全 文 ：蟾蜍灵诱导人白血病 ys细胞凋亡的初步研究
徐瑞成t o陈小义t o陈 莉t o钱 进u
kt1 中国人民武装警察部队医学院 o天津 vsstyu ~
u1 国家医药管理局天津药物研究院 o天津 vsst|vl
≈摘要 目的 }探讨中药蟾蜍灵诱导白血病 ys细胞凋亡作用 ∀方法 }应用台盼蓝染色法测定 ys细胞的生
长曲线 o应用相差显微镜 !电子显微镜和 ⁄琼脂糖凝胶电泳等技术分析细胞凋亡 ∀结果 }蟾蜍灵与 ys细胞共育
时 o能明显抑制细胞生长 o细胞呈典型的凋亡形态学改变 }细胞皱缩 o染色质凝集 o沿核膜内侧分布 o呈新月形 o可见由
膜包被细胞内容物的凋亡小体的产生 ~细胞 ⁄ 裂解成 t{s ∗ uss ¥³及其倍数的片段 o电泳得到特有的梯形条带 ∀
结论 }蟾蜍灵诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的作用机制之一 ∀
≈关键词 蟾蜍灵 ~白血病 ys细胞 ~细胞凋亡
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码
≈文章编号 tsst2xvsukusstlst2ssx|2sv
细胞凋亡是一种由基因介导的细胞自杀行为 o
但需要凋亡信号的启动 o目前已知放疗 !热疗 !抗体
和化疗药物均可诱发癌细胞凋亡而使肿瘤消退≈t o
能否诱导肿瘤细胞凋亡已成为评价化疗药物的一个
重要指标 ∀
蟾酥是传统的中药 o临床和实验研究已证实其
具有抗癌作用≈u o国外学者从蟾酥中提取蟾毒配基
之一的蟾蜍灵k¥∏©¤¯¬±l单体 o发现该物质可有效地
诱导白血病细胞表型和功能逆转 o促使癌细胞分
化≈v ~新近的研究认为 ¥∏©¤¯¬±是细胞拓扑异构酶的
抑制剂 o导致 ⁄ 片段化≈w o该结果启示我们从细
胞凋亡的角度研究 ¥∏©¤¯¬±的抗癌机制 ∀
1 材料
111 药品 ¥∏©¤¯¬±由天津药物研究院制备 o分子式
≤uwvw w o相对分子量 v{y1x o用无水乙醇配成储存
液 o临用时用 ⁄2¤±®¶液逐级稀释 o乙醇终浓度控制
在 t ϕ o预实验证明该浓度乙醇对细胞几乎没有毒
害作用 ∀
112 细胞株 人早幼粒白血病 ys细胞由中国
医学科学院血液学研究所吴克复教授惠赠 o培养基
为 ° tywsk¬¥¦²产品l o补充 ts h胎牛血清k中
国医学科学院血液学研究所生产l ~在 vz ε ox h
≤ u饱和气体条件下培养 o培养液中加青霉素ktss
# °¯ p tl和链霉素ktss Λª# °¯ p tl ∀
2 方法
≈收稿日期 t|||2ts2tx
211 ys生长曲线的绘制 细胞接种于 ux °¯ 的
培养瓶 o接种浓度为 t qx ≅ tsx# °¯ p t ∀每瓶培养液为
w °¯ ∀t §后 o实验组加入 s qst ∗ s qt Λ°²¯#pt浓度
的 ¥∏©¤¯¬±连续处理 o隔天换液 o对照组不加药 ~每隔
t §取样 o台盼蓝染色法计数活细胞 o同一处理计数
v瓶细胞取平均值 ∀
212 细胞形态学观察 倒置相差显微镜观察并摄
影记录 s qt Λ°²¯ #pt¥∏©¤¯¬±处理的不同时间细胞
形态学变化 ~另收集药物处理 t{ «的细胞和对照组
细胞制作透射电镜标本 o观察细胞超微结构的改变 }
细胞离心 o弃上清 o立即小心地加入 u h戊二醛固定
液 o用滴管轻吹 o使细胞团块浮起 ovs °¬±后 ot h锇
酸后固定 u «∀乙醇逐级脱水 o环氧树脂包埋 o超薄
切片 o铀铅染色 o在透射电镜下观察 ∀
213 凋亡细胞 ⁄的琼脂糖凝胶电泳 收集 u ≅
tsy个细胞 o°
≥洗涤 t次 o移入 t qx °¯ ³¨³¨ ±§²µ©离
心管 o重悬于 us Λ¯ °
≥ o加入 wss Λ¯ 裂解液kt h °
p ws ous °°²¯ ∞⁄× oxs °°²¯ ×µ¬¶≤¯o³ z qxl o混
匀 o裂解 vs °¬±k镜下检查l o{sss µ# °¬±p t离心 x
°¬±o转移上清至另一 ³¨³¨ ±§²µ©离心管中 o并向其中
加入 ts h ≥⁄≥至终浓度为 t h o加入 ¤¶¨ 至终
浓度为 xs Λª# °¯ p t o置 xy ε ou «~再加入蛋白酶
至终浓度 ux Λª# °¯ p t ovz ε ou «o沉淀 ⁄ o样品溶
于少量 ×∞中 o∂ 2tys 紫外分光光度计测定 uys
±°光吸收值 o⁄上样量为 w Λª#¯ ¤±¨ p t o经 t qx h
琼脂糖凝胶k含 s qx Λª# °¯ p t溴化乙锭l电泳 ozs ∂ ou
«o紫外灯下照相 ∀
#|x#
第 uy卷第 t期
usst年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o²qt
¤±qousst
3 结果
311 ¥∏©¤¯¬±抑制白血病细胞生长 由图 t可见 o对
照组 ys细胞经过 v §o完成对数生长期 o然后到
达平台期 ~s qst Λ°²¯#pt ¥∏©¤¯¬±对 ys细胞有一
定的抑制作用 ow §时 o抑制率 vs h ~s qt Λ°²¯ #pt
¥∏©¤¯¬±处理 t§o能显著抑制细胞生长 o抑制率达
ys h以上 ow §以后仅存少数活细胞 ∀
图 t ys细胞生长曲线
¤q对照 ¥qs qst Λ°²¯#p t¥∏©¤¯¬± ¦qs qt Λ°²¯#p t¥∏©¤¯¬±
312 细胞形态学改变 相差显微镜下可见 o经 ¥∏2
©¤¯¬±处理以后 oys细胞变化明显 o有的细胞皱缩
变小 o有的细胞解离成彼此粘附成簇或游离的圆形
小体 ) ) ) 凋亡小体k图 u2l o而对照组细胞大小均
一k图 u2
l ~电镜下可见典型的新月形核的凋亡细
胞 o染色质呈高电子密度 o凝缩为新月形 o边移 o沿核
膜内侧分布 o细胞器变性 o但尚保存 o典型白血病细
胞表面结构消失 o表面变光滑 o整个细胞皱缩变小
k图 vl o而对照组细胞呈典型的恶性细胞表现 ∀
313 ⁄ 电泳获得梯形条带 如图 w 所示 os qt
Λ°²¯#p t ¥∏©¤¯¬±处理 ys细胞 v §o⁄ 裂解为
t{s ∗ uss ¥³及其倍数的片段 o琼脂糖凝胶电泳获得
清晰的凋亡特征性梯带k¯ ¤§§¨µl o处理 w §o⁄ 有
所降解 o¯¤§§¨µ变模糊 o对照组细胞基因组 ⁄ 完
整 ∀
4 讨论
«¤±ª等曾报道低浓度ks qsst Λ°²¯ #ptl¥∏2
©¤¯¬±作用人白血病细胞 o使细胞表型逆转 o分化成巨
噬细胞r单核细胞样细胞 o失去增殖和粘附力≈v ∀也
有报道¥∏©¤¯¬±诱导肿瘤细胞分化时下调¦2 °¼¥和
¦2°¼¦的表达 o诱发 ¦2©²¶和 ∞ªµ2t 的转录≈x o∏2
°¤½¤º¤等在人的血浆中发现内源的 ¥∏©¤¯¬±2¯¬®¨ 物
质 o也是通过诱导分化的方式抑制多种源于人的白
血病细胞系的生长≈y ∀
图 u 培养的 ys细胞形态学改变
q¥∏©¤¯¬± s qt Λ°²¯#p t处理 t §
q对照
图 v ys细胞透射电镜观察
示新月形核的凋亡细胞
我们的研究结果表明 o¥∏©¤¯¬±与 ys细胞共
育时 o细胞生长明显受到抑制 o形态学呈现典型的凋
亡特征性改变 o即核染色质凝集 !碎裂 o沿核膜周边
分布 o呈新月形或帽形 o胞膜内陷将变性的细胞内容
物包裹成凋亡小体 o这些变化在普通光镜下较难识
别 o而电镜观察对确认凋亡细胞是一个十分可靠的
方法≈z ∀生化方面的改变可能是药物激活特异性信
号传导系统 o造成某些基因表达 o核酸内切酶被激
活 o使 ⁄双链在核小体间断裂 ∀每个核小体的长
度恰在 t{s ∗ uss ¥³之间 o所以在 ⁄凝胶电泳图
上出现特有的梯形条带 ∀因此 o诱导凋亡是 ¥∏©¤¯¬±
抑制白血病的重要机制之一 ∀
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usst年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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¤±qousst
图 w
∏©¤¯¬±处理的 ys细胞 ⁄电泳分析结果
t q对照 u q分子量标准kv{x¥³l
v qs qt Λ°²¯#p t¥∏©¤¯¬±处理 v§ w qs qt Λ°²¯#p t¥∏©¤¯¬±处理 w§
¤¶«¬°²·²等曾报道 ¥∏©¤¯¬± 作用 ys 细胞
时 o下调拓扑异构酶 µk× ° µl基因表达 !× °
µ2Α蛋白数量下降 o× ° µ的活性也显著下降 o检
测到 ⁄片段化≈w o这与我们电泳观察的结果是一
致的 ∀而 ¥∏©¤¯¬±作为 × ° µ抑制剂诱导凋亡的机
制尚不明确 o已有越来越多的证据支持这样的假说 }
拓扑异构酶抑制剂促进拓扑异构酶与 ⁄ 形成稳
定的切割复合物 o该复合物与 ⁄ 复制叉 / 碰撞0
k¦²¯ ¬¯¶¬²±l o导致细胞凋亡≈{ ∀已知 ¥∏©¤¯¬±作为诱导
信号 o最先作用细胞膜上 ¤n n2×°¤¶¨ o¤n n2
×°¤¶¨有可能作为¥∏©¤¯¬±的受体≈x o¥∏©¤¯¬±诱导
凋亡的信号传递途径值得进一步研究 ∀
≈参考文献
≈t • ¬¯¯¬¤°¶ × q°µ²ªµ¤°° §¨ ≤¨¯¯ ⁄¨ ¤·«} ³²³·²¶¬¶¤±§ ±¦²ª¨2
±¨ ¶¬¶q≤¨¯¯ot||t oyx }ts|z q
≈u 杨素娟 1 蟾蜍及蟾酥的临床应用与研究进展 1 中医药信息 o
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[ Κεψ ωορδσ] ¥∏©¤¯¬±~¯¨ ∏®¨ °¬¤ ys ¦¨¯¯ ~¤³²³·²¶¬¶
≈责任编辑 古云霞
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