全 文 ：中国药物警戒第 7卷第 4期 2010年 4月 April, 2010, Vol.7, No.4
白花丹参对过氧化氢致人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用
于长凯 1 张晓燕 1 高允生 2* （1江苏联合职业技术学院连云港中医药分院，江苏连云港 222006；2泰山医学院，山东
泰安 271016）
中图分类号：R9- 33 文献标识码:A 文章编号：1672- 8629（2010）04- 0199- 03
摘要：目的研究白花丹参对过氧化氢（H2O2）所致人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）损失的保护作用。方法应用酶
消化灌注法培养人脐静脉血管内皮细胞，采用形态学观察和Ⅷ因子抗体免疫荧光检测法进行鉴定；取对数生长期的
细胞分组进行干预，应用形态学观察法和MTT法检测各组血管内皮细胞的活性。结果 H2O2损伤模型组细胞损伤明
显,经白花丹参高、中、低各剂量组的干预，受损情况均有较明显地改善，使细胞活性（OD值）增高。结论白花丹参对
H2O2所致的 HUVEC损伤具有保护作用。
关键词：白花丹参；人脐静脉血管内皮细胞；过氧化氢
Effect of Salvia Miltorrhiza bge.f.alba on Protecion of Vascular Endothelial Cells
YU Chang-kai1 ZHANG Xiao-yan1 GAO Yun-sheng2* (1Jiangsu Union Technical Institute Lianyungang Branch
Institue, Jiangsu Lianyungang, 222006 China; 2Taishan Medical University, Shandong Taian, 271016 China)
Abstract: Objective To study the effect of Salvia miltiorrhiza bge.f.alba(SMA) on a model of injured human umbilical
vascular endothelial cell(HUVEC) in vitro by hydrogen peroxide(H2O2). Methods In vitro perfusion and enzyme diges-
tion method is used to culture HUVEC, and the cells are identified by morphological observation andⅧ immunoreactivity.
Select the cells in the exponential phase of growth and treated, the cells viability is measured by morphological observa-
tion and the MTT assay. Results HUVEC are damaged obviously in H2O2 damage group, while in groups with SMA,
condition of HUVEC is improved obviously, and the activity(OD value) of the cells is significantly increased.Conclusion SMA
can protect HUVEC from damage by H2O2.
Key words: salvia miltiorrhiza bge.f.alba; human umbilical vascular endothelial cell(HUVEC); hydrogen peroxide(H2O2)
基金项目：山东省教育厅科研基金资助项目（J04E07）。
作者简介：于长凯，男，主治医师，药理学教学与科研。
*通讯作者：高允生，男,硕士生导师，中药药理与临床药理的研究。
E- mail:ysgao@tsmc.edu.cn
研究证明，血管内皮细胞（vascular endothelial cell,
VEC）损伤是以动脉粥样硬化为基础的众多心脑血管疾
病的始动环节或关键因素[1]。过氧化氢（Hydrogen Peroxide,
H2O2）可通过均裂反应或作用多价不饱和脂肪酸产生自
由基，是造成血管内皮细胞损伤的常见因素之一。白花
丹参（Salvia miltiorrhiza bge. f. alba）为唇形科植物丹参
（Salvia miltiorrhiza bge）的白花变型，主要分布于泰山及
其周边地区，属珍稀濒危药用植物[2]。文献报道白花丹参
有较强的血管扩张作用，对高血脂症和动脉粥样硬化具
有显著疗效，对血栓闭塞性脉管炎具有独特疗效[3]。本研
究旨在阐明白花丹参对人脐静脉血管内皮细胞（HU-
VEC）的保护作用。
1 材料
白花丹参根：采自泰山东麓，并经泰山医学院药学
院中药学教研室鉴定确认；正常分娩后的健康新生儿脐
带，山东泰安市中心医院分娩室提供；DMEM/F12培养
基，美国 Sigma公司；胎牛血清，美国 Invitrogen公司；胶
原酶 I，美国 Invitrogen公司；噻唑蓝[3-（4,5- dimethylth-
iazol- 2- yl）2,5- diphenyltetrazoliumbromide, MTT]，美国
Sigma公司；H2O2（30%,AR级），天津四通化工公司产品，
临用前稀释，并在 5min内使用；激光共聚焦显微镜, 美
国 Bio- Red 公司（型号 Radiance 2100）；全自动酶标仪 ,
美国 Bio- Red公司（型号 550）。
2 方法
2.1 血管内皮细胞的培养
参照 Jaffe等[4]的方法，取新生儿脐带（长度为 20cm～
30cm），冲洗干净。注入 0.1％的胶原酶 I溶液 10mL，37℃消
化 15min，收集消化液并用 10mL培养液冲洗管腔，1000rpm
离心 10min，重悬细胞，以 1×105/mL接种于培养瓶中，
置 37℃、5％CO2培养。约 1周后可传代，2代内用于实验。
2.2 血管内皮细胞的鉴定
2.2.1 培养细胞的形态学观察 原代培养的细胞培养
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5～7天后，倒置显微镜下观察细胞的形态。
2.2.2 因子Ⅷ相关抗原免疫荧光检测 在 6孔板里放入
盖玻片，调整细胞浓度为 1～3×104/mL，每孔接种 1 mL，
培养细胞均匀铺满孔底，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；95%
冰乙醇固定；将稀释的兔抗人Ⅷ因子抗体小心的加入到
盖玻片上 37℃孵育 1小时；吸出液体，PBS冲洗 3次；加
入稀释的荧光素 FITC标记的羊抗兔 IgG抗体，37℃孵
育 1小时；吸出液体，在激光共聚焦显微镜下观察、摄片。
2.3 白花丹参提取物的制备
称取白花丹参粉末 100g，蒸馏水浸泡，文火煎煮 2
次，每次 1.5h，合并滤液，用布氏漏斗抽滤；用旋转蒸发
仪浓缩至 100mL。得 1.0g/mL的白花丹参水提取物，用
0.22 m微孔滤膜过滤除菌后于 4℃保存，备用，用含血
清培养液稀释成相应浓度用于实验。
2.4 分组与处理
取处于对数生长期的 HUVEC，按如下条件分组处
理：①正常对照组：加入 DMEM/F12培养基；② H2O2损
伤模型组：加入 DMEM/F12培养基，同时加入 H2O2，使
H2O2占总体积的10%；③白花丹参高剂量组：加入DMEM/F12
培养基，同时加入 H2O2和 1.0g/mL的白花丹参提取液；
④白花丹参中剂量组：加入 DMEM/F12培养基，同时加
入 H2O2和 0.3g/mL的白花丹参提取液；⑤白花丹参低剂
量组：加入 DMEM/F12培养基，同时加入 H2O2和 0.1g/mL
的白花丹参提取液, 使③、④、⑤组中 H2O2和白花丹参
提取液各占总体积的 10%。各组继续培养 4小时。
2.5 显微镜下观察细胞形态改变
处理后于倒置显微镜下观察细胞受损情况。
2.6 MTT 法检测血管内皮细胞的活性
取处于对数生长期的 HUVEC，制备 1～3×104/mL
的单细胞悬液；接种于 96孔细胞板（每组细胞各 5个平
行孔），每孔细胞悬液 80 L；培养 3 天，待细胞长满孔
底；分组及各组细胞处理同上，弃去上清液，冲洗 2次，
每孔加入 MTT溶液 20 L和新鲜培养液 50 L；再培养
4h，弃去MTT液，每孔再加入 150 L二甲基亚砜（DMSO）；
室温下振荡 10min，至甲 完全溶解；于全自动酶标仪上
490nm波长处读取各孔吸光度值（OD值），以公式计算
细胞生长抑制率。
细胞生长抑制率（%）＝
2.7 统计学处理
选用 SAS 8.1统计软件进行统计学处理，实验数据
均以 S表示，数据采用单因素方差分析等进行统计。组间
比较采用 q检验。选取α= 0.05为检验水准，以 P＜0.05、
P＜0.01分别表示差别有统计学意义和差别有显著统计
学意义。
3 结果
3.1 HUVEC 的鉴定
HUVEC接种于培养瓶 12h后，大部分已贴壁，5～7
天后细胞己基本融合、呈特征性的“铺路石”样镶嵌排
列。免疫细胞荧光技术鉴定 HUVEC：共聚焦显微镜下可
见细胞核周围呈黄绿色发亮荧光，95%以上的细胞呈特
征性的阳性反应（图 1）。
3.2 镜下细胞形态改变
正常对照组：细胞生长良好，排列成单层铺路石样；
模型组：细胞损伤明显，体积收缩变小或肿胀，细胞脱落
明显，大片脱失，可见细胞碎片；高浓度组：细胞体积变
小，间隙变大，但彼此之间存在联系，脱落细胞较少；中
浓度组：细胞体积变小，间隙变大，但彼此之间存在联
系，部分细胞脱落; 低浓度组：细胞体积变小，间隙明显
变大，彼此之间联系较少，细胞脱落明显（图 2）。
3.3 MTT 法检测血管内皮细胞的活性
各处理组细胞吸光度值（OD值）测定结果，正常对
μ
μ
μ μ
μ
对照组 OD值 - 处理组 OD值
对照组 OD值 ×100%
图 1 原代 HUVEC因子Ⅷ相关抗原鉴定(×400)
图 2 镜下各组 HUVEC的形态学变化(×100)
A.正常对照组 B.H2O2损伤模型组C.白花丹参高浓度组 D.白花丹参低浓度组
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组别 n OD值
对照组 5 0.744±0.043
模型组 5 0.082±0.009 **
SMA 0.10g/mL 5 0.621±0.065▲▲
SMA 0.03g/mL 5 0.529±0.065 ▲▲
SMA 0.01g/mL 5 0.305±0.023▲▲
注：与对照组相比，*P < 0.01；与模型组相比，▲▲P < 0.01。
表 2 白花丹参对 HUVEC生长抑制率的影响( ±s,n=5)χ
组别 n 生长抑制率（%）
对照组 5 -
模型组 5 88.94±1.31
SMA 0.10g/mL 5 16.20±1.17 ▲▲
SMA 0.03g/mL 5 28.78±8.95 ▲▲
SMA 0.01g/mL 5 58.82±4.54▲▲
表 1 白花丹参对 HUVEC活性(OD值)的影响( ±s，n=5）χ
注：与模型组相比，▲▲P < 0.01。
照组细胞活性最高，H2O2损伤模型组最低，白花丹参各剂
量组与 H2O2损伤模型组相比差别有显著性意义（P <0.01）
（表 1）；各处理组细胞生长抑制率（%）测定结果（表 2）。
4 讨论
血管内皮细胞位于血管壁的内侧面，不仅是血液与
血管平滑肌之间的生理屏障，而且可以合成和释放众多
活性物质，如：一氧化氮（NO）、前列环素（PGI2）、内皮素
（ETs）等。血管内皮细胞承担至关重要的血管生理功能，
对维持正常血液循环有重要的意义[5，6]。但血管内皮细胞
极易受到损伤，高血压、高血脂、糖尿病、内毒素脂多糖
（LPS）、细胞因子、自由基等众多因素都可造成其损伤[7]。
氧自由基所致的血管内皮细胞 VEC氧化损伤在心
脑血管病的发生与发展中具有广泛的意义，而白花丹参
具有抗氧化和防治心脑血管病的作用。那么，白花丹参对
氧自由基损伤的 VEC是否具有保护作用呢？本实验采
用体外培养的 HUVEC作为实验对象，观察到 2mmol/L
的 H2O2明显诱导 HUVEC损伤，通过比较白花丹参各浓
度组与 H2O2模型组细胞损伤情况和细胞活性的差别 ,
证明白花丹参与 H2O2共同孵育可以有效地抑制 H2O2
对 HUVEC的损伤。即白花丹参对过氧化氢所致人脐静
脉血管内皮细胞损伤具有保护作用。国内外均研究显示
通过对 VEC的结构与功能进行保护，可增加血管壁的张
力减少渗出，改善血液粘滞度，促进毛细血管的修复与
再生，可有效的防治各种心脑血管疾病，因此白花丹参
有望成为防治心脑血管疾病的有效药物。但白花丹参是
通过何种机制来保护 HUVEC免受损伤目前仍不明确，
我们将通过进一步的研究来阐明。
参考文献：
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（收稿日期：2009- 12- 15 编辑：范燕）
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