全 文 ：泰 山 医 学 院 学
JO URNA L O F TA I S HA N MEDIC A L CO LEL G E V
o L 29 No. 1 0
报
2)(X 8
白花丹参对大鼠局灶性脑缺血后
神经元凋亡的影响及机制研究
周亚 东` ,夏作理 , ,杨
( 1
. 泰山医学院附属医院 , 山东泰安 27 1以刃 ; .2
琳 , ,周明顺 ’ ,牛立健 ,
泰山医学院基础医学研究所 , 山东泰安 271 0以) )
摘要 : 目的 探讨白花丹参制剂对大鼠局灶性脑缺血的保护作用 。 方法 采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭
塞模型 ( M C AO ) ,将动物随机分为假手术组 、 M CA O 组 、 生理盐水组和白花丹参组 , 白花丹参组大鼠采用术前水提物
灌胃,用免疫组化法检测 cb l一 和 bax 的表达水平 , T UN E L 法检测凋亡水平 ,流式细胞术测凋亡率。 结果 白花丹参
可有效提高大鼠局灶性脑缺血时脑组织中 bcl 一 的含量 ,并抑制 bax 的表达 , 降低凋亡细胞水平。 结论 白花丹参
可抑制 M C AO 后神经元凋亡 。
关键词 : 白花丹参 ;脑缺血 ;凋亡
中图分类号: 2R 82 . 6 文献标识码 : A 文章编号 : l侧) 4一 l巧 ( 20 8 ) 10刁 764 习3
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e e ti v e e fe e t s of s al vi a 而 lt io hr i z a be g . f . 以b a ( 白花丹参 ) o n art s aft e r fo e滋
e e er balr is e he而 a . M e th do s : OF yrt e igh t m al e W ist ar 扭 t s w e er anr do ml y d iv id e d in to fo u r 脚 u p s : th e s ha m 脚u p , t he n o r -
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e al e e er balr i s e he而a w as i n du e e d by co e l u s io n o f the ir g ht m idd le e e er balr art e叮 . hT e e x per s s io n Of cb l一 2 an d ht e a p o p t o s i s
i n n e u alr e e l ls w e er det e e te d by im mu no hi
s to e he m i s t叮 , TUN E L a n d fl ow e yt o m e t叮 er s p e e tiv e l y . R e s u l t s : hT e a卯Pto t ie
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s io n : Sal v ia 而 l tior hi az b e g . f . 山 a e a n i n hi bit a OP Pto s i s , w h ie h m a y be m ed ia ted b y u P一盯 a din g t he ex P er s s i o n o f bC I-2
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丹参已广泛用于防治心脑血管病 , 多年来 , 由于
紫花丹参种植较为广泛 ,人们对紫花丹参研究较多 ,
白花丹参为丹参的一种 , 而 目前对它的研究仍处于
起步阶段 。 cB l一 基因是 目前最受重视的抗凋亡基
因 ,本实验采用局灶性脑缺血模型 ,研究白花丹参对
脑缺血后大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的影响 ,并探
讨有关作用机制 。
1 材料与方法
1
.
1 动物与分组 成年雄性 Wist a r 大鼠 48 只 , 体
重 280 一 320 9 , 随机分为假手术组 、 M C AO 组 、生理
盐水组和白花丹参组 ( or 岁 kg ) 。 每组 12 只大鼠 ,
免疫组化和 UT N E L 染色 6 只 , 流式细胞仪检测 6
只 。 白花丹参组剂量为 or 岁kg ,术前连续灌胃 7 d ,
作者简介 :周亚东( 19 81 一 ) , 男 , 山东肥城人 , 助教 ,硕 士研究生 , 主要从事脑血管疾病研究及内科急症救治 。
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J O URN AL OF T A ISH AN M E D ICAL C OL LE GE V
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.
2 9 N
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.
10 2叨 8
生理盐水组予以生理盐水连续灌胃 7 d ,然后制作脑
梗死模型 。
1
.
2 试剂 白花丹参由山东莱芜市丰盛丹参研究
开发中心惠赠 , 以三蒸水浸泡后文火沸煮 30 分钟 ,
重复一次后收集药液蒸馏至 1 岁m l ( l ml 药液中含
1 9 生药 ) ;细胞凋亡试剂盒购自博士德生物制品公
司 , bc l一 和 bax 均购自北京中杉生物制品公司 ; IP
染液购自 iS g m a 公司 ;
1
.
3 仪器 冰冻切片机 显微照相系统 超低温冰
箱 流式细胞仪。
1
.
4 模型制作 参照 lon ga 法并稍加改进 。 大鼠
以 or % 水合氯醛腹腔麻醉 ( 30 m岁 kg ) , 颈正中切
口 ,在距颈总动脉 ( CC A )分叉处约 5 一 8 m m 处分别
结扎颈外动脉 ( ECA )和颈总动脉 ( CC A ) , 并分离结
扎颈内动脉 ( IC A ) 的分支翼愕动脉 , 血管夹阻断
IC A 的血流 , 将直径为 0 . 2 35 c m 的尼龙线 , 头端均
匀涂一薄层硅胶 ,肝素浸泡后经 CC A 上切口 (离分
叉处约 5 一 8 m m ) ,进入 CC A 、 IC A , 遇阻力即止 。 插
人深度约为 18 一 20 m m ,丝线扎紧 CC A ,缝合皮肤 。
术中保持肛温恒定 。 凡呼吸困难 、术中出血量较大 、
术后 50 m in 仍未苏醒者均弃之不用 。 假手术组进
行相似的手术 , 但是不插人线栓。 实验动物随机分
为 M CA O组 、生理盐水组和白花丹参组 ( 10 留k g ) ,
三组均与术后 24 小时处死 。
1
.
5 免疫组化 术后 24 h 处死动物 ,用水合氯醛腹
腔注射麻醉 , 开胸暴露心脏 , 经左心室插管 , 同时剪
开右心耳 ,快速灌注生理盐水 , 待肝脏变白后 , 改灌
4% 中性多聚甲醛固定液 , 至大鼠僵硬 。 取脑投入
30% 蔗糖中性多聚甲醛溶液中后固定 24 一 48 h , 待
脑组织下沉后 , 取中段进行冰冻切片 , 厚度 8 林m 。
B d 一 、 B ax 蛋白表达检测采用 S P法 ,抗体及 SP 试剂
盒 、 DA B 试剂盒均购于北京中杉公司。 阴性对照片
用 0 . 01 m o F L P B S 代替一抗 。 免疫组化反应图像
半定量分析 :每大脑个标本于视交叉后相应部位连
续切片 ,每隔 5 张取 1 张 ,共取 or 张切片 。 每张切
片在 40 倍物镜下 ,随机选取 10 个视野 ,测定阳性细
胞数 ,计算每组平均值 ,反映阳性强度 。
1
.
6 细胞凋亡染色并计数 细胞凋亡检测试剂盒
购于武汉博士德公司 。 按照说明书进行操作 , 每张
切片经显微镜观察于缺血半暗带处取 or 个高倍视
野测凋亡细胞数 ,取均值 。
1
.
7 流式细胞仪检测 脑缺血 24 h 后每组动物各
6 只断头处死 ,取大脑 ,置于 0 . 01 m 0 F L P BS 中洗
涤 3次 ,剥取缺血侧大脑半球 ,经眼科剪机械剪切 、
加人 0 . 4% 胰蛋白酶 3 . o ml , 37 ℃水浴 30 分钟 , 水
浴期间不时摇动 , 水浴后加人 PB S 3 . o ml ,反复吹打
l 一 2 分钟 , 40 目金属网过滤 , 0 . 0 1 m o F L PB S 稀
释成单细胞悬液 ,收集于长试管并稀释至 or ml , 反
复吹打数次 ,静置 30 m i n ,取上清 1 m l , 0 . 0 1 m o l/ L
P Bs 50 “ m i n , 10 m i n ,洗涤 3 次 , 70% 乙醇固定 、 4
℃ 过夜 , 50 “ m i n , 10 m i n 去固定液 , 0 . 0 1 m o F L
p BS 80 r/ m i
n , 10 而 n , 洗涤 3 次 , 加 50 林g/ m l p l
( S ig m
a
)液 (含 R N A 酶 l m岁m l )0 . 4 耐 , 4 ℃避光染
色 30 m in ,流式细胞仪分析凋亡百分率。
1
.
8 统计学处理 实验数据以均数 土标准差 (无土
s) 表示 ,各组之间比较用方差分析 。 P < 0 . 05 为差
异有统计学意义 。
2 结 果
2
.
1 免疫组化 术后 24 h 梗死灶周围脑组织 cB l -
2 蛋白的表达 Bd 一 阳性物质位于细胞浆 , hS am 组 、
M c A O组与 N s 组均可见 cB l一 阳性细胞 , 白花丹参
组 cB l一 阳性细胞较 N S组 、 M CA O 组显著增多 , 差
异具有统计学意义 。 在梗死周边区脑组织同样检测
出 bax 蛋白的表达 , hS a m 组仅见少量表达 , M CA O
组及 NS 组均可见 bax 蛋白大量表达 , 白花丹参组
bax 阳性细胞较 N S组显著减少 , 差异具有统计学意
义 (见表 l ) 。
2
.
2 T u NE L染色结果及白花丹参对细胞凋亡的影
响 T u N E L 染色发现凋亡细胞形态学特征示胞体
缩小 ,染色质凝集 , 密度增高 , 呈块状或颗粒状 ,胞核
中棕色颗粒 。 统计学结果显示 , 白花丹参组凋亡细
胞较 N S 组和 M C AO 组均显著减少 , 差异具有统计
学意义 (详见表 1 ) 。
2
.
3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 凋亡细胞 DN A
断裂形成大量寡聚核昔酸 ,其在流式细胞仪的 D NA
图上表现为 lG 峰前的亚二倍体峰 。 根据图形比
例 , 可计算出各组神经细胞的凋亡率 。 检测结果示
M CA O 组大鼠梗死侧脑细胞凋亡率与 N S 组比较无
差异 , 白花丹参组脑细胞凋亡率比 N S 组和 MC AO
组显著降低。
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JO UR NA L O F TA IS HA N M E DICA L CO LEL G E VOI
.
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.
10
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表 1 白花丹参对大鼠局灶性脑缺血后神经元凋亡及 cb l一 和 bax 表达的影响 (无士 。 )
组别
S ha n l
MC AO 组
NS 组
白花丹参组
n
l 2
l 2
12
l 2
阳性细胞 cb l一 阳性细胞 bax
8
.
5 0士 1
.
65 7
.
5 0土 1 . 7 6
25
.
39 土 3
.
90
.
2 8
.
5 0士 4 . 56
巾
26
.
97 土 4
.
27
.
29
.
25土 5 . 3 2晰
3 2
.
9)( 士 5
.
0 1
’ △那 23
.
70
土 4 . 24今么 #
凋亡细胞数
3
.
15 士 0 . 43
34
.
15 士 4 . 23 中
3 2
.
7 7 土 4 . 56 .
25
.
9 8士 4
.
04
.麟
细胞凋亡率 (% )
1
.
46 士 0 . 3 3
11
.
7 6士 1
.
53
.
11
.
2 1土 1 . 12 % *
8
.
0 1土 1 . 05· 么`
注 :与假手术组比较 ` p < 0 . 05 ; 与 MC Ao 组比较 J尸 < 0 . 50 ; 与 NS 组比较介尸 < 0 . 05
3 讨 论
现已明确 , 细胞凋亡的发生是由基因调控的过
程 , cB l一家族可以通过调节线粒体外膜的通透性而
影响细胞色素 c 、 凋亡诱导因子 ( IA )F 的释放川 ,
位于线粒体外膜的 bc l一蛋白还可阻止细胞色素 C
和 A p-af l 的相互作用从而使凋亡蛋白酶激活受阻 ,
因而可阻止细胞色素 c 介导的细胞凋亡 〔’ ] , 而 bax
可通过诱导细胞色素 C 、 凋亡诱导因子释放促进细
胞凋亡川 , 其对凋亡的调控结果取决于两者的比
例 。 同时最近有学者〔’ 〕通过研究质粒 p xL s N 介导
bc l一 c D N A抑制局灶性脑缺血大鼠神经元凋亡发
现 , be l一 基因的高表达会明显减少缺血半暗带的凋
亡细胞数 ,也证实了 bc -l2 的脑保护作用 。 白花丹参
作为一种传统中药 , 国内外学者对它的化学成分进
行分析 ,发现其含有多种活性成分 [’] , 同时已有实
验研究显示预防性应用白花丹参制剂能够清除活性
氧 、抑制脂质过氧化反应 、缩小梗死体积等多个方面
证实了其对急性脑缺血的保护作用〔’ ,:6 , 本实验结
果表明 , 白花丹参上调 Bd 一 2 蛋白的表达 , 下调 Bax
蛋白的表达 , 同时凋亡细胞数也呈明显的下降趋势 ,
从而证明了白花丹参对局灶性脑缺血损伤后的细胞
凋亡同时具有抑制作用 。
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