全 文 ：第 37 卷　第 5 期
2009 年 5 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.)
Vo l.37 No.5
May 2009
香桃木叶非精油组分体外清除自由基和
抗氧化作用研究＊
方献平1 ,陈季武1 ,肖露萍1 ,高秋月1 ,李海燕1 ,肖洋炯1 ,姚　雷2
(1华东师范大学 生命科学学院 ,上海 200062;2 上海交通大学植物学系 ,上海 201101)
[ 摘　要] 　【目的】探索香桃木叶非精油组分提取物的清除自由基和抗氧化作用 , 为进一步开发利用香桃木资源
提供理论依据和试验资料。【方法】采用水提取法 、甲醇-水提取法和乙酸乙酯提取法 3 种方法从香桃木叶中提取非
精油组分 ,然后用 4 种化学发光体系和 2 种比色体系检测其清除自由基和抗氧化作用。【结果】香桃木叶的非精油组
分 3种提取物均能有效清除 O -·2 、· OH 、DPPH·和 ONOO - , 减轻或消除· OH 对 DNA 的氧化损伤 , 抑制脂质过氧
化 ,其中甲醇-水提取物清除 O -·2 和 ONOO -能力最强 , 乙酸乙酯提取物清除· OH 和 DPPH· 的效果最佳。【结论】
香桃木叶非精油组分是有效的 、多功能的天然抗氧化剂和自由基清除剂 ,具有综合开发利用的价值。
[ 关键词] 　香桃木叶提取物;非精油组分;自由基;DNA 氧化损伤;抗氧化剂
[ 中图分类号] 　R284.2;Q949.762.2 [文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2009)05-0201-05
In vitro scavenging free radical and antioxidant effects of
extracts from Myrtus communis Linn .leaves
FANG Xian-ping1 ,CHEN Ji-wu1 , XIAO Lu-ping1 ,GAO Qiu-yue1 ,
LI Hai-yan1 ,XIAO Yang-jiong1 , YAO Lei2
(1 S chool o f Li f e S cience , E ast Ch ina Norma l Un iver sity , Shangha i 200062, China;
2 Department o f Plant S cience , Shangha i J iaotong Universi ty , Shanghai 201101 , Ch ina)
Abstract:【Objective】The ef fects o f nonessential oil ext racts o f Myrtus communis Linn.leaves on
scavenging f ree radical and antioxidant role w ere studied in orde r to provide an experimental basis fo r i ts
furthe r development.【Method】Water , methano l and ethyl acetate ex traction method were used to ex t ract
non-oil components f rom Myrtus communis Linn.leaves , and then radical scavenging act ivity and antioxi-
dant role o f these ex tracts w ere investig ated using four chemiluminescence systems and tw o colo rimetric
sy stems.【Result】Extracts of Myrtus communis Linn.leaves no t only ef fectively scavenged O -·2 , ·O H ,
DPPH · and ONOO - ,but reduced o r prevented DNA oxidative damage caused by ·OH and inhibi ted lipi-
ded pexoxidation.【Conclusion】Ex tracts of Myrtuscommunis Linn.are effective ,multifunctional natural antioxi-
dants and radical scavenger , and are the natural products worthy of further exploitation and utilization.
Key words:ex t ract of Myrtus communis Linn.leaf;nonessential oil ex t ract;f ree radical;DNA oxidative
damage;antio xidant
　　现已研究证实 ,许多疾病的诱发促进机制都涉 及到自由基的产生[ 1] ,自由基清除剂在清除机体自
＊[收稿日期] 　2008-06-20
[基金项目] 　上海市科学委员会项目(06DZ22110)
[作者简介] 　方献平(1983-),男 ,浙江杭州人 ,硕士,主要从事自由基和抗氧化研究。 E-mai l:fx p2009@yahoo.com.cn
[通信作者] 　陈季武(1956-),男 ,浙江平阳人 ,副教授 ,主要从事植物资源开发和自由基医学研究。
E-mail:jw ch en@bio.ecnu.edu.cn
DOI :10.13207/j.cnki.jnwafu.2009.05.039
由基 、保护机体免受氧化损害中起重要作用 。因此 ,
近年来自由基清除剂的研究倍受关注 ,其中芳香植
物的抗氧化作用是研究热点之一[ 2-3] 。
享有“爱神木”美称的香桃木(Myrtus commu-
nis Linn.)是一种芳香植物 ,是桃金娘科(Myrtace-
ae)香桃木属(Myrtus Linn .)的常绿灌木 ,高达 3 ～ 5
m ,小枝密集 ,叶革质 ,对生 ,深绿色 ,有光泽 ,原产地
中海沿岸 ,目前我国长江以南部分地区已有栽植。
香桃木叶由于含桃金娘烯醇 ,有强烈的杀菌效果 ,药
用价值较高 ,对气管炎等呼吸道疾病疗效较好 ,还有
镇静 、安眠作用 。近年来又发现 ,香桃木植物体内不
仅含有抗生素物质 ,而且其水提物还具有灭螺活
性[ 4] 。目前 ,国内外对香桃木叶精油含量和精油成
分的研究较多[ 3] ,但对其非精油组分功效的关注甚
少。本研究采用 6种体系检测了国产香桃木中非精
油组分 ,体外清除自由基能力及抗氧化作用 ,旨在为
进一步开发利用香桃木资源提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　供试植物　香桃木于 2006-04播种于上海
交通大学农学院种植场 ,在大棚下弱碱性土壤中生
长 ,生存环境温暖 、湿润 ,于 2007-10 初采集植株的
中上部叶片(距地面约 70 cm)。将新鲜的香桃木叶
片在室温下晾干后 ,置 60 ℃烘箱烘至恒质量 ,再用
高速微量粉碎机粉碎成粉末。
1.1.2　试剂及仪器　鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰
肼), Sigma 公司产品;二苯代苦味肼基自由基(DP-
PH ·),日本东京化成工业株式会社产品;DNA 购
自中国科学院东风生化试剂公司;其余试剂均为国
产分析纯 。主要仪器有 78-1型高速微量粉碎机(浙
江温岭粮食检验仪器厂产品)、SHG-1 型生物化学
发光测量仪(上海技术监督局实验工厂产品)和 721
型分光光度计(上海第三分析仪器厂产品)等 。
1.2　非精油组分提取方法
参考文献[ 5]的方法提取叶片粉末中的精油 ,收
集提取出精油后的全部残渣。精油提取重复 4 次 ,
合并所有残渣 ,再分别采用水提法 、甲醇-水提法和
乙酸乙酯提法从残渣中提取非精油组分 。
1.2.1　水提取法[ 6] 　称取香桃木叶粉末提取精油
后的残渣约 58 g ,置蒸馏瓶中 ,加入 300 mL 超纯
水 ,置于 100 ℃水浴锅中 ,5 h 后过滤 ,保存滤液;在
残渣中再加入 180 mL 超纯水 ,置 100 ℃水浴锅中 ,
5 h 后过滤 ,保存滤液;在残渣中再加入 60 mL 超纯
水 ,置 100 ℃水浴锅中 ,5 h 后过滤 ,保存滤液 ,合并
3次滤液于培养皿中 ,冷冻干燥。
1.2.2　甲醇-水提取法[ 6] 　称取香桃木叶残渣约 40
g ,置蒸馏瓶中 ,加入 200 mL 甲醇与超纯水的混合溶
液[ V(甲醇)∶V(超纯水)=9∶1] ,置于 40 ℃水浴锅
中 ,12 h后过滤 ,保存滤液;在残渣中再加入 200 mL
甲醇与超纯水的混合溶液[ V(甲醇)∶V(超纯水)=
1∶1] ,置 40 ℃水浴锅中 , 12 h 后过滤 ,保存滤液。
合并 2 次滤液 ,加入等体积的氯仿 , 静置萃取 10
min ,弃除下层氯仿 ,收集上层液体 ,重复 3次。将所
得滤液置于旋转蒸发仪中 ,于 60 r/min 、45 ℃下减
压蒸发 2 h ,收集剩余混合液于培养皿中 ,冷冻干燥。
1.2.3　乙酸乙酯提取法[ 7] 　称取香桃木叶粉末残
渣约 35 g ,置蒸馏瓶中 ,加入 200 mL 乙酸乙酯 ,置
于 65 ℃水浴锅中回流提取 , 5 h 后过滤 ,保存滤液;
在残渣中再加入 200 mL乙酸乙酯 ,置 65 ℃水浴锅
中回流提取 , 5 h 后过滤 ,保存滤液;在残渣中再加
入 200 mL 乙酸乙酯 ,置 65 ℃水浴锅中回流提取 ,5
h后过滤 ,保存滤液;合并 3次滤液 ,置旋转蒸发仪
中 ,在 60 r/min 、45 ℃下减压蒸发 2 h ,收集剩余混
合液于培养皿中 ,冷冻干燥。
1.3　分析方法
1.3.1　产生 O -·2 的化学发光体系　采用邻苯三酚
自氧化产生 O -·2 的化学发光体系[ 8] 。
1.3.2 　产生 · OH 的化学发光体系 　参考文献
[ 9] ,采用 CuCl-Phen-H 2O 2 的化学发光体系 。
1.3.3　DNA 损伤的化学发光体系　采用 CuSO 4-
Phen-Vit.C-DNA-H2O2 化学发光体系[ 10] 。
1.3.4　产生过氧亚硝基阴离子自由基(ONOO -)
的化学发光体系　参考文献[ 11] ,采用羟胺自氧化
产生 ONOO-的化学发光体系。
1.3.5　产生脂质过氧化的比色体系　参考文献
[ 12] ,采用以Fe2+诱发卵黄磷脂C-2位上的极低密度
脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)过不饱和脂肪
酸(PUFA)的过氧化模型。卵黄悬液中卵黄与 0.1
mol/ L磷酸钠缓冲液(pH 7.45)的体积配比为 1∶30。
1.3.6　二苯代苦味肼基自由基(DPPH ·)的比色
体系　参考文献[ 13] 的 DPPH ·分析法并略加修
改:在 2.5 mL 、6.5×10-5 mo l/L DPPH ·溶液中 ,
加入 0.5 mL 试样(空白对照用等体积三蒸水代
替),总体积 3 mL ,混匀 ,室温下放置 15 min 后 ,于
光径 1 cm 比色皿中测定 DPPH ·混合溶液在 517
nm 处吸光值 。抑制率/%=(空白对照值 -样品
值)/空白对照值×100%。
202 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
2　结果与分析
2.1　香桃木叶非精油组分提取物对 O-·2 的清除能力
由邻苯三酚自氧化所产生的 O -·2 ,能与发光剂
鲁米诺反应产生化学发光 , O -·2 的浓度与鲁米诺发
光强度成正比[ 8] 。图 1显示 ,香桃木叶的水提物 、甲
醇-水提物和乙酸乙酯提物 ,对由邻苯三酚体系产生
的 O -·2 所引起的化学发光均有明显抑制作用 ,且量
效关系明显 ,其化学发光半抑制质量浓度(IC50)分
别为 415 ,232和 369 μg/mL ,表明香桃木叶的甲醇-
水提取物对 O -·2 的清除效果最为明显 。当质量浓度
大于 380μg/mL时 ,甲醇-水提取物对O -·2 引起的化
学发光的抑制率开始趋于平缓;当质量浓度大于
500 μg/mL 时 ,乙酸乙酯提物对 O -·2 所引起的化学
发光的抑制作用也趋于恒定。
2.2　香桃木叶非精油组分提取物对 ·OH 的清除
作用
CuCl与 H 2O 2 反应产生 ·OH , ·OH 与 Phen
作用产生化学发光[ 9] 。图 2显示 ,香桃木叶水提物 、
甲醇-水提物和乙酸乙酯提物对 ·OH 的清除作用
量效关系明显 ,其抑制率均随各种提取物质量浓度
的增加而逐渐升高 , 它们的 IC50分别为 42.25 ,
26.72和 23.05 μg/mL , 表明乙酸乙酯提取物对
·OH清除效果最为明显 。当质量浓度大于 20
μg/mL以后 ,香桃木叶甲醇-水提物和乙酸乙酯提物
对·OH 清除效果迅速增加 。
图 1　香桃木叶非精油组分提取物对 O -·2 的清除作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
Fig.1　Effects of nonessention oil e xtr acts o f
Myrtus communis Linn.leaves on scavenging O -·2
-△-.Disti lled w ater ex tract ion;-□-.Methanol-disti lled
w ater ext raction;-◇-.Ethyl acetate ext raction
图 2　香桃木叶非精油组分提取物对· OH 的清除作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
Fig.2　Effects o f nonessention oil ex tracts of
Myrtus communis L inn.leav es on scavenging · OH
-△-.Dis til led w ater ext raction;-□-.Methanol-dist illed
w ater ex tract ion;-◇-.Ethyl acetate ex t raction
2.3　香桃木叶非精油组分提取物对 ·OH 引起的
DNA 氧化损伤的保护作用
CuCl-Phen-H2O -2 化学发光体系生成的 ·OH
氧化损伤 DNA ,并伴随化学发光 , 该发光峰值与
DNA 氧化损伤程度呈正相关关系 ,所以加入抗氧化
剂可使该发光动力学曲线发生明显变化 ,表现为峰
值下降(抑制效应)[ 10] 。图 3 显示 ,香桃木叶水提
物 、甲醇-水提物和乙酸乙酯提取物 ,均对 DNA 损伤
产物发光峰值具有强烈抑制作用 ,其抑制率均随着
各种提取物质量浓度的增加逐渐增大 ,且呈剂量依
赖性 ,其 IC50分别是 322 , 116.7和 153.5μg/mL。提
示香桃木叶 3种提取物清除了链延伸自由基 ,起到
了断链型抗氧化剂的作用 。
2.4　香桃木叶非精油组分提取物对 ONOO-的清
除作用
图 4显示 ,随着质量浓度的增加 ,香桃木叶水提
物 、甲醇-水提取物和乙酸乙酯提取物 ,对 ONOO-
引起的化学发光的抑制作用逐渐增强 ,其 IC50分别
为 18.2 ,10.6和 13.9 μg/mL ,其中甲醇-水提取物
对 ONOO -的清除效果最佳 。
2.5　香桃木叶非精油组分提取物的抗脂质过氧化
作用
Fe2+可诱发卵黄中脂蛋白 PUFA 过氧化产生
烷氧基(RO ·)和烷过氧基(ROO ·),继而引发自由
基的链式反应 。在加热条件下 ,过氧化产物丙二醛
(MDA)可与硫代巴比妥酸(TBA)反应产生红色化
合物 ,并在波长 532 nm 处有显著光吸收[ 12] ,加入抗
氧化剂可抑制脂质过氧化作用 ,使光吸收值降低。
图 5表明 ,香桃木叶水提物 、甲醇-水提物和乙酸乙
酯提取物均能有效抑制 Fe2+诱发的脂质过氧化 ,且
随着提取物质量浓度的增加 ,抑制作用增强 ,其 IC50
分别是 3.82 ,2.65和 2.49 mg/mL 。由此可知 ,乙酸
203第 5 期 方献平等:香桃木叶非精油组分体外清除自由基和抗氧化作用研究
乙酯提取物的效果优于水提物和甲醇-水提物 ,提示
乙酸乙酯提物能更有效地清除 RO·和 ROO · ,从而
防止或减缓 PUFA 发生自由基链式反应 。
图 3　香桃木叶非精油组分提取物对 DNA
氧化损伤的抑制作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
Fig.3 Effects of nonessential oil ex tracts of Myrtus communis
Linn.leav es on inhibiting DNA ox idativ e damage
-△-.Dist illed w ater ext raction;-□-.M ethanol-dist illed w ater
ext raction;-◇-.Ethyl acetate ext ract ion
图 4　香桃木叶非精油组分提取物
对 ONOO-的清除作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
Fig.4　Effects of nonessential oil ex tracts
o f Myrtus communis Linn.leaves on scavenging ONOO -
-△-.Dis til led w ater ext raction;-□-.Methanol-dist illed
w ater ex tract ion;-◇-.Ethyl acetate ex t raction
2.6　香桃木叶非精油组分提取物对 DPPH ·的清
除作用
DPPH ·是一种稳定的有机自由基 ,该体系依
据DPPH ·在517 nm 处有一强吸收峰 ,自由基清除
剂与其单电子配对而使其吸收逐渐消失 ,吸光值的
变化与其接受的电子数成定量关系 ,因而通过分光
光度法检测生物试剂对 DPPH ·的清除能力 ,即可
表示其抗氧化性能力的强弱[ 13-14] 。图 6显示 ,香桃
木叶 3种提取物都表现出了较好的清除 DPPH ·能
力 ,随着提取物质量浓度的增加 ,清除能力迅速增
强 ,直至抑制率约为 80%时才趋缓 。其中水提物和
甲醇-水提物的 IC50分别是 42.3和 21.9 μg/mL ,而
乙酸乙酯提取物清除能力更强 , IC50为 15.29
μg/mL。
图 5　香桃木叶非精油组分提取物的抗脂质过氧化作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
F ig.5　Effects of nonessentia l oil ex tracts of
Myrtus communis Linn.leaves on inhibiting pe rox idation
-△-.Dist illed w ater ext raction;-□-.M ethanol-dist illed w ater
ext raction;-◇-.Ethyl acetate ext ract ion
图 6　香桃木叶非精油组分对 DPPH ·的清除作用
-△-.水提取物;-□-.甲醇-水提取物;-◇-.乙酸乙酯提取物
Fig.6　Effects o f none ssential o il ext racts o f Myrtus communis
Linn.leaves on scaveng ing lipid pe rox idation DPPH ·
-△-.Dis til led w ater ext raction;-□-.Methanol-dist illed
w ater ex tract ion;-◇-.Ethyl acetate ex t raction
204 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
3　讨　论
在体内多种活性氧和活性氮中 , O -·2 是各种活
性氧的源头 , ·OH 是毒性最强的活性氧 , ONOO-
是毒性最强的活性氮 ,后两者是造成生物有机体过
氧化损伤的主要元凶 ,许多疾病的发生及发展都与
这 3 种活性氧和活性氮密切相关。本研究结果表
明 ,香桃木叶非精油组分 3种提取物既可以控制机
体活性氧发生的源头 O -·2 ,也可以清除危害人体健
康的活性氧元凶 ·OH 和活性氮元凶 ONOO - ,在
防止机体氧化损伤中具有重要的作用。但这 3种提
取物的清除能力存在差异 ,其中甲醇-水提取物清除
O
-·
2 和 ONOO -能力最强 , 乙酸乙酯提取物清除
·OH效果最佳 。
·OH 可使 DNA 突变 ,引发癌基因活化和抑癌
基因失活 ,引起细胞恶性增殖 ,因此保护 DNA 免受
氧化损伤可防止肿瘤的发生和发展。本研究中 ,香
桃木叶非精油组分 3种提取物均能有效地减轻或消
除·OH 对 DNA 的氧化损伤。
活性氧也可氧化损伤生物膜 ,导致膜脂质过氧
化 ,继而损伤细胞 ,引起机体病变。本研究显示 ,香
桃木叶非精油组分 3种提取物均能有效抑制脂质过
氧化 ,其清除 DPPH ·的能力进一步旁证了这一作
用。
由此可见 ,香桃木叶非精油组分是一种有应用
价值的天然抗氧化剂和自由基清除剂 ,可以作为外
源性的天然抗氧化剂和自由基清除剂 ,协同人体内
自由基清除系统有效地抵御多种自由基的损害。
文献已报道 ,香桃木叶中含有大量的黄酮类和
酚类物质[ 15] ,而这些物质往往具有清除自由基和抗
氧化作用[ 13] 。所以推测香桃木叶非精油组分抗氧
化 、清除自由基的作用 ,可能与其含有黄酮类和酚类
物质等组分有一定的相关性。
目前 ,世界各国对于芳香植物的开发和研究 ,主
要集中于精油研究 ,而本研究结果提示 ,其非精油组
分也具有一定的营养保健价值和药用功效。非精油
组分存在于芳香植物叶提取精油之后的残渣中 ,也
存在于传统药用成分提取之后的废物中 ,提取出其
中的有效成分 ,研究清楚其营养保健和药用价值 ,无
疑对延长产业链 ,降低生产成本 ,提高芳香植物的综
合利用效益 ,具有积极的指导意义 。
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210 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷