ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
培养基
Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉａ
蔗糖浓度
Ｓｕｃｒｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／（ｇ·Ｌ－１）
栽植原叶体数
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ
／个
孢子体数
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ
／个
孢子体诱导率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｔｏ
ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
０ ２００ ４０ ２０．０
ＭＳ １５ ２００ １５ ７．５
３０ ２００ １５ ７．５
０ ２００ ４５ ２２．５
１／２ＭＳ １５ ２００ ２５ １２．５
３０ ２００ ２５ １２．５
０ ２００ ８５ ４２．５
１／４ＭＳ １５ ２００ ６０ ３０．０
３０ ２００ ４０ ２０．０
０ ２００ ０ ０
Ｎ６ １５ ２００ ０ ０
３０ ２００ ０ ０
表９ ＧＡ３、ＮＡＡ和６－ＢＡ对孢子体诱导的影响
Ｔａｂｌｅ ９ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＧＡ３，ＮＡＡ ａｎｄ ６－ＢＡ ｏｎ
ｓｐｏｒｏｇｏｎｉｕｍ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｙｌｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
激素类型
Ｈｏｒｍｏｎｅ
ｔｙｐｅ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
／（ｍｇ·Ｌ－１）
栽植原叶体数
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ／个
孢子体数
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／个
孢子体诱导率
Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｔｏ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ／％
０ ２００ ０ ０
５ ２００ ２５ １２．５
ＧＡ３ １０ ２００ ４５ ２２．５
１５ ２００ ０ ０
２０ ２００ ０ ０
０ ２００ ０ ０
０．５ ２００ ０ ０
ＮＡＡ １．０ ２００ ０ ０
１．５ ２００ ０ ０
２．０ ２００ ０ ０
０ ２００ ０ ０
０．５ ２００ ０ ０
６－ＢＡ １．０ ２００ ０ ０
１．５ ２００ ０ ０
２．０ ２００ ０ ０
３ 结论与讨论
３．１ 无机盐和蔗糖浓度对孢子萌发和原叶体增殖的
影响
Ｃａｍｌｏｈ等［１９］研究表明，在蕨类植物孢子的无菌培
养中，不含糖的基础培养基能促进孢子的萌发，适量加
入蔗糖利于原叶体的生长发育。该试验结果表明，东北
对开蕨的孢子在低无机盐、低蔗糖浓度的条件下萌发最
好，但萌发长出的原叶体则需要在无机盐充足，并加入
适量蔗糖的条件下才能继续增殖生长。蕨类植物的孢
子与种子植物的种子生长发育过程相似，其生长发育过
程都是一种有性繁殖过程。孢子萌发的前期，其孢子内
储藏的营养足够支撑其正常萌发，因此无机盐和蔗糖主
要作为调节剂来调节孢子所处环境的渗透压，主要目的
是要利于孢子从外界吸收水分进而萌发。在孢子萌发
的后期，随着孢子母细胞吸收水分并不断分化，其孢子
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北方园艺２０１４（１９）：９３～９８ ·生物技术·
内原有的内含物不断消耗，新生的原叶体就需要从外部
环境吸收营养以供其继续生长发育，此时无机盐和蔗糖
则作为主要营养物质，因此后期提高无机盐与蔗糖浓度
则会更适合于原叶体的增殖和生长。Ｍｅｌａｎ等［２０］在研
究蕨类植物的组织培养过程中认为，蕨类植物孢子的生
长需要含氮量高的培养基，铵态氮则是氮源补给的最有
效形式，具体为 ＭＳ培养基；Ｈｅｌｅｎａ［２１］则认为培养基中
过量的氮会造成植物氮毒害，紫萁的配子体在 ＭＳ、
１／２ＭＳ、ＫＰ培养基中会停止生长；Ｄｙｅｒ［２２］研究表明蔗糖
在蕨类组织培养中是最有效和最广泛应用的碳源，１％以
下的蔗糖有利于原叶体的形成和增殖；吴华等［２３］在对扇
叶铁线蕨的组织培养研究中和程冶英等［２４］在研究桫椤的
组织培养上也得出同样的结论；该试验结果与此相一致。
３．２ 常规条件下对孢子体诱导的影响
该试验结果表明，主要决定东北对开蕨孢子体转化
的因素是水分，因为东北对开蕨的原生环境为林下，性
喜阴凉湿润，要求有较高的相对空气湿度和充足的营养
物质［２］。在基质试验中，草炭、园土和腐殖土都能够提
供充足的营养，但园土相对粘重，结构紧实；腐殖土性质
疏松，不能有效的持水；这２种基质所提供的空气湿度
均没有草炭的高；河沙营养物质较少，无法满足原叶体
的生长发育。在相对空气试验中，相对空气湿度最大的
９５％的处理可以将转化率提高到８７．６％，也符合这一结
论。东北对开蕨最适宜的生长温度为１８～２５℃［２］，该试
验中由于加盖了塑料膜进行保湿，适当的提高环境温
度，加快了水分的蒸发，提高了相对空气湿度，因此最适
温度为２０～３０℃。移栽后小苗健壮长势良好（图６）。
图６ 移栽后小苗的生长状态
Ｆｉｇ．６ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ
３．３ 无菌条件下对孢子体诱导的影响
该试验结果所得到的无菌条件下的孢子体诱导率
都不如常规条件下的转化率高，而培养瓶内的无菌环境
与常规条件盆中的最大差别就是湿度；加盖棉花胶塞的
培养瓶内湿度不可能很大，而覆盖有塑料膜保湿的花盆
基质相对空气湿度是非常大的，每次打开塑料膜检查都
可见水汽从膜上滴下，这也能够证明主要决定东北对开
蕨原叶体转化的因素是水分这一结论。另外，添加生长
调节剂后的转化率并没有提高，这与吴华等［２３］在研究扇
叶铁线蕨无菌繁殖中得到的结论一致。Ｓｕｚａｎｎｅ等［２５］也
认为，蕨类植物的原叶体通常在没有外源植物生长调节
剂干扰的情况下能够顺利分化出孢子体。在外源植物
生长调节剂的调控下原叶体可能不会朝着分化孢子体
的方向发育，而是进一步增殖、形成原叶体或愈伤组织。
东北对开蕨作为一种集室内外绿化观赏价值与药
用价值于一身的珍惜濒危的长白山特色中草药［２］，是北
方地区一种孑遗植物，是研究生物进化和植物系统发育
理论的材料之一。它自然繁殖力极弱，而现在的生态环
境也受到了严重破坏，种群面临灭绝的危险，对其保护
和繁殖刻不容缓。该研究通过无菌孢子萌发和增殖，以
及对原叶体转化这一关键技术的研究，为东北对开蕨的
保护和繁殖提供必要的技术手段。
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·生物技术· 北方园艺２０１４（１９）：９８～１０２
第一作者简介：高睿（１９８７－），男，硕士研究生，研究方向为资源植
物学与植物分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｒｕｉｎｅａｕ＠１６３．ｃｏｍ．
收稿日期：２０１４－０４－２１
香鳞毛蕨ｐｓｂＡ基因的克隆与序列分析
高 睿１，梁 彦 涛２，常 缨１
（１．东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨１５００３０；２．大庆师范学院 生命科学学院，黑龙江 大庆１６３７１２）
摘 要：以提取的香鳞毛蕨总ＲＮＡ为试材，采用ＲＡＣＥ方法得到香鳞毛蕨ｐｓｂＡ基因全长，
研究其序列的生物信息学特征并提交序列至ＧｅｎｅＢａｎｋ。结果表明：克隆的基因全长１ ４２５ｂｐ，开
放阅读框为１ ０６２ｂｐ，编码３５３个氨基酸，与其它植物相比具有很高的同源性，基因命名为ＤｆｐｓｂＡ，
ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号为ＫＪ７２８６４８。该研究结果可为进一步阐明香鳞毛蕨光合作用机理、基因表达与
调控奠定基础，同时也为植物分类与进化提供依据。
关键词：香鳞毛蕨；ｐｓｂＡ；ＲＡＣＥ；基因克隆
中图分类号：Ｓ ６８２．３５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１４）１９－００９８－０５
香鳞毛蕨［Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｆｒａｇｒａｎｓ（Ｌ．）Ｓｃｈｏｔｔ］属鳞毛
蕨科（Ｄｒｙｏｐｅｒｉｄａｃｅａｅ）鳞毛蕨属（Ｄｒｙｏｐｅｒｉｓ）多年生草本
植物，主要分布于远东高寒地区，能够生长在滑石坡及
火山熔岩表面，具有多种生理活性［１－６］。大多数蕨类植
物都是阴生植物，喜生于散射光下。而香鳞毛蕨则能在
岩石表面阳光的直射下存活，这反映出香鳞毛蕨必有
与一般蕨类植物不同的光合作用机制以抵御阳光直射
与紫外线的照射。因此，对其光合作用的研究有着特殊
的意义。
在高等植物的叶绿体中，ｐｓｂＡ基因是一个重要光
调控基因，编码分子量为３２ｋｕ的Ｄ１类囊体膜蛋白是光
系统ＩＩ反应中心的２个核心亚基之一，在光合作用中主
要涉及光能的转换、电子和质子的产生以及分子氧的释
放［７］。ｐｓｂＡ基因的启动子具有光诱导性和高效活性，其
基因的转录、翻译、降解和修复等过程受光照、氧化压
力、ＵＶ辐射等环境因素的影响，是研究光饱和、光抑制
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Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
ＷＡＮＧ Ｙａｎｇ，ＤＯＮＧ Ｒａｎ，ＧＵ Ｄｅ－ｆｅｎｇ，ＬＩＵ Ｍｅｉ－ｔｏｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ，Ｊｉｌｉｎ １３０１１８）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｓｐｏｒｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｅ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅ ｏｆ Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ
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ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｓ ＭＳ＋１５ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ．Ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｔｕｒｆ，ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ２０～３０℃ａｎｄ ｔｈｅ ａｉｒ ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｗａｓ ９５％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｈｙｌｉｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ；ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ｓｐｏｒｅ ｍｕｌｔｉｐｌｙ
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