全 文 ： ·1130· Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No.9 中国现代应用药学 2016年 9月第 33卷第 9期
藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究

罗慧英 1,2，曹茸茸 1，黄亚红 1(1.甘肃中医药大学药学院药理教研室，兰州 730000；2.甘肃省中药药理与毒理重点实验室，兰州 730000)

摘要：目的 研究藏药蕨麻对原代培养酒精损伤肝细胞的保护作用。方法 原代肝细胞经分离纯化培养后，MTT 法评价
藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞存活率的影响；荧光染色法测定藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞活性氧物质(ROS)含量、细胞内钙
离子浓度的影响；流式细胞仪检测藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞凋亡的影响；免疫印迹法检测藏药蕨麻对 Bcl-2 和 Bax 表
达的影响。结果 经酒精损伤后，肝细胞存活率降低；细胞内 ROS 含量和钙离子浓度增高；凋亡抑制基因 Bcl-2 减弱、
促凋亡基因 Bax 表达增强。藏药蕨麻可明显提高细胞存活率；降低细胞内 ROS 含量和钙离子浓度；改善凋亡情况，增强
Bcl-2 表达，抑制 Bax 表达，且作用呈剂量依赖性。结论 藏药蕨麻对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤具有一定的保护作用。
关键词：藏药蕨麻；原代培养肝细胞；酒精性肝损伤
中图分类号：R285.4 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2016)09-1130-04
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2016.09.009

Protective Effect of Tibetan Medicine Potentilla Anserina L. on Ethanol-induced Damage in Prime Liver
Cell of Mice

LUO Huiying1,2, CAO Rongrong1, HUANG Yahong1(1.Department of Pharmacology, Gansu University of Chinese
Medicine, Lanzhou 730000, China; 2.Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of
Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE To study the protective effct of Tibetan medicine Potentilla anserina L. on ethanol-induced
damage in mice prime liver cell. METHODS After isolation, purification and culture of primary hepatocytes, the livability of
cell was evaluated by MTT; fluorescence microscopy were used to evaluated the contents of reactive oxygen species (ROS) and
concentration of Ca2+; flow cytometry was used to detect the cell apoptosis; the expression of Bcl-2 and Bax were detected by
Western bloting. RESULTS After damaged by alcohol, the cell livability decreased, the contents of Ros and concentration of
Ca2+ increased, the expression of Bcl-2 decreased while that of Bax increased. Potentilla anserina could increase the cell
livability, decreased the intracellular ROS content and Ca2+ concentration ameliorate the apoptosis, increase the expression of
Bcl-2, and decrease the expression of Bax. CONCLUSION Tibetan medicine Potentilla Anserina L. has protective effect on
ethanol-induced damage in prime liver cell of mice.
KEY WORDS: Potentilla anserine L.; prime hepatic cell; ethanol-induced liver damage


基金项目：甘肃省教育厅高校科研项目(2013A-078)
作者简介：罗慧英，女，博士，副教授，硕导 Tel: (0931)8765395 E-mail: louria@163.com
随着人们生活水平的提高，酒精性肝损伤及
与酒精相关的疾病逐年增加。蕨麻是蔷薇科鹅绒
委陵菜 Potentilla anserina L.膨大的块根，具有健
脾益胃、益气补血、生津止渴、收敛止血、止咳
利痰的功效，现代药理学研究表明，蕨麻具有保
肝、抗氧化、抗缺氧、抗疲劳、抗寒等药理作用[1]。
笔者前期实验证明，藏药蕨麻可通过减少自由基
的产生，增强对自由基及其代谢产物的清除能力，
从而抑制脂质过氧化，起到对酒精性肝损伤的保
护作用[2]。本研究旨在进一步探讨藏药蕨麻对原代
培养肝细胞酒精损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
藏药蕨麻 Potentilla anserina L.(兰州惠仁堂药
业股份有限公司，批号：20150709)水煎 2 次，合
并滤液，浓缩至 250 mL(相当于生药含量为
2 g·mL1)，临用前用蒸馏水稀释为所需浓度，微
孔滤膜过滤灭菌。DGFH-DA试剂、Fluo 3-AM试
剂、Annexin V-FITC-PI 凋亡试剂盒均购自美国
Sigma公司(批号分别为 P2175，P3357，P0216)；
BX51型荧光显微镜(Olympus)；AD340酶标仪(美
国贝克曼库尔特)；Cell Lab Quanta SC型流式细胞
分析仪(Beckman coulter cell)；DMI3000B型倒置
中国现代应用药学 2016年 9月第 33卷第 9期 Chin J Mod Appl Pharm, 2016 September, Vol.33 No.9 ·1131·
相差显微镜(Leica)。
1.2 原代肝细胞分离培养
原代肝细胞分离提取采用原位灌流法[3]，调整
获得的肝实质细胞悬液浓度至 1×107·mL1后，接
种在 25 mL 用鼠尾胶原预处理的培养瓶中，用含
10%胎牛血清的 DMEM(高糖型)培养液 37 ℃，5%
CO2孵育箱中孵育培养 24 h 后换液，弃去未贴壁
细胞后继续培养，供后续实验使用。前期的实验
发现，随着孵育时间的延长，肝细胞数不断增加，
在第 4 天时进入对数生长期，不同浓度的酒精对
原代培养肝细胞的损伤作用呈剂量依赖性，结合
前期实验结果和本实验需要，采用 100 mmol·L1[4]
作为酒精的工作浓度。
1.3 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞存活率的影响
收集肝细胞，调整浓度至 1×107·mL1，接种
在鼠尾胶原预处理的 96孔板上，每孔 100 µL，24 h
后换液，吸弃未贴壁细胞后再培养 24 h，给药组
加入不同浓度的蕨麻水煎液(终浓度为 0.2，0.4，
0.8 g·L1)，模型组和空白组不加药继续培养，每
组设 3 个复孔。24 h 后模型组和藏药蕨麻组分别
加入 100 mmol·L1酒精，反应 12 h后 MTT法检
测细胞存活率。
1.4 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞活性氧物质
(reactive oxygen species，ROS)含量及 Ca2+浓度的
影响
ROS 含量测定采用荧光探针 DCFH-DA 检测
法，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞
膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生
成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探
针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以
氧化无荧光的 DCFH生成有荧光的 DCF，通过检
测 DCF的荧光强度就可以知道细胞内 ROS水平。
方法如下：将细胞浓度调整为 5×106·mL1，设空
白组、模型组和蕨麻低、中、高剂量组(0.2，0.4，
0.8 g·L1)，培养 24 h后，加入 100 mmol·L1的酒
精，培养 24 h后离心收集细胞，PBS洗 2遍后与
含有 10 mol·L1 DCFH-DA的磷酸缓冲溶液 37 ℃
培养 30 min，激发波长 485 nm，发射波长 524 nm
处测定荧光强度。
细胞内钙离子浓度测定采用钙离子荧光探针
Fluo 3-AM，Fluo 3-AM是 1种可以穿透细胞膜的
荧光染料。Fluo 3-AM进入细胞后可以被细胞内的
酯酶剪切形成 Fluo 3，从而被滞留在细胞内。Fluo
3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强
的荧光，其荧光强度可以反应细胞内游离钙离子
的浓度。方法如下：细胞按“1.2”项下方法处理
24 h后，PBS洗 2遍，与 5 µm Fluo 3作用 30 min，
洗涤收集细胞，流式细胞分析仪测定荧光强度，
计算公式如下：
荧光强度(%)=(实验组荧光强度/对照组荧光
强度)×100%。
1.5 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞凋亡的影响
将细胞浓度调整至 1×107·mL1后，接种于鼠
尾胶原预处理的 6 孔板中培养，设空白组、模型
组和蕨麻低、中、高剂量组(0.2，0.4，0.8 g·L1)5
组，24 h后加入酒精(终浓度为 100 mmol·L1)孵育
24 h，消化、收集细胞，PBS洗涤 2遍，70%预冷
乙醇 4 ℃固定过夜，PBS洗涤 2次，加入 500 µL
Binding Buffer 悬浮细胞，加入 5 µL Annexin
V-EGFP混匀后，加入 5 µL PI，混匀，室温避光反
应 15 min后，流式细胞仪激发波长 488 nm、发射
波长 530 nm处测定细胞凋亡率，Annexin V-EGFP
的绿色荧光通过 FITC 通道(FL1)检测，PI 红色荧
光通过 PI通道(FL3)检测。
1.6 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞 Bcl-2 和 Bax 表
达的影响
免疫印迹用于测定细胞质中 Bax 和 Bcl-2 表
达，方法如下：细胞按“1.2”项下方法处理 24 h
后，PBS 洗 2 遍，收集细胞，重悬至均化缓冲液
中，冰浴中搅拌均化，10 000 r·min1离心 15 min
去除细胞核物质，得上清为细胞质，15%的聚丙烯
酰胺凝胶溶解，转印在硝化纤维膜上，以 50 g·L1
脱脂奶粉于 37 ℃封闭 1 h 后，依次加入兔抗鼠
Bcl-2、抗 Bax 抗体(4 ℃过夜)及羊抗兔 IgG(37 ℃
孵育 1 h)。用凝胶成像系统 ECL 发光成像，并用
Lab Image软件分析。
1.7 统计学处理
所有实验数据用 SPSS 13.5处理，用 sx  表
示，组间比较采用 t 检验。P<0.05 表示差异有统
计学意义。
2 结果
2.1 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞存活率的影响
肝细胞经酒精损伤后，细胞存活率明显降低，
与模型组相比，藏药蕨麻(0.2，0.4，0.8 g·L1)能显
著增加酒精损伤后肝细胞存活率，且作用呈剂量
依赖性。结果见表 1。
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表 1 藏药蕨麻对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响
(n=3, sx  )
Tab. 1 Effect of Potentilla anserina on the cell viability in
alcohol damaged primary hepatocytes(n=3, sx  )
组 别 浓度/g·L1 吸光度(OD值) 细胞存活率/%
对照组  0.652 2±0.145 1 
模型组  0.289 9±0.045 1 44.45%±0.754 4
蕨麻低剂量组 0.2 0.290 7±0.035 5 44.57%±1.204 0
蕨麻中剂量组 0.4 0.418 4±0.215 2 64.15%±0.884 51)2)
蕨麻高剂量组 0.8 0.536 2±0.188 7 82.21%±1.652 31)2)3)
注：与模型组比较，1)P<0.05；与蕨麻低剂量组比较，2)P<0.05；与蕨
麻中剂量组比较，3)P<0.05。
Note: Compared with model group, 1)P<0.05; compared with low dose
group, 2)P<0.05; compared with middle dose group, 3)P<0.05.
2.2 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞 ROS含量、Ca2+
浓度的影响
经酒精损伤后，肝细胞中 DCF荧光信号明显
增强，代表 ROS 产生增加(P<0.05)。与对照组相
比，藏药蕨麻(0.2，0.4，0.8 g·L1)能显著降低酒精
损伤后细胞内 DCF 信号，提示其可以减少 ROS
的产生(P<0.05)；同时，经酒精损伤后细胞内 Ca2+
浓度也增加(P<0.05)，提示酒精损伤可能会造成肝
细胞内钙离子超载，藏药蕨麻(0.2，0.4，0.8 g·L1)
可有效缓解这种情况，且作用与剂量呈正比。结
果见表 2。
表 2 藏药蕨麻对酒精损伤原代培养肝细胞 ROS 含量、
Ca2+浓度的影响(n=3, sx  )
Tab. 2 Effect of Potentilla anserina on the concentrations of
ROS and Ca2+ in alcohol damaged primary hepatocytes(n=3,
sx  )
组 别 浓度/g·L1 ROS含量/% Ca2+浓度/%
对照组   
模型组  73.56±1.112 67.06±1.433
蕨麻低剂量组 0.2 68.21±0.3141) 55.61±3.0121)
蕨麻中剂量组 0.4 60.44±2.1151)2) 40.77±3.5251)2)
蕨麻高剂量组 0.8 51.24±0.3111)2)3) 32.27±1.2391)2)3)
注：与模型组比较，1)P<0.05；与蕨麻低剂量组比较，2)P<0.05；与蕨
麻中剂量组比较，3)P<0.05。
Note: Compared with model group, 1)P<0.05; compared with low dose
group, 2)P<0.05; compared with middle dose group, 3)P<0.05.
2.3 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞凋亡的影响
经流式细胞分析仪检测，酒精损伤可造成原
代肝细胞明显的凋亡改变(65.5%)，藏药蕨麻(0.2，
0.4，0.8 g·L1)可使凋亡率由 54.1%降至 32.5%和
21.1%，作用有明显的剂量依赖性。结果见图 1。


空白组 模型组 蕨麻低剂量组(0.2 g·L1) 蕨麻中剂量组(0.4 g·L1) 蕨麻高剂量组(0.8 g·L1)

图 1 藏药蕨麻对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响
Fig. 1 Effect of Potentilla anserina on the cell apoptosis in alcohol damaged primary hepatocytes
2.4 藏药蕨麻对酒精损伤肝细胞 Bcl-2 和 Bax 表
达的影响
根据 Western bloting结果显示，原代肝细胞
经酒精损伤后，Bcl-2表达明显降低，藏药蕨麻低、
中、高剂量组 Bcl-2 表达分别为 22.7%，45%和
79%，且作用呈剂量依赖性；而相反的现象出现
在 Bax表达变化中，提示藏药蕨麻对肝细胞酒精
损伤的保护作用与 Bcl-2 和 Bax 表达有关。结果
见图 2。
3 讨论
ROS 的产生和氧化性损伤被认为与许多疾病
的发病机制有关，线粒体功能异常、氧化还原过

图 2 藏药蕨麻对酒精损伤原代培养肝细胞 Bcl-2 和 Bax
表达的影响
Fig. 2 Effect of Potentilla anserina on the expression of
Bcl-2 and Bax in alcohol damaged primary hepatocytes
度，金属以及氧化应力因子都会引起受损细胞产
生 ROS[5]。大量 ROS可与细胞的膜磷脂、蛋白、
核酸发生反应，使细胞功能障碍和结构破坏，增
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加钙内流，形成超载，机制如下[6-10]：①细胞膜脂
质过氧化和通透性增强，细胞外 Ca2+内流。②膜
Na-K-ATP 酶失活，使细胞内 Na 升高，Na-Ca 交
换增强。③线粒体膜损伤使 ATP 生成减少，后者
使肌浆网钙泵活性降低，肌浆网摄取 Ca2+减少。
同时钙超载又会导致 ROS产生的进一步增加，机
制如下[8,10-12]：①钙敏感蛋白水解酶活性增高，促
使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，自由基生
成增加。②钙依赖性磷脂酶 A2激活，使花生四烯
酸(AA)生成增加，通过环加氧酶和脂加氧酶作用
产生大量 H2O2 和 OH·。③花生四烯酸代谢产物
LT、PGE2、PAF等具有白细胞趋化作用，吸引大
量白细胞进入损伤组织，通过呼吸爆发产生自由
基。④Ca2+沉积线粒体使细胞色素氧化酶系统功能
失调，O2经单电子还原形成氧自由基增多。⑤Ca2+
进入线粒体可使 MnSOD 和过氧化氢酶和过氧化
物酶活性下降，导致氧自由基清除减少。因此，
活性氧产生增多和细胞内钙超载可互为因果，形
成恶性循环，使损伤进一步加重。据报道[13]，体
内体外具有保护作用的物质，包括抗氧化剂、自
由基清除剂等，都具有相似的抗氧化机制：①通
过抑制酶活性或螯合作用，减少自由基的产生，
从而减少 ROS的产生；②直接清除 ROS；③上调
和增强抗氧化系统的活性。SOD、CAT 和 GPX 是
细胞主要的抗氧化体系[14]，SOD可以将超氧化物转
化为过氧化氢，然后由 CAT和 GPX转化为水。前
期研究发现，藏药蕨麻可以增强 SOD、CAT、GPX
的活性[2]。本研究发现，藏药蕨麻可以增加酒精损
伤后肝细胞的存活率，明显减少细胞内 ROS的产
生，降低细胞内钙离子浓度，提示藏药蕨麻对酒
精肝损伤的保护作用可能与增强抗氧化酶的活
性，增强自由基清除能力，从而减少细胞内 ROS
的产生，减轻钙超载有关。
研究表明，抑凋亡基因 Bcl-2可与促凋亡基因
Bax形成同源蛋白二聚体，在细胞死亡信号通路上
发挥分子开关的作用[15]，其比值决定了细胞的命
运，如果 Bax相对量高于 Bcl-2，则 Bax同二聚体
数量增多，从而促进细胞凋亡；如果 Bcl-2相对量
高于 Bax，则促进形成 Bcl-2/Bax异二聚体，并使
Bcl-2同二聚体的量增多，从而抑制细胞凋亡。本
研究发现，藏药蕨麻可以增加酒精损伤后肝细胞
的存活率，减少凋亡，这可能与蕨麻增强 Bcl-2表
达，降低 Bax表达有关。
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收稿日期：2016-03-24