全 文 ：基 础 研究
半边旗提取物 6F 诱导 HL-60 细胞凋亡
何承伟 , 　梁念慈 , 　莫丽儿 , 　李金华 , 　张晓
广东医学院(生物化学与分子生物学研究所:何承伟 ,梁念慈 ,李金华 ,张晓;化学教研室:莫丽儿),
广东 湛江 524023
　
【摘要】　目的:探讨蕨类植物半边旗提取物 6F 杀伤 HL-60细胞的作用机制 。方法:应用倒置显微镜观
察细胞形态 、DNA 琼脂糖凝胶电泳 、流式细胞光度术 、DNA 片段形成率等方法检测细胞凋亡 。结果:58
～ 231 nmol L 6F 作用 HL-60细胞 12 ～ 24 h 后 ,呈现典型的凋亡细胞的形态学改变 ,琼脂糖凝胶电泳可
见 DNA 梯状条带 ,流式细胞光度术结果显示有亚倍体(Sub-G 1)峰 , DNA 片段率结果显示 6F 诱导 HL-
60 细胞凋亡呈时间和剂量效应关系 ,6F 达到 29 μmol L 时只需作用 3 h 即可直接使细胞坏死。结论:
6F 可诱导 HL-60细胞凋亡 ,药物在一定的浓度范围内是其杀伤 HL-60 细胞的机制之一。
肿瘤防治杂志 , 2002 ,9(1):11-14
【关键词】　二萜类 分析;HL-60细胞;吞噬作用
【中图分类号】　R73-3　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1009-4571(2002)01-0011-04
Apoptosis in HL-60 Cells Induced by Compound 6F Isolated from Pteris Semipinnata L .　HE Cheng-wei ,
LIANGNian-ci ,MO Li-er , et al.Institute of Biochemistry and Molecular Biology , Guangdong Medical College ,
Zhanjiang 524023 , China
Abstract:Objective　To investigate the cytotoxicity mechanisms of compound 6F isolated from Pteris Semipin-
nata L .(PSL).Methods　The apoptosis of HL-60 cells has been confirmed by means of light microscopy ,DNA
agarose gel electrophoresis , flow cytometry and DNA fragment formation test.Resul ts 　Treated with 58-231
nmol L 6F for 12-24 hours ,HL-60 cells showed typical apoptosis alterations:morphologic changes in light mi-
croscopy , DNA ladders on agarose gel , Sub-G 1 peak on flow cytometric histogram , and DNA fragment test
showed that the induction effect of apoptosis by 6F was in a obvious time and dose dependent manner.Necrosis
w as shown in HL-60 cells when treated with 29μmol L 6F for 3 hours.Conclusion 　Compound 6F could in-
duce apoptosis in HL-60 cells , and this may explain one of the cytotoxicity mechanisms of 6F within a certain
concentration of range.
China J Cancer Prev Treat , 2002 ,9(1):11-14
Key words:diterpenes analytical ,HL-60 cells , apoptosis
　　半边旗(pteris semipinnata L .PSL)是真蕨目凤尾
蕨科植物 ,我们发现 PSL 提取物具有显著的体内外抗
肿瘤作用[ 1] ,其中化合物 6F 的活性最高[ 2] 。6F 是贝
壳杉烷二萜类化合物 ,由于 7β 位及 9位羟基 、15位羰
【基金项目】　国家自然科学基金项目(39870900);广东省科委
重点学科基金(9306)
【第一作者简介】　何承伟(1972-),男, 江西省南康市人 ,讲师, 博
士 ,主要从事抗肿瘤药的生化药理 ,基因工程及基因治疗的研究。
基三者之间可形成稳定的羟基 ,使 17位甲基的亲电性
大大增强 ,从而表现出很高的生物活性。研究表明 ,
6F 可增强多种常用抗肿瘤药物的活性[ 3] ,抑制 DNA
拓扑异构酶及酪氨酸蛋白激酶的活性[ 4]等作用 。笔者
从细胞凋亡的角度探讨化合物 6F 杀伤肿瘤细胞的作
用机制 。
1　材料与方法
1.1　材料
·11·肿瘤防治杂志 2002年 2月第 9卷第 1期　　CHINA J CANCER PREV TREAT , FEB.2002 ,Vol.9　No.1
DOI :10.16073/j.cnki.cjcpt.2002.01.004
1.1.1　受试药物　化合物 6F (化学命名及结构见参
考文献[ 2])由我所药物化学室提纯鉴定 。
1.1.2　细胞株　人早幼粒白血病细胞株 HL-60 购自
中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库 ,并由我所
细胞培养室传代保存 。
1.1.3　主要化学试剂　RPMI-1640 培养基 (Gibco 公
司),小牛血清(杭州四季青生物材料公司), RNase A
(上海东风生化技术公司),蛋白酶 K 、NP-40 、琼脂糖
(DNA 电泳级)、二苯胺(DPA)及碘化丙啶(PI)均为美
国 Sigma 公司产品。
1.2　实验方法
1.2.1　细胞培养　HL-60 细胞在含 10%灭活小牛血
清 、100 U mL 青霉素和 100 μg mL 链霉素的 RPMI-
1640完全培养基中 ,于 37℃5%CO 2 饱和湿度孵箱内
培养。
1.2.2　受试药物的配制　化合物 6F 用 DMSO 配制
成 10 mg mL ,分装冻存 ,临用前用培养基稀释成所需
浓度 。处理细胞时 ,DMSO 的最终浓度小于 0.1%,实
验表明该浓度对细胞的生长没有影响 。
1.2.3　细胞形态观察　细胞形态直接在倒置显微镜
下观察并照相 ,并用台盼蓝拒染法检测细胞膜完整性。
1.2.4　细胞 DNA 的提取及琼脂糖凝胶电泳　收集(1
～ 2)×106细胞 ,用含 2 mmol L EDTA 的 PBS 洗 2次 ,
加 0.3 mL TBE 缓冲液(Tirs-Cl 45mmol L ,pH 8.0 ,含
1 mmol L EDTA), 0.25%NP-40 及 1% RNase ,混匀
后 ,50℃水浴 1 h ,加 2 倍体积预冷的无水乙醇于 4℃
放置 1 h后 ,13 000 g 离心 20 min ,去上清 ,用 75%乙
醇洗1次 ,晾干 ,加适量 TE 溶解液(10 mmol L Tris-Cl ,
pH 8.0 ,1 mmol L EDTA),取 12μL 加 3 μL 上样缓冲
液(0.25%溴酚蓝 , 0.25%二甲苯青 , 40%蔗糖),混匀
加于 1.5%琼脂糖凝胶上 , 50 mV 电泳 1 h 左右 , 0.5
μg mL EB 染液中染色 5 min ,在 257.5 nm 紫外检测仪
上观察结果并照相[ 5] 。
1.2.5　流式细胞光度术分析 　收集 3×106 细胞 ,
1 000 g 离心 5 min ,去上清 ,用 Hanks 液洗 2次 ,最后
1次剩 0.3 mL 左右 ,迅速注入 75%冰冷的乙醇中 ,轻
轻混匀 , -20℃放置 24 h 以上 ,800 g 离心 5 min ,完
全去除乙醇 ,重悬于 40 μL 磷酸 -柠檬酸缓冲液中
(192份0.2mol L Na2HPO 4 , 8份 0.1 mol L 柠檬酸 ,pH
7.8),室温下放置 30 min , 1 000 g ×5 min 离心去上
清 ,细胞团悬于 0.3 mL Hanks 液中 ,加 0.7 mL 50 μg
mL PI(含 50 μg mL RNase A)避光染色 30 min ,用尼
龙网过滤后 ,在流式细胞仪上分析细胞周期分布[ 6] 。
1.2.6　DNA 片段率测定　收集 2×106 细胞 ,用 PBS
洗涤 2次 , 200 g 离心 5 min ,加 0.5 mL 低张裂解液
(10 mmol L Tris-Cl pH 7.5 , 1mmol L EDTA , 0.2%Tri-
ton X-100),13 000 g 离心 10 min(4℃),获沉渣和上清
两部分 ,沉淀加 0.5 mL 的低张裂解液 , 二者均加
0.125 mL 50%三氯醋酸 , 4℃过夜 , 13 000 g 离心 4
min ,去上清 ,加 0.2 mL 5%三氯醋酸于沉淀中 , 90℃
离心 10 min ,取上清 100 μL ,加 200 μL 二苯胺试剂
(二苯胺 1.5 g ,浓硫酸 1.5 mL ,冰醋酸 100 μL ,乙醛
0.08μg mL),30℃水浴 16 h ,在酶标仪上测吸光度(λ
=590 nm)[ 7] 。
1.2.7　统计学分析　每组实验重复 3次 ,处理组与对
照组之间的显著性检验用 t 检验。
2　结果
2.1　细胞形态学分析
倒置显微镜下观察细胞形态 ,未加药组 24 h 后 ,
细胞圆形 ,大小一致 。231 nmol L 6F 作用 12 h ,细胞
开始变圆变小 ,折光性增强 , 16 h 左右呈典型的凋亡
细胞形态:胞膜突起 ,细胞四分五裂成大小不等的凋亡
小体 ,如图 1B 所示。台盼蓝染色阴性 ,表明其膜结构
仍完整 。随着时间的推移 , 凋亡细胞逐渐增多 , 至
24 h 达顶峰 ,但如再延长作用时间 ,凋亡细胞则出现
继发性坏死(subsequent necrosis)。而 28.9 μmol L 6F
只需作用 3 h ,细胞即肿胀 ,折光性减弱 ,台盼蓝染色
阳性 ,说明细胞直接坏死(图 1C)。
图 1　倒置显微镜下 6F
处理后的 HL-60 细胞形态变化(×160)
(A:对照组;B:231 nmol L 6F 作用 16 h;C:28.9μmol L 6F 作用 3 h)
2.2　琼脂糖凝胶电泳
结果如图 2所示 ,231 nmol L 6F 作用 HL-60细胞
24 h 后 DNA 琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯状条带
(DNA ladders), 条带间隔 185 ～ 200 bp 的整数倍。
28.9μmol L 6F 作用 3 h 没有此现象 ,DNA 仍以大分
子存在 。
·12· 肿瘤防治杂志 2002年 2月第 9卷第 1期　　CHINA J CANCER PREV TREAT ,FEB.2002 , Vol.9　No.1
　　　　图 2　HL-60 细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳图
(1:231 nmol L 6F 作用 24 h;2:空白对照;3:λDNA Hind Ⅲ marker)
2.3　流式细胞光度术分析
58 nmol L 、116 nmol L 及 231 nmol L 6F 作用24 h的
HL-60细胞在流式细胞仪 DNA 直方图上出现1个 DNA
含量小于G 0 G1 期的细胞群体峰 ,即亚倍体峰(Sub-G 1),
峰面积随 6F 浓度增大而增大(图 3)。28.9μmol L 6F 作
用 3 h 组没有这种变化 ,与未加药组相同。
图 3　不同浓度 6F 作用 24 h 后
HL-60 细胞的流式细胞光度术分析图
(A:对照组;B:58 nmol L;C:116 nmol L;D:231 nmol L)
2.4　DNA 片段率
二苯胺法测定 6F 作用的 HL-60 细胞 DNA 片段
化形成率 ,结果显示(表 1 、2), 58 nmol L 6F 作用 24 h
或 173 nmol L 6F 作用 12 h 即可引起细胞 DNA 片段
化 ,231 nmol L 6F 作用细胞 24 h , DAN 片段率达
69.0%,呈明显的时间和剂量依赖关系 。
表 1　不同浓度 6F 作用 24 h 后 HL-60 细胞 DNA 片段率
组别(nmol L) DNA 片段率(%)
　0
29
58
116
173
231
6.0±2.7
4.7±1.8
23.5±2.4▲
34.3±3.1▲
56.0±3.2▲
69.0±4.6▲
注:▲ vs 对照组 P<0.01
表 2　173 nmol L 6F 作用不同时间后 HL-60 细胞 DNA 片段率
组别(h) DNA 片段率(%)
0
6
12
18
24
2.8±2.7
2.1±1.8
26.1±2.0▲
49.7±3.1▲
58.7±3.7▲
注:▲ vs 对照组 P<0.01
3　讨论
临床上用于治疗肿瘤的热疗 、放疗 、化疗及生物疗
法过去被笼统地认为用于杀死肿瘤细胞 ,对细胞的死
亡方式不加细究。细胞凋亡概念提出后 ,不仅使人们
认识到肿瘤的发生发展是由于肿瘤细胞的生长与凋亡
失衡造成的这种新观念[ 8] ,而且在现实中也有重要意
义 ,肿瘤的非手术疗法几乎都能不同程度地以诱导凋
亡的方式杀死肿瘤细胞。细胞凋亡不像坏死那样易引
起炎症反应 ,凋亡的细胞在体内很快被吞噬细胞清除 ,
对周围组织细胞不会造成伤害 ,而且诱导肿瘤细胞凋
亡的药物剂量较直接使细胞坏死的药物剂量小 ,因此
通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更小的毒副反应。
另外诱导凋亡也可作为肿瘤疗效评价的一项新指
标[ 9] 。
本文结果从 4 个方面证实 ,半边旗提取物 6F 在
一定浓度和作用时间范围内以诱导细胞凋亡方式杀死
HL-60 细胞。6F 诱导 HL-60 细胞凋亡是一持续的渐
进过程 ,作用 12 h 细胞形态开始变化。16 h呈典型的
凋亡形态 ,随时间推移 ,凋亡细胞逐渐增多 ,但 24 h 后
出现继发性坏死 。促发凋亡的时间 (time lag)因不同
的药物不同的细胞而相差很大 。如环饱菌素 (CHX)
只需作用 4 h 即可诱导成纤微细胞凋亡 ,而其它药物
则需 24 ～ 48 h[ 10] 。Dive 等[ 11]报道 ,0.15 μmol L 喜树
碱作用 3 h ,HL-60细胞呈典型凋亡特征。细胞凋亡过
程可分为先导期(priming)和促发期(triggering)。前者
即是“time lag” ,涉及某些凋亡相关基因的表达或蛋白
·13·肿瘤防治杂志 2002年 2月第 9卷第 1期　　CHINA J CANCER PREV TREAT , FEB.2002 ,Vol.9　No.1
质的活化 ,为促发凋亡作准备。后者表现为一系列有
序的形态学改变及 DNA 断裂。促发期一般只需约
3 h 即可完成 。
多数学者认为凋亡是多点启动的 ,可发生在周期
中的任一时相。许多周期特异性抗肿瘤药均可诱导各
时相细胞凋亡;但 Corczyca 用喜树碱诱导 HL-60 细胞
凋亡时发现 ,凋亡主要发生在 S 期细胞 ,而氮芥和 5-
氮杂胞苷主要诱导 G1 期细胞凋亡 ,蛋白激酶抑制剂
H-7 及γ射线主要诱导 G 2 M 期细胞凋亡[ 12] 。我们先
前的研究结果表明[ 2] , 116 nmol L 及 173 nmol L 的 6F
降低 G 0 G1 期细胞的比例 ,231 nmol L 6F 可同时降低
G 2 M 期细胞比例 ,提示 6F 在较低浓度时可能诱导
G 0 G 1 期细胞凋亡 ,较高浓度时可同时诱导 G2 M 期细
胞凋亡 。
本文的研究结果从细胞凋亡的角度解释了化合物
6F 杀伤肿瘤细胞的机制 ,并为 6F 的进一步研究及最
终应用于临床提供了实验依据 。
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收稿日期:2001-07-19　修回日期:2001-10-10
(编辑:魏玲　　校对:边莉)
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·14· 肿瘤防治杂志 2002年 2月第 9卷第 1期　　CHINA J CANCER PREV TREAT ,FEB.2002 , Vol.9　No.1