全 文 ：分子植物育种，2012年，第 10卷，第 1期，第 62-66页
Molecular Plant Breeding, 2012, Vol.10, No.1, 62-66
研究报告
Research Report
从狼毒大戟中克隆蓖麻烯合成酶基因
刘洪伟 1,2 唐其 2,3 杨艳芳 1,2 张楠 1,2 邱德有 1,2*
1中国林业科学研究院林业研究所,北京, 100091; 2林木遗传育种国家重点实验室,北京, 100091; 3中国医学科学院药用植物研究所广西分所,
南宁, 530023
*通讯作者, qiudy@caf.ac.cn
摘 要 本研究采用 RACE-PCR技术从狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)根中克隆到一个蓖麻烯合成
酶(casbene synthase)基因，命名为 EfCS (GenBank登录号为: JN862821)。该基因长 1 969 bp，编码 602个氨基
酸，具有典型的萜类合成酶的基因结构。对 CS基因编码氨基酸序列进行生化特性分析发现其理论等电点为
5.36，分子量为 69.364 8 kD。通过疏水性分析，发现 CS整体表现为亲水性。进行导肽分析结果发现其具有叶
绿体导肽。二级结构预测表明，CS蛋白由 α-螺旋、延伸链、β-转角和随意卷曲构成，它们分别占到64.95%、
6.64%、3.16%和 25.25%。另外，对 CS蛋白质进行三级结构预测，发现蓖麻烯合成酶属Ⅰ类萜类合成酶。
关键词 狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.),蓖麻烯合成酶
Casbene Synthase Gene cloned from Euphorbia fischeriana Steud.
Liu Hongwei 1,2 Tang Qi 2,3 Yang Yanfang 1,2 Zhang Nan 1,2 Qiu Deyou 1,2*
1 The Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing, 100091; 2 State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Beijing,
100091; 3 Guangxi Branch Institute, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Nanning, 530023
* Corresponding author, qiudy@caf.ac.cn
DOI: 10.3969/mpb.010.000062
Abstract Casbene synthase may play an important role in biosynthesis of tigliane type terpenoid. Casbene synthase
gene, named as EfCS (GenBank accession number JN862821), was cloned from the root of Euphorbia fischeriana
Steud. through RACE-PCR. The fragment was 1 969 bp in length and contained an open reading frame coding a
polypeptide of 602 amino acids. This CS protein from E. fischeriana has a typical terpenoid synthase gene
structure. Through biochemical analysis of the amino acid sequence coding by CS gene, we found the theoretical
isoelectric point of CS is 5.36 and the molecular weight is 69.364 8 kD. By hydrophobic analysis, we found the
overall performance of CS is hydrophilic. The lead peptide analysis revealed that the peptide has a chloroplast
guide sequence. Secondary structure prediction showed that this CS protein is mainly composed with α-helix,
extended chain, β-turn and random coil, which accounts for 64.95%, 6.64% , 3.16% and 25.25% respectively.
Protein tertiary structure prediction showed that our casbene synthase belongs to classⅠ terpene synthase.
Keywords Euphorbia fischeriana, Casbene synthase
大戟科植物中含有种类繁多的萜类化合物，从
单萜、倍半萜、二萜到三萜都有广泛分布。这些化合
物中很多都被发现具有毒性或者潜在的治疗活性
(Cox, 1993; Barlow et al., 2005; Cragg and Newman,
2005; Li et al., 2009)。佛波酯类化合物 Prostratin
(12-deoxyphorbal-13-acetate)是一种巴豆烷型二萜化
合物。它是在 20世纪 90年代由美国国立癌症研究
基金项目：本研究由中国林业科学研究院林业研究所重点项目(ZD200902)资助
所(NCI)分离得到并被证实具有良好的抵抗艾滋病病
毒的作用(Gustafson et al., 1992)，所以近年来巴豆烷
型二萜化合物生物合成途径的研究引起了国内外科
学家的广泛兴趣。
蓖麻烯合成酶(Casbene synthase, CS; EC 4.6.1.7)
被认为是合成巴豆烷型二萜过程中的关键酶，它通
过催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)环化生成中
间体西松烷 (Cembrane)，接着由 Cembrane 变成蓖
麻烯(Casbene)，再通过一系列电子转移形成巴豆烷
(Tigliane) (Schmidt, 1987)。目前已从蓖麻(Ricinus
communis)、乌桕(Triadica sebifera)、乳浆大戟(Euphorbia
esula)、白角麒麟(Euphorbia resinifera)和 Mamala 树
(Homalanthus nutans)中克隆到 CS 基因(Kirby et al.,
2010)，Sato等在 2011年对麻风树(Jatropha curcas L.)
进行了基因组测序，并发现了 9个 CS类似基因(经分
析认为其中一个为假基因)，并公布了其中 6个基因
的氨基酸序列(Sato et al., 2011)。上海药物研究所已
从狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)的根中也分
离到了 prostratin (Liu et al., 1996; Ma et al., 1997; Wang
et al., 2006)，但狼毒大戟中的 CS基因还未被克隆。
我们采用 RACE-PCR 技术从狼毒大戟根中克
隆到一个蓖麻烯合成酶基因，并对该萜类合成酶进
行了相应的生物信息学分析，现将有关方法和结果
报道如下。
1结果与分析
1.1狼毒大戟 CS基因片段的获得
通过转录组数据分析得到了一个长 591 bp 的
CS片段。
1.2 狼毒大戟 CS 基因的 cDNA 全长的获得及序列
分析
以狼毒大戟块状根的 cDNA为模板，利用特异
性引物 RP1和 UPM进行 3RACE PCR扩增，得到
1 201 bp 片段(图 1)；利用特异性引物 LP1 和 UPM
进行 5RACE PCR扩增后，再以其产物为模板，利用
引物 LP2和 NUP进行巢式扩增，得到 803 bp片段
图 1狼毒大戟 CS基因的 PCR扩增电泳图
注: M: DL2000 marker; 1: 3RACE扩增产物; 2: 5RACE扩增
产物; 3:编码区扩增产物
Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of CS gene
fragments in Euphorbia fischeriana
Note: M: DL2000 marker; 1: Amplification product of 3RACE;
2: Amplification product of 5RACE; 3: Amplification product
of ORF
(图 1)。根据得到的两个片段设计全长引物 EfCS1-1
和 EfCS2-1进行 ORF扩增验证，经测序表明其序列
为 1 809 bp。
将 RT-PCR及 RACE-PCR扩增片段拼接，最终
获得长度为 1 969 bp 的狼毒大戟 CS cDNA全长序
列，命名为 EfCS，GenBank登录号为 JN862821。利用
NCBI提供的 ORF Finder进行分析发现，该 cDNA全
长包含有一个 1 809 bp 的开放读码框和一个 poly
(A)尾巴，5非翻译区长 38 bp，3非翻译区长 122 bp，
基因共编码 602个氨基酸。
1.3生物信息学分析
使用 ProtParam (Gasteiger et al., 2003)在线工具
分析预测 CS基因编码蛋白的等电点为 5.36，分子
量为 69.364 8 kD。用在线工具 ProtScal (Kyce and
Doolittle, 1982)，选定默认参数，分析其编码蛋白的
疏水性，结果显示疏水性最大值为 2.978(V347)，最小
值为-3.067(N273)，整体表现为亲水性。利用在线工具
TargetP 1.1 Server (Emanuelsson et al., 2000)，选择 plant
version及默认参数，对 CS氨基酸系列进行预测，
结果发现其具有叶绿体导肽，可靠级别为Ⅱ。用
SOPMA (Geourjon and Deléage, 1995)进行二级结构
预测表明，EfCS蛋白由 391 个氨基酸组成的 25 个
α-螺旋，40个氨基酸组成的 13延伸链，19个氨基酸
组成的 10个 β-转角和152个氨基酸组成的 28个
随意卷曲构成，它们分别占到 64.95%、6.64%、3.16%
和 25.25%。另外，利用在线工具 SMART (Schultz et
al., 1998)对其编码的氨基酸序列进行分析发现，该
基因包含萜类合成酶特有的两个特征域 Terpene_
synth和 Terpene_synth_C，分别位于 74~249氨基酸
位点和 279~547氨基酸位点。利用 ESyPred3D Web
Server 1.0 (Lambert et al., 2002)同源建模的方法，选用
神经网络和新展示技术预测 CS蛋白的三级结构，如
图 2所示为 EfCS蛋白质的三级结构。由三级结构
可以看出蓖麻烯合成酶属Ⅰ类萜类合成酶(α 区 ,
蓝色区) (Cao et al., 2010)，其包含金属离子结合区
DDXXD和(N, D)DXX(S, T)XXXE(分别为红色和橙
色区域) (K觟ksal et al., 2011)；同时连着一个小的退化
区(β区,绿色区)，这类区主要在Ⅱ类萜类合成酶中
发挥作用(Wendt et al., 1997)；紫色区域为第一个 α
螺旋，在Ⅰ类萜类合成酶中起给活性中心加盖的作
用(K觟ksal et al., 2011)。
2讨论
蓖麻烯合成酶很可能是巴豆烷型二萜合成途径
从狼毒大戟中克隆蓖麻烯合成酶基因
Casbene Synthase Gene cloned from Euphorbia fischeriana Steud. 63
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2狼毒大戟 CS的三维高级结构预测
注:蓝色: α区;红色:金属离子结合区 DDXXD;橙色:金属离
子结合区(N, D)DXX(S, T)XXXE;绿色: β区;紫色:第一个 α
螺旋
Figure 2 Predicted three-dimensional structure of CS in Euphorbia
fischeriana
Note: Blue: α domain; Red: metal-binding motif DDXXD; Orange:
metal-binding motif (N, D)DXX(S, T)XXXE; Green: β domain;
Purple: the first α helix
中的一个关键酶，对它的了解将有助于巴豆烷型二
萜生物合成的研究工作。狼毒大戟为大戟科植物，狼
毒大戟蓖麻烯合成酶基因克隆的工作还未见有报
道。本研究通过 RACE技术，从狼毒大戟根中克隆到
一个 CS基因，通过生物信息学分析发现，狼毒大戟
中的 CS蛋白属于酸性蛋白质，等电点为 5.36，通过
亲水性 /疏水性分析发现 CS为亲水性蛋白，可为该
蛋白的分离提供参考。由于 CS 在细胞中的底物
GGPP主要存在于叶绿体当中，其叶绿体导肽的存在
与否将是行使其功能的关键(Kirby et al., 2010)，预测
数据显示 CS具有叶绿体导肽，通过 ChloroP 1.1验
证发现，两者数据相符。对 CS进行的二级结构和三
级结构分析显示，CS是Ⅰ类萜类合成酶，这为该酶
的体外活性检测和功能分析提供了一定依据。
人们已经从狼毒大戟中分离得到杀虫、杀菌及
抗癌等活性物质(刘桂芳等, 1988; 刘文粢等, 2000;
赵奎君等, 2000; 马承惠等, 2005,中国科技信息, 12:
65, 89)。中国科学院上海药物所已从狼毒大戟根中
鉴定出 Prostratin，但其含量不高。通过分子生物学方
法获得 Prostratin 合成过程中的蓖麻烯合成酶这一
候选关键酶基因，为我们今后对狼毒大戟或微生物
进行转基因改造以提高其 Prostratin 的产量奠定了
一个基础。
3材料与方法
3.1植物材料
狼毒大戟块状根采取自黑龙江加格达奇，菌株大
肠杆菌(Escherichia coli) DH5α购自 TAKARA公司。
3.2总 RNA的提取和 cDNA的合成
使用 QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit 按照其
说明书的步骤进行提取；cDNA的合成使用 Clontech
公司的 SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit，
按照说明书的步骤合成 5和 3RACE Ready cDNA。
3.3基因的克隆与测序
根据本实验室所测狼毒大戟数据库中的 EST片
段，设计特异性引物 RP1 (5-ACATAACCAATGCC
CTGGAACAACCT-3(2-1))并且使用试剂盒提供的
引物 UPM (5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAA
GCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 )进行 3RACE
PCR。PCR扩增条件为 94℃预变性 5min；94℃ 1min，
55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35个循环；72℃ 10 min。利
用特异性引物 LP1 (5-CATGAATCCAACGGTGCT
GACCAGAGG-3 (1-3))和 UPM (5-CTAATACGAC
TCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG
AGT-3) 进行第一轮 5RACE PCR；PCR扩增条件为
94℃预变性 3 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，
共 35个循环；72℃ 10 min。以第一轮 PCR产物稀释
100倍为模板，设计特异性引物 LP2 (5-CCATAGTG
AAAAGGTTGTTCCAGGGCA-3(1-4))和 NUP (5-C
TAATACGACTCACTATAGGGC-3) 通过巢式 PCR
进行第二轮 5RACE PCR；PCR扩增条件为 94℃预
变性 3 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35
个循环；72℃ 10min。目的片段的克隆参照 pMD20-T
载体(TAKARA)说明书进行，序列测定由北京华大基
因有限公司完成。将获得的序列与数据库中该基因
序列进行人工拼接，最终得到目的基因的全长理论
序列。在目的基因的两端设计特异性引物 EFCS1-1
(5-ATGGCATTGCAACCAGC-3)和 EFCS2-1 (5-T
TAAAGTAAAATAGGATCAACG AAC-3)克隆全长
cDNAORF，再克隆到 pMD20-T载体进行测序验证。
3.4目的基因的序列分析
目的基因序列的在线分析利用 NCBI、ExPASy、
CBS 网站上的有关生物信息学软件进行(表 1)：其
中 CS 开放阅读框(open reading frame)的查找通过
NCBI-ORF Finder完成；核酸及氨基酸序列的组成
成分、理化性质分析利用 ProtParam在线工具完成；
蛋白质导肽预测预测利用在线工具 TargetP 1.1 和
ChloroP 1.1完成；蛋白质的亲水性 /疏水性分析通过
ProtScale进行；蛋白质二级结构和功能域的预测分
别利用 SMART和 SOPMA进行；蛋白质的三级结构
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从狼毒大戟中克隆蓖麻烯合成酶基因
Casbene Synthase Gene cloned from Euphorbia fischeriana Steud.
的预测则通过利用 ESyPred3D在线工具完成。
作者贡献
刘洪伟是本实验研究的执行人；刘洪伟、杨艳芳
完成数据分析，论文初稿的写作；唐其参与 RACE工
作；张楠参与 RNA提取工作；邱德有是项目的构思
者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与
修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
感谢黑龙江省大兴安岭农林科学院梁延海研究
员课题组提供植物实验材料。
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表 1在线分析工具网址
Table 1 Website of online tools
工具名称
Tool name
NCBI-ORF Finder
ProtParam
TargetP1.1
ChloroP 1.1
ProtScale
SMART
SOPMA
ESyPred3D
网址
Website
http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
http://www.expasy.ch/tools/protparam.html
http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/
http://www.expasy.ch/tools/protscale.html
http : //smart . embl-heidelberg . de/smart/set_
mode.cgi?GENOMIC=1
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.
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