全 文 ：马比木根中喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的 HPLC分析*
白永花1，2，宋启示1＊＊
(1．中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室，昆明 650223;2．中国科学院大学，北京 100049)
* 中国科学院重要方向项目(KSCX2 － EW － Ｒ －15)，中国科学院“一三五”专项(XTBG － F02)
＊＊ 通讯作者 Tel:(0871)65160902;E － mail:songqs@ xtbg． ac． cn
第一作者 Tel:(0871)65138281;E － mail:byh4856@ 126. com
摘要 目的:建立测定马比木根中喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的高效液相色谱法。方法:采用 5 种方法对马比木根中的喜树
碱和 9 －甲氧基喜树碱进行提取;运用高效液相色谱法，采用 Waters Symmetry C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)，以甲醇 －
水(50∶ 50)为流动相，流速 0. 8 mL·min －1，检测波长 254 nm，柱温 26 ℃。结果:喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱进样量分别在
0. 24 ～ 4. 00 μg(r = 0. 9997)和 0. 24 ～ 4. 00 μg(r = 0. 9995)范围内线性关系良好;乙醇溶液室温浸泡提取得到的喜树碱含量
(0. 944%)和 9 －甲氧基喜树碱含量(0. 237%)明显高于其他方法。马比木是目前发现的喜树碱类含量最高的植物。结论:本
文建立的 HPLC检测法简便、准确、灵敏度高，乙醇溶液室温浸泡提取法安全，成本低，提取率高，适用于喜树碱类提取和马比
木的质量检测。
关键词:马比木根;假柴龙树属;喜树碱;9 －甲氧基喜树碱;不同提取方法比较;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)01 － 0100 － 04
HPLC analysis of camptothecin and 9 － methoxycamptothecin in the
roots of Nothapodytes pittosporoides*
BAI Yong － hua1，2，SONG Qi － shi1＊＊
(1． Key Laboratory of Tropical Plant Ｒesource and Sustainable Use，Xishuangbanna Tropical Botanical Garden，Chinese
Academy of Sciences，Kunming 650223，China;2． University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract Objective:To establish an HPLC method for the determination of camptothecin and 9 － methoxycampto-
thecin in the roots of Nothapodytes pittosporoides．Methods:Five extraction methods were carried out respectively in
the extraction of camptothecin and 9 － methoxycamptothecin from roots of N． pittosporoides． HPLC was adopted． The
separation was performed on a Waters Symmetry C18 column(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)at 26 ℃ ． The mobile phase
was methanol － water (50∶ 50)with a flow rate of 0. 8 mL·min －1 ． The detective wavelength was set at 254 nm．
Ｒesults:The linear ranges for camptothecin and 9 － methoxycamptothecin were 0. 24 － 4. 00 μg(r = 0. 9997)and
0. 24 － 4. 00 μg(r = 0. 9995)respectively． The contents of camptothecin and 9 － methoxycamptothecin of the ex-
tracts from soaking in ethanol under room temperature were 0. 944% and 0. 237% respectively，which were higher
than other extraction methods． N． pittosporoides contained the highest amount of camptothecins． Conclusion:This
method is simple，sensitive，and accurate，which is suitable for extraction and analysis of camptothecins，and also can
be applied in the quality control of N． pittosporoides．
Key words:root of Nothapodytes pittosporoides;Nothapodytes;camptothecin;9 － methoxycamptothecin;comparison of
different extraction methods;content determination;HPLC
马比木(Nothapodytes pittosporoides (Oliv．)Sle-
um．)为茶茱萸科假柴龙树属植物，又名海桐假柴龙
树、公黄珠子、追风伞。马比木为灌木，分布于贵州、
湖南、湖北、四川等地［1］。入药能祛风除湿、理气散
寒，主治风寒湿痹、浮肿、疝气。假柴龙树属植物共
7 种，已有报道该属的臭味假柴龙树(青脆枝)含有
—001— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(1)
喜树碱，其平均含量可达到干重的 0. 3%［2］。喜树
碱及其衍生物具有较好的抗肿瘤活性，已经成为了
抗肿瘤药物的主要成分之一。喜树碱由 Wall［3］等
首次从喜树植物中分离出来，但据报道喜树中喜树
碱的含量较低，如福建产喜树果实中喜树碱的含量
最高为干重的 0. 169%［4］。而马比木植株中也含有
大量喜树碱，其中喜树碱含量最高的为细根(可达
干重的 0. 53%)，主根次之，茎、枝、叶、花序、果实和
种子也含有喜树碱［5］，为极具价值的抗肿瘤药物资
源。国内外有关喜树碱提取分离和含量测定的研究
已有许多报道［6 － 7］，马比木根中喜树碱含量测定的
方法也有一些报道［5，8 － 11］，但马比木根中 9 －甲氧基
喜树碱含量测定的方法还未见报道。本研究分别采
用 5 种方法对马比木根中的化学成分进行提取，再
采用高效液相色谱法测定提取物中喜树碱和 9 －甲
氧基喜树碱的含量，比较这 5 种提取方法对喜树碱
和 9 －甲氧基喜树碱的提取效果，选出从马比木根
中获取喜树碱和 9 － 甲氧基喜树碱的最佳提取方
法，为开发利用马比木植物资源奠定基础。
1 仪器与试药
Waters 1525 分析型高效液相色谱仪;AL104 型
电子天平;DWF －100 型电动植物粉碎机;98 － 1 － B
型加热提取器。喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱对照品
为实验前期分离所得，纯度为 97%左右;提取时所
用甲醇、乙醇、氢氧化钠、盐酸为分析纯，HPLC 所用
甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。
马比木(Nothapodytes pittosporoides)的根于 2011
年 10 月采于湖南省凤凰县，并由中国科学院西双版
纳热带植物园宋启示研究员鉴定，标本存放在中国
科学院西双版纳热带植物园民族药研究组实验室。
2 方法与结果
2. 1 提取方法
将采集来的马比木根晾干，粉碎过 60目筛，备用。
采用以下5种方法对马比木根中的化学成分进行提取。
2. 1. 1 方法 1(乙醇热回流提取法) 取粉碎好的样
品 300 g，加入 80%乙醇溶液 3000 mL加热回流提取 3
次，每次 8 h。合并提取液，减压浓缩制成干浸膏。
2. 1. 2 方法 2(乙醇室温浸泡提取法) 取粉碎好
的样品 300 g，加入 80%乙醇溶液 3000mL室温浸泡
提取 3 次，每次 24 h，前 12 h每隔 1 h 超声 1 次(功
率 260 W，频率 40 kHz，每次 5 min)。合并提取液，
减压浓缩制成干浸膏。
2. 1. 3 方法 3(甲醇热回流提取法) 取粉碎好的样
品 100 g，加入 95%甲醇溶液 1000 mL加热回流提取 3
次，每次 8 h。合并提取液，减压浓缩制成干浸膏。
2. 1. 4 方法 4(碱法提取) 取粉碎好的样品 300 g，
用 0. 3%氢氧化钠溶液冷浸提取 3 次，每次 8 h，氢氧
化钠溶液用量为16 mL·g －1。合并提取液，向提取液
中加硫酸调 pH至 5 ～6，减压浓缩制成干浸膏。
2. 1. 5 方法 5(酸法提取) 取粉碎好的样品 300
g，用 pH为 1. 9 的盐酸溶液冷浸提取 3 次，每次 8 h。
合并提取液，减压浓缩制成干浸膏。
2. 2 溶液制备
2. 2. 1 供试品溶液 精密称取上述 5种提取方法得
到的干浸膏适量(方法 1 所得干浸膏:35. 9 mg;方法 2
所得干浸膏:17. 4 mg;方法 3 所得干浸膏:19. 3 mg;方
法 4所得干浸膏:99. 9 mg;方法 5 所得干浸膏:100. 9
mg)，分别加入色谱甲醇适量，超声(功率 260 W，频率
40 kHz)溶解 30 min后定容至 10 mL，8000 r·min －1离
心 10 min，经 0. 45 μm的滤膜过滤，即得。
2. 2. 2 对照品储备液 分别取喜树碱和 9 －甲氧
基喜树碱的对照品适量，精密称定，加色谱甲醇制成
浓度均为 0. 20 mg·mL －1的单一成分对照品储备
液，避光保存，备用。
2. 3 色谱条件
色谱柱:Waters Symmetry C18(4. 6 mm ×250 mm，
5 μm);流动相:甲醇 －水(50∶ 50);流速:0. 8 mL·
min －1;检测波长:254 nm;柱温:26 ℃;进样量:20 μL。
该色谱条件下喜树碱、9 －甲氧基喜树碱对照品和乙
醇室温浸泡提取法所得样品的色谱图见图 1。
2. 4 线性关系考察
精密吸取喜树碱对照品储备液 0. 6、4. 8、6. 0、8. 0、
10. 0 mL分别置于 10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，
摇匀。分别吸取上述对照品溶液 20 μL，按照“2. 3”项
下色谱条件进行测定。以进样量(X)为横坐标，峰面积
(Y)为纵坐标，得到的喜树碱线性回归方程为:
Y = 4. 918 × 106X + 8. 528 × 104 r = 0. 9997
结果表明，喜树碱进样量在 0. 24 ～ 4. 00 μg 范围内
线性关系良好。
精密吸取 9 －甲氧基喜树碱对照品储备液 0. 6、
3. 6、6. 0、8. 0、10. 0 mL 分别置于 10 mL 量瓶中，加
甲醇定容至刻度，摇匀。分别吸取上述对照品溶液
20 μL，按照“2. 3”项下色谱条件进行测定。以进样
量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得到的 9 －
甲氧基喜树碱线性回归方程为:
Y = 4. 161 × 106X + 9. 983 × 103 r = 0. 9995
结果表明，9 － 甲氧基喜树碱的进样量在 0. 24 ～
4. 00 μg范围内线性关系良好。
—101—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(1)
图 1 对照品和马比木样品 HPLC色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of reference substances and samples
A．喜树碱对照品溶液(reference substance solution of camptothecin) B． 9 －甲氧基喜树碱对照品溶液(reference substance solution of 9 － methoxy-
camptothecin) C．乙醇室温浸泡提取法制备的供试品溶液(test sample solution from soaking in ethanol under room temperature)
1．喜树碱(camptothecin) 2． 9 －甲氧基喜树碱(9 － methoxycamptothecin)
2. 5 精密度试验
分别精密吸取喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的对
照品溶液，照“2. 3”项下色谱条件连续进样 5 次，得
出喜树碱峰和 9 －甲氧基喜树碱面积的 ＲSD分别为
1. 5%和 1. 2%，表明色谱系统精密度良好。
2. 6 重复性试验
取方法 2(乙醇室温浸泡提取法)所得浸膏 5 份，
按“2. 2. 1”项下方法制成供试品溶液，按照“2. 3”项下
色谱条件进样测定。计算出喜树碱平均含量为
0. 956%，ＲSD为 2. 4%;9 －甲氧基喜树碱峰平均含量
为 0. 240%，ＲSD为 2. 2%，表明实验重复性良好。
2. 7 稳定性试验
取方法 2(乙醇室温浸泡提取法)所得浸膏，按
“2. 2. 1”项下方法制成供试品溶液，分别放置 0、2、4、8、
12 h后按照“2. 3”项下色谱条件进样，计算出喜树碱峰
面积的ＲSD为0. 47%，9 －甲氧基喜树碱峰面积的ＲSD
为 3. 6%，表明样品溶液在 12 h内的稳定性良好。
2. 8 回收率试验
取已测含量的方法 2(乙醇室温浸泡提取法)所
得提取液，分为 3 份，各 1 mL，分别精密加入浓度为
0. 20、0. 16、0. 12 mg·mL －1的喜树碱和 9 －甲氧基喜
树碱的对照品溶液各 1 mL，制备供试溶液后按照
“2. 3”项下色谱条件重复进样 3次，测定峰面积，计算
喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的回收率和 ＲSD。结果
喜树碱低、中、高 3 个加入量的平均回收率(n =3)分
别为 92. 53%(ＲSD =0. 80%)、98. 01%(ＲSD =2. 1%)、
102. 5% (ＲSD =3. 4%);9 －甲氧基喜树碱低、中、高 3
个加入量的平均回收率(n =3)分别为 87. 17%(ＲSD =
1. 4%)、93. 91% (ＲSD = 2. 6%)、95. 82% (ＲSD =
3. 4%)。结果表明被测成分加样回收率良好。
2. 9 样品含量测定
精密称取上述 5 种提取方法得到的干浸膏适
量，按“2. 2. 1”项下方法制成供试品溶液，按照
“2. 3”项下色谱条件各进样 3 次，测定峰面积。以
回归方程计算各样品中喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱
的含量。5 种提取方法下马比木根中喜树碱和 9 －
甲氧基喜树碱的含量见表 1。
3 讨论
3. 1 色谱条件的优化
结合相关文献［12］，本研究选择 254、274 nm 2 种
吸收波长对供试品溶液进行试验，结果表明喜树碱
和 9 －甲氧基喜树碱在 274 nm 的吸收不如在 254
nm处的强，故选用 254 nm作为检测波长。在流动
相的优化中，选用了甲醇 －水的体系，以不同配比
—201— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(1)
表 1 马比木根(干重)中喜树碱和 9 －甲
氧基喜树碱的含量测定结果(%，n =3)
Tab 1 Content determination of camptothecin and 9 －metho-
xycamptothecin in the roots of Nothapodytes pittosporoides
提取方法
(extraction method)
喜树碱
(camptothecin)
9 －甲氧基喜树碱
(9 － methoxycamptothecin)
乙醇热回流提取法
(hot ethanol extraction)
0. 517 0. 228
乙醇室温浸泡提取法
(soaking in ethanol
under room temperature)
0. 944 0. 237
甲醇热回流提取法
(hot methanol extraction)
0. 683 0. 118
碱法提取
(alkaline extraction)
0. 328 0. 110
酸法提取
(acid extraction)
0. 050 0. 018
(60∶ 40;50 ∶ 50;40 ∶ 60)进行考察。结果表明，当甲
醇 －水比例为 50∶ 50 时喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱
出峰时间适中，色谱峰形好，喜树碱及 9 －甲氧基喜
树碱能和其他杂质峰完全分离。
3. 2 提取方法的比较
对 5种提取方法的提取率进行比较，结果显示乙
醇室温浸泡提取得到的喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱
含量最高，该方法的提取效果最好，且该方法简便、安
全、成本低。热回流提取要在高温(高于提取溶剂的
沸点)下进行，喜树碱及其衍生物不溶于水和普通的
有机溶剂，对光、热敏感易分解，因而乙醇热回流提取
和甲醇热回流提取的提取效果不如乙醇室温浸泡提
取，并且使用热回流操作烦琐且安全系数低。在长时
间的碱液浸提过程中，由于喜树碱在钠盐中十分不稳
定，很容易和其他物质结合生成更稳定的物质，增加
了还原为喜树碱的难度，导致碱法提取的提取液中喜
树碱和 9 －甲氧基喜树碱含量低。并且喜树碱在酸
水中的溶解度极低，也使得酸法提取的提取率低。
3. 3 小结
本研究以马比木根为原料，测定出马比木根中
喜树碱的含量为 0. 944%，9 －甲氧基喜树碱的含量
为 0. 237%，证明马比木根中富含喜树碱和 9 －甲氧
基喜树碱，是生产喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的好
原料，马比木可作为喜树碱的新植物资源进行深入
研究和开发利用。所建立的高效液相色谱法测定马
比木根中喜树碱和 9 －甲氧基喜树碱的含量方法简
便、快速、准确、灵敏、可靠。本研究得出的最佳提取
条件为:用 80%乙醇溶液室温浸泡提取 3 次，每次
24 h，前 12 h每隔 1 小时超声 1 次(功率 260 W，频
率 40 kHz，每次 5 min)。
参考文献
［1］ Delectis Florae Ｒeipublicae Popularis Sinicae Agendae Academi-
ae Sinicae Edita(中国科学院中国植物志编辑委员会)． Flora
Ｒeipublicae Popularis Sinicae(中国植物志)［M］． Beijing(北
京) :Science Press(科学出版社)，2009:48
［2］ Shaanker ＲU，Ｒamesha BT，Ｒavikanth G，et al． Chemical profi-
ling of Nothapodytes nimmoniana for camptothecin，an important
anticancer alkaloid:towards the development of a sustainable pro-
duction system［M］/ /Ｒamawat KG，Merillon JM． Bioactive Mole-
cules and Medicinal Plants． Berlin:Springer，2008:197
［3］ Wall ME，Wani MC，Cook CE，et al． Plant Antitumor Agents． I．
The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal
leukaemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate［J］． J
Am Chem Soc，1966，88(16) :3888
［4］ LIU Wen － zhe(刘文哲)，QIN Hai － yan(秦海燕)，SUO Zhi －
rong(索志荣)． HPLC analysis of camptothecin and 10 － hydroxy-
camptothecin in fruit of Camptotheca acuminate Decne． (喜树果
中喜树碱和 10 － 羟基喜树碱的 HPLC 分析)［J］． Chin J
Pharm Anal(药物分析杂志)，2005，25(2) :168
［5］ L Jiang － ming(吕江明)，LIU Shi － biao(刘世彪)，CAI Qi －
hui(蔡其辉)，et al． Microscopic fluorescence histological locali-
zation and variation of camptothecin in Nothapodytes pittosporoides
(马比木的显微荧光组织学定位及其中喜树碱的变化研究)
［J］． Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2010，41(9) :1530
［6］ Singh I，Kumaravadive N，Gnanam Ｒ，et al． ＲP － HPLC analysis
for camptothecin content in Nothapodytes nimmoniana，an endan-
gered medicinal plant［J］． J Med Plant Ｒes，2010，4(3) :255
［7］ Zhang J，Yu Y，Liu D，et al． Extraction and composition of three
naturally occurring anti － cancer alkaloids in Camptotheca acumi-
nate seed and leaf extracts［J］． Phytomedicine，2007，14(1) :50
［8］ DENG Shi － ming(邓仕明)，WANG Fa － song(王发松)，ZHOU
Da － zhai(周大寨)，et al． HPLC determination of camptothecin
in roots of Nothapodytes pittosporoides(HPLC法测定马比木根中
喜树碱的含量)［J］． J Anhui Agric Sci(安徽农业科学)，2010，
38(9) :4965
［9］ PU Shang － rao(蒲尚饶)，YANG Lang － sheng(杨朗生)，JIAN-
Kai(蹇凯)，et al． Determination method of camptothecin content
in roots of Nothapodytes pittosporoides (Oliv．)Sleum． by HPLC
(马比木根中喜树碱含量的HPLC测定方法)［J］． J Anhui Ag-
ric Sci(安徽农业科学)，2010，38(6) :2934
［10］ ZHENG Juan(郑涓)，WANG Fa － song(王发松)，LUO Qing －
lin(罗庆林)，et al． Extraction technology of camptothecin from
roots of Nothapodytes pittosporoides(从马比木根中提取喜树碱
的工艺研究)［J］． J Hubei Univ Nat(湖北民族学院学报) ，
2012，30(1) :57
［11］ LI Meng(李猛)，HUANG Yi － han(黄意涵)，LI Qin － yuan(李
沁媛)，et al． HPLC determination of camptothecin in Nothapo-
dytes pittosporoides(HPLC 法测定马比木中喜树碱的含量)
［J］． J Mianyang Norm Univ(绵阳师范学院学报)，2010，29
(2) :60
［12］ WU Kai － hui(吴开慧)，CAI Qi － hui(蔡其辉)，L Jiang －
ming(吕江明)，et al． Camptothecin in herb of Nothapodytes pit-
tosporoides from different areas of Wuling Mountain(武陵山不同
产地马比木药材中喜树碱的含量比较)［J］． Cent South Pharm
(中南药学)，2011，9(3) :197
(本文于 2013 年 3 月 21 日收到)
—301—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(1)