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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
在生物间的各种相互作用中，共生是特别有趣
的，因为它可能通过化学相互作用尤其是化学防御
来推动进化。涉及种间的基于相互作用的共生或互
利共生在自然界中普遍存在，因为生物体不是孤立
存在的也不是无菌的。共生通过水平基因转移来影
响基因库，并且对次生代谢的进化施加影响 ；更重
要的是，共生微生物产生次生代谢产物可能是共生
微生物影响其宿主的一种重要适应机制［1］。然而，
植物与微生物的共生关系研究得最多的是植物与固
氮菌 Frankia 的相互关系［2］，对于植物与放线菌［3］，
尤其是与链霉菌的共生关系研究得较少［4，5］。滑桃
树（Trewia nudiflora L.）是大戟科滑桃树属植物，热
收稿日期 ：2013-03-19
作者简介 ：吴欣，女，博士，工程师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：careless78@gmail.com
滑桃树种子提取物对其内生菌活性化合物的影响
吴欣
（国家海洋局第三海洋研究所，厦门 361005）
摘 要 ： Streptomyces sp. WXC 菌株是从滑桃树（Trewia nudiflora）种子中分离到的一株内生菌，滑桃树种子提取物对
Streptomyces sp. WXC 菌株的生长和活性化合物的表达有促进作用。运用 HPLC、RT-PCR 和 Real-time PCR 技术，研究 Streptomyces
sp. WXC 菌株在加入滑桃树种子提取物和不加入滑桃树种子提取物的两种条件下，其活性化合物富伦菌素 B 产量及其生物合成基
因表达量的差异。结果显示，滑桃树种子提取物诱导了活性化合物富伦菌素 B 生物合成基因的表达，从而提高了富伦菌素 B 的产量。
首次揭示了植物与其内生放线菌之间的化学作用。
关键词 ： 滑桃树种子提取物 Streptomyces sp. WXC 菌株 富伦菌素 B 生物合成基因
Influence of Trewia nudiflora Seed Extract on the Antifungal
Compound of Endophyte
Wu Xin
（Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration，Xiamen 361005）
Abstract:  The chemical interactions between endophytes and plant hosts have been an interesting topic since the coining of the concept
of symbiosis and co-evolution. Streptomyces sp. WXC was an endophytic strain isolated from the seed of Trewia nudiflora. Culture medium
optimization revealed that supplemented with the aqueous extract of T. nudiflora seeds, S. sp. WXC grew faster, and the production of frenolicin
B was increased by ca. 3-fold as well. Real-time PCR analysis revealed that the expression levels of frenolicin B biosynthetic genes were induced
by the seed extract, which correlated to the increased production of frenolicin B indicated by HPLC analysis. These results indicated that host’s
chemical components may induce the endophytic S. sp. WXC to increase the production of antifungal compound. This work shows, for the first
time, that intimate chemical interaction exists between endophytic actinomycete and its host.
Key words:  T. nudiflora seed extract Streptomyces sp. WXC Frenolicin B Biosynthetic genes
带大乔木，该植物的主要化学成分为具有抗肿瘤活
性的美登木素类化合物［6-8］。Streptomyces sp. WXC
（S. sp. WXC）菌株是从滑桃树种子中分离到的一株
内生链霉菌。前期试验发现，S. sp. WXC 菌株在常
见的培养基上生长缓慢，菌株生物量低，当培养基
中加入滑桃树种子提取物后，菌株生长良好，生物
量明显增加，菌株发酵产物的抗菌活性也随之提高。
因此，我们推测很可能是植物种子提取物诱导 S. sp.
WXC 菌株提高了活性化合物的产量。富伦菌素 B
（frenolicin B）是从 S. sp. WXC 菌株中分离到的主要
活性化合物。为了探究滑桃树种子提取物对其内生
菌 S. sp. WXC 菌株活性化合物产量的影响，本研究
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期94
采用 HPLC、RT-PCR 和 Real-time PCR 技术对 S. sp.
WXC 菌株在加入滑桃树种子提取物和不加滑桃树种
子提取物两种条件下活性化合物富伦菌素 B 的产量
及其生物合成基因表达差异进行研究，旨在为揭示
植物与其内生放线菌之间的化学作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
滑桃树（T. nudiflora L.）种子由云南西双版纳
植物园提供。
分析纯级乙酸乙酯、色谱级甲醇、Trizol 试剂
（Invitrogen）、DEPC（焦磷酸二乙酯）、氯仿、异丙
醇、DEPC 处理过的 75% 乙醇、RNase 处理过的双
蒸水、柠檬酸钠、氯化钠、DNase Ⅰ、DNase Ⅰ缓
冲液均购于英杰生命科技有限公司，Transcript RNA
CleanUp Kit（TaKaRa）、Premix Ex Taq（TaKaRa）均
购于宝生物工程有限公司，ProtoScript® First Strand
cDNA Synthesis kit（New England Biolabs）购于纽英
伦生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 Streptomyces sp. WXC 菌 株 的 培 养 将 S. sp.
WXC 菌 株 接 种 于 20 mL YMG 液 体 培 养 基 中， 在
28℃、180 r/min 的条件下连续培养 48 h，分别取 5
mL 菌悬液于添加了滑桃树种子提取物和不添加滑
桃树种子提取物的 100 mL 高氏一号培养基中，在
28℃、180 r/min 的摇床条件下，分别培养 3、4、5
和 6 d，每天取一次样品。滑桃树种子提取物的提
取方法是将滑桃树种子去壳、研碎，加入双蒸水在
45℃水浴中提取 20 min，在无菌条件下，使用 0.22
μm 的 PVDF 膜超滤除菌，取适量的滤液于已灭菌的
培养基中，滑桃树种子提取物在培养基里的终浓度
为 1 mg/mL。
1.2.2 Streptomyces sp. WXC 菌株在两种状态下活性
化合物产量富伦菌素 B 的检测 在 4℃、4 000 r/min
的离心条件下收集菌体，上清液用等体积乙酸乙酯
萃取 2 遍，浓缩得到胞外的乙酸乙酯相 ；菌体经过
冷冻抽干后，称菌体干重，用乙酸乙酯提取得到胞
内的乙酸乙酯相。以上每个样品分别作 3 个重复。
对胞内和胞外的乙酸乙酯相，分别用 HPLC 技术来
检测其中活性成分富伦菌素 B 的含量。以纯品富伦
菌素 B 作为标准样，分别取 3、6、12、24 和 48 μg
上样，制作富伦菌素 B 的标准曲线 y= 16.444x（R2=
0.98）。将 3、4、5 和 6 d 所制的乙酸乙酯相分别经
过 HPLC（Agilent 1100）检测，洗脱剂为甲醇∶水
（60∶40），洗脱条件为 1 mL/min、27℃。根据标准
曲线，计算出各样品中富伦菌素 B 的含量，富伦菌
素 B 的含量与 S. sp. WXC 菌体干重的比值，即为富
伦菌素 B 单位干重的产量。
1.2.3 Streptomyces sp. WXC 菌株的 RNA 提取和纯化
S. sp. WXC菌株在添加了滑桃树种子提取物和不添
加滑桃树种子提取物的条件下培养 2、3、4 和 5 d（具
体方法参照 1.2.1）。取适量菌液，4 000 r/min 离心，
取菌体，加入液氮研磨 ；取不超过 1.5 mL 离心管
体积 10％的研磨的菌丝体粉末放入一个装有 1 mL
Trizol 的离心管，混匀后，室温放置 10 min ；加 200
μL 氯 仿， 用 手 用 力 晃 动 30 s， 静 置 5 min，4 ℃，
12 000 r/min，10 min ；用 200 μL 移液器小心移取上
清到另外一个新的 1.5 mL 离心管中，加入 1/2 体积
RNA 沉淀试剂（1.2 mol/L NaCl+0.8 mol/L Citric Acid
Sodium Salt），混匀，再加入 1/2 体积的 -20℃预冷的
异丙醇，颠倒混匀，室温沉淀 10 min，4℃，12 000
r/min，10 min ；去上清，收集 RNA 沉淀，加 1 mL
预冷的 70% ethanol，颠倒混匀洗涤沉淀 1 次，4℃，
8 000 r/min，5 min，弃上清，收集 RNA 沉淀，室温
干燥 5 min ；加 100 μL RNase-free water 溶解，加入
DNase Ⅰ（5 U/μL）2 μL 和 10 μL 10×buffer，37 ℃
酶解 DNA，用 Transcript RNA CleanUp Kit（TaKaRa）
对 RNA 进行纯化，所得 RNA 溶液的吸光度 OD260/
OD280>1.95。
1.2.4 Streptomyces sp. WXC 菌 株 的 RT-PCR 菌 体
总 RNA 的 反 转 录 PCR 采 用 ProtoScript® First Strand
cDNA Synthesis kit（New England Biolabs）。
1.2.5 Streptomyces sp. WXC 菌株的 Real-time PCR
将配好的 PCR 体系（20 μL/tube）放入 Real-time PCR
仪（Rotogene 3000） 中， 依 照 SYBR Premix Ex Taq
（TaKaRa）试剂盒说明进行扩增。模板包括 ：2 μL
2、3、4 和 5 d 添加了滑桃树种子提取物和不添加
滑桃树种子提取物的两种条件下的 cDNA（100-150
ng）以及没有反转录的 RNA（对照）。引物包括 ：
目标基因 fren-ORF1 的引物（S ：5-TCGACAGGGA-
2013年第10期 95吴欣 ：滑桃树种子提取物对其内生菌活性化合物的影响
ACGCAACGGC-3 ；A ：5-GAGCCCGGTCATGTGGT-
ACG-3）；目标基因 fren-ORF3 的引物（S ：5-ACG-
CCCTTCGTGGACCTCGG-3 ；A ：5-CGGGGTGGTG-
TTGACCTCGT-3）；内参基因 recA 的引物（S ：5-T-
CTACGGGCAGGGCATCAGC-3 ；A ：5-TCGTTGGC-
GAGGTCGGGGTT-3）。每个样品 3 个重复，并以不
加模板的体系作为阴性对照。扩增程序为 ：95℃
45 s ；95℃ 5 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，45 个循环。
对 目 标 基 因（fren-ORF1、fren-ORF3） 和 内 参 基 因
（recA）分别进行不同浓度梯度的 PCR，从而测定
这两对引物的扩增效率 E（E=10［-1/slope］）［9］。根据
目标基因和内参基因的扩增效率 E 和扩增循环数
（CP），利用双标准曲线法得出目标基因的相对表达
比 率（relative expression ratio，R）， 即 添 加 了 滑 桃
树种子提取物和不添加滑桃树种子提取物的两种条
件下，fren-ORF1、fren-ORF3 表达量的差异，Ratio=
（Etarget）
△ CPtarget（control-sample）/（Eref）
△ CPref（control-sample）［10］。
2 结果
2.1 滑桃树种子提取物对菌株活性化合物富伦菌
素B产量的影响
试验结果（图 1）表明，与不添加滑桃树种子
提取物的培养条件相比，S. sp. WXC 菌株在添加滑
桃树种子提取物的条件下，菌体干重发生了较大的
变化，从 3-6 d 的数据来看，添加滑桃树种子提取
物的菌体干重是不添加滑桃树种子提取物的 2-3 倍，
说明了滑桃树种子提取物对 S. sp. WXC 菌株的生长
有促进作用。
从 3-6 d HPLC 的检测结果（图 2）表明，添加
了滑桃树种子提取物的富伦菌素 B 的产量逐渐增加。
在第 6 天，添加了滑桃树种子提取物的富伦菌素 B
的产量达到不添加滑桃树种子提取物的 3 倍左右，
说明植物的成分诱导内生菌提高了活性化合物富伦
菌素 B 的产量。
200
160
120
80
40
0
3 4 5 6ษޫཙᮠG
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图 1 滑桃树种子提取物对 S. sp. WXC 菌体干重的影响
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␫࣐━ṳṁ⿽ᆀᨀਆ⢙ᵚ␫࣐━ṳṁ⿽ᆀᨀਆ⢙
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
fr
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B
μg
/m
L

0.2
0.1
0
3 4 5 6
图 2 滑桃树种子提取物对富伦菌素 B 产量的影响
2.2 滑桃树种子提取物对菌株活性化合物富伦菌
素B的生物合成基因表达的影响
利 用 目 标 基 因（fren-ORF1、fren-ORF3） 和 内
参基因（recA）的 cDNA 浓度梯度的 log 值对△ CT
值作图，△ CT 表示目标基因与内参基因 CT 值之
差。 所 得 斜 率（slope）（R2 ≥ 0.97）：fren-ORF1 为
-3.233 2，fren-ORF3 为 -2.849 4，recA 为 -2.789。 根
据 E = 10［-1/slope］，得到的扩增效率（E）：fren-ORF1
为 2.04，fren-ORF3 为 2.24，recA 为 2.28，说明 fren-
ORF1、fren-ORF3 和 recA 一致具备较高的扩增率。
Real-time PCR 的结果表明，在 2、3、4 和 5 d，滑
桃树种子提取物诱导了 fren-ORF1 和 fren-ORF3 的表
达（图 3）。在 S. sp. WXC 菌株的指数生长期，fren-
ORF1 和 fren-ORF3 的表达量呈现明显的增长趋势，
至第 3 天，添加滑桃树种子提取物的菌体的 fren-
ORF1 和 fren-ORF3 表达量是没有添加滑桃树种子提
取物的 2.8-2.9 倍。但指数期后，至第 5 天，添加滑
桃树种子提取物的菌体的 fren-ORF1 和 fren-ORF3 表
达量仅是没有添加滑桃树种子提取物的 1 倍左右。
3 讨论
富伦菌素 B 的主体可能是由紧连 7 个单酰辅酶
A 延伸物的异质二聚体 KSα-KSβ 上的乙酰转化而来
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期96
ORF1
500 bp
ORF2 ORF3 ORFX ORF5 ORF4
55261
图 4 富伦菌素 B 合成相关基因簇
产物产生的共生化学防御可以保护宿主免受病菌、
寄生虫和其他有害物的攻击，而这种化学物质是可
以被诱导的［18］。滑桃树种子提取物对 S. sp. WXC 菌
株生长和代谢方面的影响，很可能是内生菌对植物
宿主长期适应的结果。S. sp. WXC 菌株在与植物宿
主的长期协同进化过程中，通过产生具有抑制真菌
活性的物质，形成了共生化学防御，并且合成这种
活性物质的基因表达可以被植物宿主所诱导。
4 结论
研究 Streptomyces sp. WXC 菌株在加入滑桃树种
子提取物和不加入滑桃树种子提取物的两种条件下，
其活性化合物富伦菌素 B 产量及其生物合成基因表
达量的差异，结果表明，滑桃树种子提取物诱导了
活性化合物富伦菌素 B 生物合成基因的表达，提高
了富伦菌素 B 的产量。
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ษޫཙᮠd
fren-ORF1
fren-ORF3
R
N
A
㺘䗮
⦷
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2 3 4 5
图 3 滑桃树种子提取物对 fren-ORF1 和 fren-ORF3
表达的影响
的［11，12］。fren-ORF 基因可能是富伦菌素 B 生物合
成的编码基因（图 4），fren-ORF 基因中的任意基因，
如 fren-ORF1（可编码 KS，酮基合酶）和 fren-ORF3（可
编码 ACP，酰基载体蛋白）［11］，其表达情况就反映
了富伦菌素 B 整个生物合成基因簇的表达情况，即
富伦菌素 B 的表达情况。
物种间的互利共生在自然界中普遍存在，生物
的化学防御机制是保持生物物种分布平衡的基本因
素，也是促进生物协同进化的重要因素。内生菌次
生代谢产物对宿主天敌的防御行为从微生物到高等
植物、动物都有发现［13-15］。然而，对于植物与其内
生菌的化学防御（共生化学防御）研究较少［16］。本
研究发现，滑桃树种子提取物能诱导 S. sp. WXC 菌
株提高活性化合物富伦菌素 B 的产量，特别是在菌
株的指数生长期。而滑桃树种子提取物对 fren-ORF
基因表达的诱导作用发生得更早一些，因为化合物
的生成有一个积累的过程，滑桃树种子提取物很可
能通过诱导活性化合物富伦菌素 B 生物合成基因的
表达，从而提高了富伦菌素 B 的产量。植物种子提
取物能促进内生菌 S. sp. WXC 的次级代谢［17］，使其
全面上调，其中也包括了活性代谢产物富伦菌素 B。
已有报道表明利用内生菌具有生物活性的次生代谢
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（责任编辑 马鑫）