全 文 ：水产研究
地锦草不同提取方法对抑菌效果的影响
汪成竹，王春枝
( 信阳农业高等专科学校 水产科学系，河南 信阳 464000)
摘 要:采用冷水浸渍、乙醇浸渍和水煮煎制等提取方法及对地锦草( Humifusa Euphorbia Willd) 有效成分进行
不同提取时间的提取，研究其提取物对荧光假单胞菌的抑菌活性。结果显示:冷水浸渍提取法所得提取物对荧光
假单胞菌的抑菌效果最优，水煮法次之，乙醇浸渍法最差;冷水浸渍法和乙醇浸渍法均以浸渍 48h抑菌效果最佳，
水煮法以煎制 1h效果最好。因此对地锦草有效成分的提取须采用适当的方法和适当的提取时间。
关键词:地锦草;不同提取方法;抑菌活性;比较
中图分类号: R284． 2 文献标识码: A 文章编号: 1008-4916( 2011) 04-0109-03
The comparision among the several different extraction methods
in the research of the effective components of Humifusa Euphorbia willd
WANG Cheng-zhu，WANG Chun-zhi
( Fisheries Science Department，Xinyang Agricultural College，Xinyang 464000，China)
Abstract: The methods of cold-water extracting，ethanol extracting and hot-water extracting were used to extract the ef-
fective components of Humifusa Euphorb willd． Study the extracts of Humifusa Euphorbia willd in different time about the
antibacterial activity to P． Fluorescens． The results showed that the cold-water extracting was superior to the other two
and the method of the ethanol extracting is the worst． It is better to impregnate 48h with cold-water and ethanol，to fried
1h with hot-water，therefore，the extraction of the effective components of Humifusa Euphorbia willd should be adopted in
appropriate methods and appropriate extraction time．
Key words: Humifusa Euphorbia willd; different extraction methods; antibacterial activity; comparision
地锦草为大戟科植物地锦 ( Euphorbia humifusa
Willd) 或斑地锦 ( Euphorbia maculata L． ) 的干燥全
草［1］，生于田间路旁和庭院，全国各地均有分布。地
锦草属清热解毒类中药，具有清热解毒、活血止血之
功效，其成分主要有没食子酸、没食子甲脂、槲皮甙、
槲皮素、肌醇和鞣酸等。没食子酸为其主要抗菌有效
成分。
荧光假单胞菌 ( Pseudomonas fluorescens ) ，广泛
存在于水体和土壤中，是引起鱼类赤皮病的病原菌，
也是引起水产品腐败的腐生菌［2］。该菌主要侵染草
鱼和青鱼，能引起体表皮肤出血、发炎、糜烂和溃疡。
不同大小鱼均可感染发病，无明显的流行季节，对水
产养殖业的发展造成了极大的影响。
近年来中草药广泛应用于水产动物营养和提高
机体非特异性免疫功能等方面［3-4］。作为一种抗菌性
较强的中草药，地锦草也广泛应用于水产动物疾病的
防治，尤其是草鱼赤皮病的治疗，其应用价值不断显
现，愈来愈受到人们的广泛重视。
本试验采用水煮法、冷水浸渍法、乙醇浸渍法三
种方法提取的地锦草药液对荧光假单胞菌进行抑菌
比较研究，以探究地锦草有效抑菌成分提取的最佳方
法，从而为在水产动物疾病防治中科学、高效地利用
中草药提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
地锦草购自信阳美锐大药房，荧光假单胞菌( P．
fluorescens) 56-12-10，购买自中国科学院水生生物研
究所。
1． 2 方法
收稿日期: 2011-10-10
作者简介:汪成竹( 1969-) ，男，河南信阳人，硕士，副教授，主要从事水产动物养殖与病害防治的教学与研究工作．
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第 21 卷 第 4 期 信阳农业高等专科学校学报 Vol． 21 No． 4
2011 年 12 月 Journal of Xinyang Agricultural College Dec． 2011
DOI:10.16593/j.cnki.41-1433/s.2011.04.038
1． 2． 1 提取方法
1． 2． 1． 1 水煮提取法［5］ 称取地锦草 10． 0g，冲洗
一遍后，加入 200ml 蒸馏水，依次制备三份，并分别
标记为 AI、AII、AIII，然后均加热直至沸腾，再改用文
火分别保持 15min、30min、45min，倒出滤液，备用。
滤渣再分别加入 200ml 蒸馏水，待沸腾后，文火保持
15min、30min、45min 后过滤。分别将两次滤液混合
后过滤，然后水浴浓缩滤液至 10ml( 相当生药量 1g /
ml) ，离心后放入干净试管中，4℃冰箱保存备用。
1． 2． 1． 2 乙醇浸渍提取法［6］ 称取地锦草 10． 0g，
冲洗一遍后，加入 200mL 乙醇 ( 95% ) ，依次制备三
份，并分别标记为 BI、BII、BIII，然后在室温( 25℃ )
将 BI、BII、BIII分别浸渍 12h、24h、36h 后过滤，倒出
滤液，备用。滤渣再分别加入 200ml 乙醇 ( 95% ) ，
BI、BII、BIII 再依次浸渍 12h、24h、36h 后过滤。分别
将两次滤液混合后过滤，然后水浴浓缩至 10ml( 相当
生药量 1g /ml) ，离心后放入干净试管中，4℃冰箱保
存备用。
1． 2． 1． 3 冷水浸渍提取法 称取地锦草 10． 0g，加
入 200ml 蒸馏水，依次制备三份，并分别标记为 CI、
CII、CIII，然后在室温( 25℃ ) 分别浸渍 12h、24h、36h
后过滤，倒出滤液，备用。滤渣再分别加入 200ml 蒸
馏水依次浸渍 12h、24h、36h 后过滤。分别将两次滤
液混合后过滤，然后水浴浓缩滤液至 10ml，离心后放
入干净的试管中，4℃冰箱保存备用。
1． 2． 2 灭菌 将上述提取液用 0． 2μm 的滤器进行
过滤除菌。
1． 2． 3 菌悬液的制备 将荧光假单胞菌种接种于琼
脂斜面培养基上，放入生化培养箱中 28℃培养 24h。
选取菌落生长旺盛、菌毛明显的菌种接种于 6ml普通
肉汤培养基中，28℃培养 24h 后，将菌液稀释至浓度
为 1． 0 × 108cfu /ml，此即菌液在琼脂平板上的最佳涂
布浓度［7］。
1． 2． 4 体外抑菌试验 采用平板打孔扩散法［8］: 在
12cm培养皿中均匀摆放三个牛津杯，相互之间的间
距不小于 40mm，以防抑菌圈重叠影响观察。待固体
培养基降温至 50℃左右时倒平板( 50ml /个) ，凝固后
取出牛津杯，按最佳涂布浓度在固体培养基中均匀的
涂抹菌液，然后在培养基的孔中注入 100μl 药液，每
种提取药液做三个平行试验，同时设置有药无菌、有
菌无药、乙醇试验和空白作为对照，最后放入 28℃生
化培养箱培养 24h。
2 结果与分析
2． 1 地锦草不同提取方法和不同提取时间提取液的
抑菌效果
分别用水煮法、乙醇浸渍法、冷水浸渍法提取出
的药液对荧光假单胞菌进行药敏试验，测量其不同提
取时间提取液的抑菌圈直径，并对其抑菌效果作比较
研究。结果见表 1。
表 1 地锦草提取物的抑菌效果
提取液
药物浓度
( g·ml － 1)
抑菌圈直径( mm)
S1 S2 S3
平均直径
( mm)
灵敏度
AI
AII
AIII
BI
BII
BIII
CI
CII
CIII
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
1． 0
25． 9
28． 0
27． 5
21． 0
24． 0
23． 5
28． 5
31． 5
28． 5
26． 1
27． 5
27． 3
21． 5
25． 0
24． 2
29． 0
32． 5
28． 0
25． 9
27． 8
27． 0
19． 2
24． 1
21． 2
28． 5
31． 5
32． 0
20． 6 ± 1． 10
24． 4 ± 0． 55
23． 0 ± 1． 57
20． 6 ± 1． 10
24． 4 ± 0． 55
23． 0 ± 1． 57
28． 7 ± 0． 29
31． 8 ± 0． 97
29． 5 ± 2． 20
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
注:判断标准 高敏( + + + ) :直径 ＞ 20mm;中敏( + + ) : 15mm ＜直径 ＜
20mm;低敏( + ) : 10mm ＜直径 ＜ 15mm;耐药( -) :直径 ＜ 10mm
从表 1 的结果看，水煮法、乙醇浸渍法、冷水浸渍
法提取的地锦草提取液抑菌效果均显著，同种提取方
法中抑菌效果最好的分别为 AII、BII、CII。由此得
出:提取地锦草有效成分，水煮法以水煮 1h 为宜，乙
醇浸渍法、冷水浸渍法均以浸渍 48h为宜。
2． 2 乙醇对抑菌效果的影响
用乙醇对荧光假单胞菌进行抑菌试验，测量其抑
菌圈直径，结果见表 2。由表 2 可知，乙醇对荧光假
单胞菌无抑菌作用或很弱，因此地锦草的乙醇浸渍液
对细菌的抑制作用主要是药物所致。
表 2 乙醇的抑菌效果
药物
浓度
( % )
抑菌圈直径( mm)
S1 S2 S3
平均直径
( mm)
灵敏度
乙醇 100 0． 0 0． 0 0． 0 0． 0 －
2． 3 地锦草不同提取方法和不同提取时间二因素对
荧光假单胞菌抑菌效果影响的方差分析
依固定模型分析，将表 1 中的抑菌圈直径均减去
20mm，并整理于表 3 中。
表 3 地锦草提取液抑菌圈直径方差分析计算表
提取方法 提取液
提取时间
I II III
Ti ．
A
B
C
1
2
3
Tij
1
2
3
Tij
1
2
3
Tij
5． 9
6． 1
5． 9
17． 9
1． 0
1． 5
－ 0． 8
1． 7
8． 5
9． 0
8． 5
26
8． 0
7． 5
7． 8
23． 3
4． 0
5． 0
4． 1
13． 1
11． 5
12． 5
11． 5
35． 5
7． 5
7． 3
7． 0
21． 8
3． 5
4． 2
1． 2
8． 9
8． 5
8． 0
12． 0
28． 5
63． 0
23． 7
90． 0
T． j 45． 6 71． 9 59． 2 T = 176． 7
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第 21 卷 第 4 期 信阳农业高等专科学校学报 2011 年 12 月
根据表 3 中数据，计算并制定出地锦草提取液抑
菌直径方差分析表，见表 4。
表 4 地锦草提取液抑菌直径方差分析表
变异来源 df SS S2 F F0． 05 F0． 01
提取方法 2 247． 01 123． 51 124． 76＊＊ 3． 55 6． 01
提取时间 2 38． 45 19． 23 19． 42＊＊ 3． 55 6． 01
方法 ×时间 4 5． 06 1． 27 1． 28 2． 93 4． 58
误差 18 17． 79 0． 99
总变异 26 308． 31
注:＊＊代表极显著差异。
从表 4 可知，提取方法与提取时间差异均达到极
显著水平，但并不一定是不同提取方法之间、不同提
取时间之间也存在极显著差异，因此需对两者进行多
重比较( 用 SSR检验) 。又因为提取方法间平均数标
准误与提取时间间平均数标准误相同均为 0． 332，故
所对应的地锦草提取液抑菌圈直径比较 SSR 和 LSR
值如表 5 所示。据表 5 中数据，得出两因素的多重比
较结果分别见表 6、表 7。
表 5 地锦草提取液抑菌圈直径 SSR和 LSR值比较表
M 2 3
SSR0． 05 2． 79 3． 12
SSR0． 01 4． 07 4． 25
LSR0． 05 0． 99 1． 04
LSR0． 01 1． 35 1． 41
表 6 地锦草不同提取方法抑菌圈直径间差异显著表
方法 平均数( x)
差异显著性
x － 2． 63 x － 7． 00
C 10． 00 7． 37＊＊
A 7． 00 4． 37＊＊ 3． 00＊＊
B 2． 63
表 7 地锦草不同提取时间抑菌圈直径差异显著表
方法 平均数( x)
差异显著性
x － 5． 07 x － 6． 58
II 7． 99 2． 92＊＊
III 6． 58 1． 51＊＊ 1． 41＊＊
I 5． 07
由表 6、表 7 可知，地锦草有效成分不同提取方
法之间、不同提取时间之间抑菌效果均有极显著差
异，因此对地锦草有效成分的提取须采用适当的方法
和适当的提取时间。经本试验得出冷水浸渍法为提
取地锦草的最佳方法，48h为最适提取时间。
3 讨论
结果表明，提取方法和提取时间不同，地锦草提
取液抑菌效果差异达到极显著水平。其中冷水浸渍
法为提取地锦草的最佳方法，48h 为最适提取时间。
同时冷水浸渍法在渔业生产中有很强的实践意义。
治疗池塘鱼类疾病时，地锦草可直接将药物投放于池
塘中，操作简便，成本低廉，实用性较强。
煎煮法是我国最早使用的传统的提取方法。此
法简便易行，耗时相对较短，但煎出液中杂质较多。
同时提取温度较高，一些不耐热易挥发性成分在煎煮
过程中被破坏、挥发而损失［9］，使其提取液抑菌效果
减弱且只包含水溶性的成分。
乙醇浸渍法抑菌作用最弱，可能的原因有: ( 1 )
地锦草中的有机成分对荧光假单胞菌抑菌效果没有
其水溶性成分的强; ( 2) 乙醇浸渍液在水浴浓缩过程
中挥发掉一部分有效有机成分; ( 3) 乙醇能与提取液
中的部分有机物质发生化学反应。对于一些含有易
挥发物质的中草药，乙醇浸渍提取法可作为首选方
法。
本试验只是作定性分析，对于具体的有效抑菌成
分及其作用机理尚不十分清楚;对提取物有效抑菌成
分的分离提纯及其毒理学评价、最大剂量的确定等，
均有待于作进一步的研究和探索。
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( 编辑:严佩峰)
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汪成竹，等:地锦草不同提取方法对抑菌效果的影响研究