全 文 ：第 49 卷　第 2 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol.49　No.2
　2010 年 3 月 Journal of Xiamen Universi ty (Natural Science) M ar.2010　
滑桃树种子提取物对其内生菌蛋白表达的影响
吴　欣
(厦门大学生命科学学院 ,福建 厦门 361005)
　　
收稿日期:2009-09-09
基金项目:国家自然科学基金(30430020)
Email:careless78@gm ail.com
摘要:Streptomyces sp.WXC 菌株是从滑桃树(Trew ia nudi f lora L.)种子中分离到的一株内生菌 , 滑桃树种子提取物
对 Streptomyces sp.WXC 菌株的生长有促进作用.运用蛋白质组学方法 ,研究 S treptomyces sp.WXC 菌株在加入滑桃
树种子提取物和不加入滑桃树种子提取物的两种条件下 , 其蛋白表达的差异 ,结果发现 44 个差异蛋白.经数据库比对分
析 ,表明这些蛋白主要与菌株的运输 、氧化还原 、水解和生物合成有关.该结果为进一步研究植物与其内生菌的相互作用
奠定基础.
关键词:滑桃树种子提取物;S treptomyces sp.WXC 菌株;双向电泳;蛋白表达
中图分类号:Q 936 　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:0438-0479(2010)02-0246-05
　　物种间的互利共生在自然界中普遍存在 ,任何生
物体都不是孤立存在的.目前 ,植物与微生物的共生关
系研究得最多的是植物与固氮菌 F rankia 的相互关
系[ 1] ,对于植物与放线菌[ 2] ,尤其是与链霉菌的共生关
系研究得较少[ 3-4] .滑桃树(Trewia nudi f lora L.)是
大戟科滑桃树属植物 ,热带大乔木 ,该植物的主要化学
成分为具有抗肿瘤活性的美登木素类化合物[ 5-7] .
Streptomyces sp .WXC(S .sp.WXC)菌株是从滑桃
树种子中分离到的一株内生链霉菌.前期实验发现 ,
S .sp .WXC 菌株在常见的培养基上生长缓慢 ,菌株
生物量低 ,当培养基中加入滑桃树种子提取物后 ,菌株
生长良好 ,生物量明显增加 ,菌株发酵产物的抗菌活性
也随之提高.有报道表明利用蛋白表达图谱可以鉴定
出一些与植物-微生物相互作用有关的细菌蛋白[ 8-10] ,
蛋白质组学已经成为研究植物与微生物共生关系的一
种重要方法.为了探究滑桃树种子提取物对其内生菌
S .sp .WXC 菌株的影响机制 ,本文采用双向电泳技
术对 S .sp.WXC菌株在添加和不添加滑桃树种子提
取物两种条件下的蛋白表达差异进行研究.
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
滑桃树种子由云南西双版纳植物园提供.
尿素 、AmpholineTM pH3.5 ～ 10和碘乙酰胺购自
GE Healthcare (Piscataw ay ,NJ ,USA);β-巯基乙醇购
自 Fluka(Buchs , Swi tzerland);N , N′-甲叉双丙烯酰
胺 、甘氨酸 、十二烷基磺酸钠 、CBB G-250 、DT T 、Tris 、
EDTA 、TFA 和 T ris 饱和酚均为上海生工产品;
PM SF 、CHAPS 、过硫酸铵和 TEMED购自鹭隆生物
有限公司;Triton X-100 、丙烯酰胺 、丙酮 、氯化钠 、甲
醇 、乙醇 、磷酸 、甘油 、硫酸铵和乙酸均为分析纯.
1.2　方　法
1.2.1　S.sp.WXC 菌株的培养
将 S .sp .WXC菌株接种于 20 mL YMG液体培
养基中 ,在 28 ℃、180 r/min的条件下连续培养 48 h ,
分别取 5 mL 菌悬液于添加和不添加滑桃树种子提取
物的 100 mL 高氏一号培养基中 ,在 28 ℃、180 r/min
的摇床条件下继续培养.滑桃树种子提取物的提取方
法是将滑桃树种子去壳 、研碎 ,加入双蒸水在 45 ℃水
浴中提取 20 min ,在无菌条件下 ,使用 0.22 μm 的
PVDF 膜超滤除菌 ,取适量的滤液于已灭菌的培养基
中 ,滑桃树种子提取物在培养基里的终浓度为 1 mg/
mL .
1.2.2　S.sp.WXC 菌株在两种状态下生物量的检测
S .sp .WXC菌株同时在添加和不添加滑桃树种
子提取物的高氏培养基中培养 , 28 ℃, 180 r/min ,分
别培养 3 、4 、5和 6 d.根据不同培养时间离心收集菌
体 ,经过冷冻干燥后称取菌体干质量.以上每个样品分
别作 3个重复.
1.2.3　蛋白质提取和浓度测定
菌株培养 5 d 后 , 离心(4 ℃, 6 000 ×g)收集菌
体 ,并用 PBS 缓冲液清洗菌体 2 次.将菌体用液氮研
磨至粉末 ,每 100 mg 菌体 ,加入 0.5 mL 蛋白提取液
(500 mmol/ L T ris-HCL ,50 mmol/ L EDTA ,2%β-巯
基乙醇 ,1% Triton X-100 ,2 mmo l/L PMSF),冰浴抽
提 10 min.加入等体积 pH 7.8 Tris-饱和酚 ,室温下
震荡 10 min .4 ℃, 15 000 r/min离心 20 min ,取酚
层 ,以等体积提取液抽提 2次.有机相加入 5倍体积
0.1 mo l/ L 乙酸铵甲醇溶液 , -20 ℃沉淀 2 h以上.
4 ℃, 15 000 r/min离心 20 min ,弃上清液 ,沉淀用
-20 ℃预冷甲醇洗涤 1 次 ,再以丙酮(含2%β-巯基
乙醇 , -20 ℃预冷)洗涤 2 次 ,室温干燥 ,获得的蛋白
干粉于-70 ℃保存备用.采用 TIANGEN 的Bradford
蛋白质定量试剂盒测定蛋白含量.
1.2.4　蛋白质双向电泳分析 、染色
双向电泳采用 18 cm , pH 3 ～ 10 的非线性胶条 ,
实验步骤参照安玛西亚公司的双向电泳操作手册.等
电聚焦程序为:300 V 电泳 1 h ,电压逐渐上升 ,最高电
压达 5 000 V ,累计电压为 118 000 V ,每根胶条的电
流不超过 5 μA .胶条平衡后置于 5%～ 10%不连续的
SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶上方 ,110 V 电泳至分离
胶处 ,200 V 电泳至溴酚蓝距底部 0.5 cm 处停止电
泳.对凝胶采用考马斯亮蓝染色[ 11] .
1.2.5　肽质指纹图谱鉴定
参照文献[ 12] ,从凝胶上挖取差异点 ,用 50%乙
腈的碳酸氢氨溶液脱色 , 10 mmol/L DT T 的碳酸氢氨
溶液 56 ℃还原 45 min , 55 mmo l/L 碘乙酰氨碳酸氢
氨溶液室温避光烷基化 30 min , 100 %乙腈脱水并真
空离心干燥 30 min ,20 ng/μL 胰酶 37 ℃消化 ,分别用
20 mmo l/L 碳酸氢氨溶液 、含 2 .5%TFA的 50%乙腈
萃取 ,离心收取 ,合并所有上清液 ,真空离心干燥 ,用
0.1%TFA 溶液溶解 ,与基质 HCCA 混合后点样 ,送
入 MA LDI-TOF M S 仪器检测[ 13] , 获得肽质指纹图
谱.
用 ProFound 软件(The Rockefeller Universi ty ,
New York)对肽质指纹图谱进行分析.针对一些未搜
索到功能的假想蛋白 ,用 pfam 22 .0(ht tp://pfam.
sanger.ac.uk/)进行蛋白保守区域(conserved-do-
main)的功能分析 ,推断其功能.
2　结果与分析
2.1　滑桃树种子提取物对 S.sp.WXC菌株
生物量的影响
实验结果表明 ,在添加了滑桃树种子提取物的条
件下 ,S .sp .WXC 菌株的生物量几乎是不添加提取
物时菌体生物量的 3倍(图 1),说明滑桃树种子提取
物对 S .sp.WXC 菌株的生长有促进作用.
　图 1　滑桃树种子提取物对 S.sp.WXC 菌株生物量的影响
　Fig.1　The biomass of S .sp.WXC influenced by the seed
ex trac t o f T.nudi f lora
2.2　S.sp.WXC菌株在两种状态下的双向电
泳图谱比对以及差异蛋白的 MALDI-
TOF质谱分析
通过蛋白质双向电泳技术 ,完成全蛋白分离 ,得到
两种培养条件下 S .sp.WXC 菌株的蛋白质凝胶电泳
图(图 2).每次实验重复 3次 ,不同批次实验之间凝胶
蛋白点匹配率达 90%以上.通过 ImageM aster 2D
Platinum 5.0软件分析 ,每张图谱上有大于 800个蛋
白点 ,大部分蛋白主要分布在胶条的酸性端(pH 4 ～
7).经分析 ,共鉴定出 44个蛋白 ,其中滑桃树种子提取
物可诱导 3个蛋白表达 , 33个蛋白表达上调 ,同时有 8
个蛋白的表达下调.结果表明 ,差异蛋白主要与菌株的
转运 、氧化还原 、水解以及生物合成有关 ,尤其是与菌
株的碳代谢有关 ,按功能分类 ,大概可分为 4类:转运
和连接蛋白 、转移酶 、氧化还原酶和蛋白酶(表 1).
3　讨　论
从双向电泳的结果看 , S .sp .WXC 菌株的部分
上调蛋白与其初级代谢有关.水解酶 、酰基转移酶和酯
酶 A(表 1)在添加了滑桃树种子提取物后表达量上
调 ,说明植物成分对其有诱导作用.对原核生物来说 ,
在将烯烃作为碳源利用时 ,水解酶或酰基转移酶是必
需的[ 14] .已有报道表明某些链霉菌可以降解复杂的油
·247·第 2 期　　　　　　　　　　　　　吴　欣:滑桃树种子提取物对其内生菌蛋白表达的影响
　　图 2　滑桃树种子提取物对 S.sp.WXC 菌株总蛋白表达的影响
　　　　　A.添加滑桃树种子提取物菌株蛋白的双向电泳图谱;B.未添加滑桃树种子提取物菌株蛋白的双向电泳图谱
　　Fig.2　The influence o f T .nudi f lora seed ex tract on the total pro tein f rom S .sp.WXC
表 1　种子提取物诱导的蛋白
Tab.1　P ro teins induced by seed ex tract
功能分类　 蛋白质名称a 分子量/ 　
ku　　 等电点　　　科学期望值　　(E-value)b 　　序列覆盖　　率/ %　　 NCBI登　　录号　　
转运和连接蛋白 ABC 型硝酸盐/磺酸盐/重碳酸盐转运系统 , 透膜酶成分 11.32 5.0 0.71 21 ZP 00111854
缩氨酸 ABC 转运蛋白 , A TP连接蛋白 37.01 9.5 0.63 14 NP 699597
转移酶 甲基转移酶 23.55 4.9 0.084 38 NP 233218
磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 14.54 9.4 0.81 32 NP 950692
水解酶或酰基转移酶 26.02 6.3 0.39 20 ZP 00107544
2-C-甲基-D-赤藓糖醇 4-
磷酸盐胞苷转移酶
26.00 6.3 0.73 24 NP 230179
脂肪酸转移酶 38.19 5.8 0.26 17 NP 973245
氧化还原 细胞色素氧化酶亚基 II相关
蛋白
21.31 6.4 0.34 14 YP 107880
NADH 过氧化物酶 46.97 6.8 0.099 18 NP 785057
蛋白酶 酯酶 A 41.48 5.6 0.74 10 CAA78842
锌金属蛋白酶 Pap6 75.62 5.0 0.9 8 AAM34261
水解酶 , HAD 总科 , IIIA 亚科 22.35 5.0 0.97 35 YP 010275
tRNA羟化酶 24.37 5.8 0.62 24 YP 095579
N UDIX 水解酶 17.34 5.2 1.4 37 YP 879643
依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 26.11 5.9 0.090 20 AAR92062
丝氨酸/苏氨酸激酶 45.09 5.5 0.5 16 NP 828685
通过蛋白保守区域分析的
假想蛋白c
DNA/ RNA 连接蛋白
膜转运蛋白
18.25
33.39
4.4
9.4
0.82
0.15
24
15
YP 001223719
YP 001495921
　　a.蛋白质名称通过 ProFound 软件(The Rockefeller University , New Yo rk)分析获得;
　　b.蛋白序列的最大科学期望值通过 P roFound 软件(The Rockefeller Univ ersity , New Yo rk)分析获得;
　　c.针对假想蛋白通过 pfam 22.0(http://pfam.sange r.ac.uk/)进行蛋白保守区域的功能分析 , 推测其蛋白功能.
·248· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年
脂聚合体 ,如角质和软木脂[ 15-16] ,其中 , S treptomyces
scabiei 用来降解软木脂的酯酶与植物的定居[ 17] 和发
病机理[ 15]有关.因此 ,水解酶和酯酶可能与从脂肪和
油脂获取碳源的碳代谢途径有关.滑桃树种子提取物
还能诱导菌株 tRNA 羟化酶(tRNA-(ms2 io6A)-
hydro xy lase)(表 1)的表达上调 , 该蛋白参与从
ms2 i6A(2-methy lthio-N-6-isopenteny l adeno sine)向
ms2 io 6A(2-methyl thio-cis-ribo zeatin)的转化.有报道
表明缺失了该蛋白的突变体不能利用柠檬酸循环中的
某些中间产物作为碳源[ 18] .以上这些蛋白表达量的上
调说明了滑桃树种子提取物促进了 S .sp.WXC 菌株
的碳代谢 ,这正好可为滑桃树的内生链霉菌提供额外
的竞争优势.另外 ,在添加了滑桃树种子提取物的条件
下 ,与 ABC 转运系统有关的两个蛋白———透膜酶成分
和 ATP 连接蛋白(表 1)的表达量也上调.这说明了利
用 ATP 的水解作为能量来源来促进迁移的 ABC 系
统将获得更多能量 ,滑桃树种子提取物可促进 S .sp.
WXC菌株营养的获得和信号的传输[ 19] .
另一部分表达上调的蛋白与 S .sp .WXC菌株的
次级代谢有关.丝氨酸/苏氨酸激酶(表 1)对原核生物
的次级代谢途径具有全局性的调节作用 ,这种调节作
用突出地表现在对抗生素产生的调节[ 20] .如天蓝色链
霉菌中的丝氨酸/苏氨酸激酶 afsK 、afsR基因中断实
验结果表明 , afsK 、afsR的中断使放线菌素的产量下
降[ 21] .磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(表 1)可将辅酶 A
上的 4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移到载体蛋白保守的丝
氨酸残基侧链羟基上 ,使载体蛋白由无活性的脱辅基
形式转变为活性全蛋白形式.活性载体蛋白负责酰基
的转移 ,在脂肪酸 、聚酮和非核糖体多肽等物质的合成
过程中发挥重要的作用[ 22] .2-C-甲基-D-赤藓糖醇 4-
磷酸盐胞苷转移酶(表 1),参与催化从磷酸胆碱转移
酶(CTP)和 2-C-甲基-D-赤藓糖醇 4-磷酸盐(MEP)到
4′-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇的形成 ,该过程
与类异戊二烯的生物合成途径有关[ 23] .这些与菌株次
生代谢有关的蛋白质和酶 ,在添加滑桃树种子提取物
后 ,表达量都上调 ,说明了植物种子提取物可促进 S .
sp .WXC菌株的次级代谢 ,使其全面上调.综上所述 ,
滑桃树种子提取物对 S .sp.WXC 菌株生长和代谢方
面的影响 ,很可能是内生菌对植物宿主长期适应的结
果.
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The Influence of Trewia nudi f lora Seed Extract
on the Protein Expression of Endophyte
WU Xin
(School of L ife Sciences , Xiamen University , Xiamen 361005 , China)
Abstract:The chemical interactions between endophytes and plant ho sts have been an interesting topic since the co ining o f the con-
cept of symbiosis and co-evolution.S treptomyces sp.WXC w as an endophy tic strain isolated fr om the seed of Trew ia nudi f lora L..
During screening fo r optimized fermentation media , we no ticed that when the medium w as supplemented with the ex tract of T.nudi -
f lora seeds , S.sp.WXC grew obviously better and developed more mycelia by ca.3-fold.To under stand the mechanism o f this
gr ow th-stimulating effect , the pr oteomes of S .sp.WXC cultiva ted under two conditions , with o r without the supplement of seed ex-
tract , w ere analy zed by tw o-dimensional gel elect ropho resis , respectively.The compa rison of the different pro teomes resulted in identi-
fica tion of 44 pro teins w ith mass spectrometry.The upregulated pro teins w ere identified to be involv ed in transpo rt , redox , bio synthe-
sis and hydrolyzation , but most no tably these re lated to catabolic metabolisms.The cur rent study suggested that the catabo lic metabo-
lism and secondar y metabolism of S .sp.WXC w ere increased by the addition o f T.nudi f lora seed ex tract.Hence , the influence o f
gr ow th and pro tein expression o f ho st components on the symbio tic streptomyces w as though t to be an impo r tant adaptation allow ing
the endophy te to affect its host.The result could lay the foundation o f further r esear ching interaction betw een host and endophy te.
Key words:T .nudi f lora seed ex tract;S treptomyces.sp.WXC;2D-electropho resis;pro tein expression
·250· 厦门大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年