全 文 ： 药物研究
白蔹配伍乌头对大鼠肝脏 CYP450的调节作用*
石苏英 1 ,金科涛 1 ,王宇光 2 ,高　月 2
(1.浙江省诸暨市人民医院药剂科 , 311800;2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室 ,北京　
100850)
[摘　要 ] 　目的　研究乌头 、白蔹配伍对主要药物代谢酶 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1 /2在酶活性 、mRNA水平和蛋
白质水平的影响。方法　采用高效液相色谱法测定 CYP1A2、CYP2E1活性;采用紫外-可见分光光度法测定 CYP3A1 /2
活性;分别采用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)和 W estern B lot方法评价药物对 CYP1A2、 CYP2E1、CYP3A1、 CYP3A2
mRNA及蛋白水平的影响。结果　乌头 、白蔹配伍后 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1 /2的酶活性均有下降;W estern B lo t检测
显示 CYP1A2、CYP3A1的蛋白质表达水平上升;CYP2E1、CYP3A2的蛋白质表达水平下降。 RT-PCR检测显示 CYP1A2、
CYP2E1、CYP3A1、CYP3A2的 mRNA水平均上升。结论　乌头 、白蔹配伍后抑制 CYP1A2、CYP2E1、 CYP3A1 /2的酶活
性 , CYP2E1酶活性下降可能主要通过影响基因转录进而影响其蛋白水平来实现;CYP1A2、CYP3A1 /2酶活性下降则与
基因和蛋白水平不相关 。
[关键词 ] 　白蔹;乌头;细胞色素 P450;酶活性;蛋白质免疫印迹;逆转录-聚合酶链式反应
[中图分类号 ] 　R282. 71;R285. 5　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1004-0781(2007)09-0975-05
Inhib itory E ffect of Aconitum Coadm inistration w ith Ampelops is on Cytochrom e
P450 in Rat L ivers
SH I Su-y ing1 , JIN Ke-tao1 ,WANG Yu-guang2 , GAO Yue2(1. Departmen t of Pharmacy, the PeoplesHospital
of Zhuji City , 311800, China;2. Institute of R adiation Medicine, Academy of M ilitary Medical Science,
Beijing 100850, China)
ABSTRACT　Objec tive　To study the effe ct o fAconitum coadm inistration w ith am pe lopsis on the enzym e activ ity, pro tein
expre ssion and mRNA leve l o f cy toch rom e P
450
isoenzym es in rat live r. 　M ethods　CYP1A2 and CYP2E1 activ ities w ere
quantitated by high pe rfo rm ance liqu id chrom a tog raphic (HPLC) assay; CYP3A1 /2 ac tivity w as quan tita ted by UV
chrom atography. The pro tein expre ssions of CYP1A2, CYP2E1, CYP3A1, and CYP3A2 we re de tected by W estern b lo .t The
mRNA levels o f CYP1A2, CYP2E1, CYP3A1, and CYP3A2 w ere detec ted by sem i-quan tita tive reve rse transc riptase-po lyme rase
chain reac tion(RT-PCR). 　R esu lts　Aconitum coadm inistration w ith ampelopsis obviously inh ib ited the activ itie s of CYP1A2,
CYP2E1 and CYP3A1 /2;W estern B lot show ed a decreased pro tein expression o f CYP2E1, and CYP3A2 , and an inc reased
prote in exp ression o f CYP1A2 and CYP3A1. RT-PCR show ed an increased mRNA leve l of CYP1A2, CYP2E1, CYP3A1, and
CYP3A2 as com pa red w ith the con tro l g roup. 　Conclusion　 Aconitum coadm inistra tion w ith am pe lopsis ha s an inhib itory e ffec t
on the enzym es ac tivity o f CYP1A2, CYP2E1, and CYP3A1 /2. The enzym es ac tivity inhibito ry effec t o f CYP2E1m ay be re lated
to the decrease o f its pro tein expression, but no t CYP1A2, CYP3A1, and CYP3A2.
KEY WORDS　Acon itum coadm in istra tion ;Am pe lo sis;Cy toch rom e P450;Enzym es ac tivity;W este rn blot;RT-PCR
　　乌头 、白蔹作为配伍禁忌是古人在临床用药实践
中发现的现象 ,但长期以来缺乏科学依据的佐证 ,产生
这种现象的机制尚不十分清楚 。这种配伍禁忌是否有
[收稿日期 ] 　2007-04-20　　　[修回日期 ] 　2007-06-02
[基金项目 ] 　*国家自然科学基金资助项目(基金编号:
30070936)
[作者简介 ] 　石苏英 (1960 - ), 女 , 浙江诸暨人 , 副主任
药师 , 学士 , 从事中药药 理学研究工作。 电话:0575 -
87173165, E-m ail: jinketao2001@ yahoo. com. cn。
[通讯作者 ] 　高　月 (1963 -), 女 ,江西宜春人 ,研究员 ,
博士生导师 , 长期从事中药药理研究的教学 、科研工作 。电话:
010 - 66931312, E-m ail:gaoyue@nic. bm .i ac. cn。
其内在机制或物质基础呢  在体内参与药物代谢的酶
主要为肝细胞色素 P450氧化酶 (以下简称 P450酶 ),是
一组由许多同工酶组成的超家族 ,对许多内源性 、外源
性化合物在体内 Ⅰ相生物转化有重要作用 ,在药理学 、
毒理学研究中有重要意义 [ 1] 。许多药物通过对 P450酶
的调控作用 (诱导或抑制)来影响其活性 ,因而两种以
上药物合用时 ,就可能导致某种药物的药效或毒性增
强或降低 ,即药物相互作用 。实验室在前期工作中 ,已
经完成了乌头碱 (乌头主要毒性成分 )的肝细胞色素
P450代谢亚型的研究 [ 2] ,笔者选择乌头 、白蔹配伍为锲
入点 ,研究乌头与白蔹配伍应用对主要的药物代谢相
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关的 CYP同工酶的酶活性 、mRNA及蛋白质表达的影
响 ,为进一步探讨基于药物代谢酶的中药相互作用的
分子机制及可能产生的药物相互作用提供实验依据 。
1　材料与方法　
1. 1　实验动物与分组 　W istar大鼠 , 雄性 , 体重
(200±20) g,由军事医学科学院实验动物中心提供。
动物随机分为空白组 、乌头组 (0. 25 g kg- 1 d -1)、
白蔹组 (0. 75 g kg- 1 d-1 )、乌头加白蔹组
(1. 0 g kg -1 d-1),每组 8只 。
1. 2　药物制备和给药　乌头 、白蔹购自北京同仁堂药
厂 ,经军事医学科学院放射与辐射医学研究所马百平
教授 鉴 定 , 乌 头 为 毛 莨 科 植 物 乌 头 Acon itum
carm ichaeli Debx的干燥根;白蔹为葡萄科植物白蔹
Ampelopsis japonica (Thunb. )Makino的干燥块根 。乌
头按《中华人民共和国药典》2005年版一部规定的临
床剂量换算成大鼠剂量称重后加入 10倍量去离子水 ,
浸泡 60 m in后于烧瓶中加热回流 3次 ,每次 1 h,合并
提取液 ,滤纸过滤去除杂质 ,离心取上清液并旋转蒸发
浓缩至药液浓度为 0. 02 g mL -1;白蔹提取液制备同
上 ,药液浓度为 0. 06 g mL - 1;乌头 、白蔹合用按《中
华人民共和国药典》2005年版一部规定的临床剂量比
例 称 重 混 合 , 制 备 方 法 同 上 , 药 液 浓 度 为
0. 08 g mL -1。空白组给予 0. 9%氯化钠溶液 ,各药
物组给予规定剂量 ,连续灌胃给药 7 d后处死动物 ,取
肝脏制备微粒体和提取总 RNA。
1. 3　实验药品与试剂　Fo lin酚试剂 、对硝基酚 (4-
N itropheno l, 4-NP)、非那西丁 (phenace tin)、对乙酰氨
基酚 (paracetamo l)为 Sigm a 公司 产品;红霉 素
(ery thromycin)购自 AMRESCO公司;1, 2-二羟基-4-硝
基苯 (4-N itrocatecho l, 4-NC )为 ACROS公司产品;
RNA 提取试 剂盒 (RNAgents To tal RNA iso lation
sy stem)、逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)一步法试
剂盒为 Promega公司产品;DL 2000 DNA M arker为
TAKARA 公 司产 品。 CYP1A2、 CYP2E1、 CYP3A1、
CYP3A 2和 CYC(Cycloph ilin,亲环素 )的引物由北京赛
百盛基因技术有限公司合成 。兔抗鼠多克隆抗体及
ECL化学发光试剂为 Santa C ruz公司产品;辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体为 CHEM ICOM公司
产品;预染蛋白标准 (P restained Pro tein M arker, B road
Range)为 NEW ENGLAND公司产品 。其他无机及有
机试剂均为国产分析纯。
1. 4　肝微粒体的制备　大鼠脱臼处死 ,打开腹腔和胸
腔 ,用止血钳结扎胸腔主动脉和下腔静脉。用注射器
吸冰冷 0. 9%氯化钠溶液从下腔静脉止血端上缘冲洗
肝脏 ,至肝脏颜色变为土黄色止。采用钙沉淀法制备
微粒体 ,肝脏组织按 1：4(W /V)比例加入 TM S缓冲液
匀浆后于 12 000 g , 4 ℃,离心 20m in,弃沉淀 ,取上清
液 ,每 1 mL 上清液加 88 mmol L - 1氯化钙溶液
0. 1mL, 轻搅 拌数 次 , 混匀 , 冰浴 5 m in。再 以
27 000 g , 4℃,离心 20 m in,弃上清液 ,取沉淀 ,按 1 g
肝重 加 0. 1 mo l L -1 T ris-HC l buffe r 1 mL, 含
150mmo l L -1氧化钾 , pH值 7. 4。再 27 000 g ,离心
20 m in, 4 ℃, 弃 上清 , 取沉 淀 , 按 1 g 肝重 加
0. 01mo l L -1 Tris-HC l buffer(含 1 mmo l L- 1 EDTA
and 20% (W /V)甘油 , pH值 7. 4)缓冲液 1mL用玻
璃匀浆器重悬 ,重悬液放入液氮管中 ,液氮中保存备
用 。微粒体蛋白含量采用 LOWERY[ 3]法定量 ,使用牛
血清蛋白作为标准。
1. 5 　 CYP1A2、 CYP2E1、 CYP3A1 /2 活性测定 　
CYP1A 2活性按文献 [ 4]测定;CYP2E1活性按文献
[ 5]测定;CYP3A1 /2活性按文献 [ 6]测定。
1. 6　CYP450及 b5含量测定　CYP450与 b5含量测定
采用 Omura和 Sato方法测定[ 7] 。
1. 7　蛋白质免疫印迹 (Weste rn blot)十二烷基磺酸
钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)　按 LAEN-
MLI
[ 8]方法进行 。 20 ～ 30 μg的微粒体蛋白用 10%
SDS-PAGE分离后 ,再按照 TOWB IN等 [ 9] 介绍的方法
电转印到 PVDF膜上 。电转印完后 ,用含 5%(W /V)
脱脂奶粉的 TTBS封闭液 4 ℃封闭过夜。再取封闭后
PVDF膜置于含兔抗鼠多克隆抗体 (一抗 )的上述封闭
液中室温摇床孵育 1 h,用 TTBS缓冲液洗膜 3次 ,每
次 15 m in;再将 PVDF膜置于含羊抗兔多克隆抗体 (辣
根过氧化物酶标记的二抗 )的上述封闭液中室温摇床
孵育 1 h,用 TTBS缓冲液洗膜 3次 ,每次 15 m in;再用
TBS缓冲液洗膜 1次 , 10 m in。将已用二抗标记了的
PVDF膜与 ECL化学发光试剂反应 ,在暗室与 X光胶
片曝光后显影。用 Scion image 1. 62c软件测条带灰度
值 ,计算目的蛋白与看家蛋白 (GAPDH)的灰度比值。
检测时以 GAPDH 为内参照 , 以 CYP1A2、CYP2E1、
CYP3A 1、CYP3A2与 GAPDH蛋白表达量灰度的比值
作为 P450亚酶蛋白质表达的相对水平。所有蛋白质免
疫印迹的结果都在同组不同样品上得到重复。
1. 8　总 RNA的提取　大鼠处死后迅速取出肝脏 ,置
于液氮中保存 。按 Promaga公司 RNA提取试剂盒说
明书提取肝脏总 RNA。电泳分析表明总 RNA片段未
降解 , 18S和 28S条带清晰可见 , A260 /A280比值 1. 6 ～
1. 8,所提总 RNA可用。
1. 9　RT-PCR　采用 Promaga公司的 RT-PCR一步法
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试剂盒说明书进行。将 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1、
CYP3A 2及 CYC(看家基因 )等体积的 RT-PCR产物
10 μL上样 ,经 1. 5%琼脂糖凝胶电泳辨认 ,照相。检
测时以 CYC 基因的 RT-PCR产物为内参照 , 以
CYP1A 2、CYP2E1、CYP3A1、CYP3A2与 CYC基因扩增
条带表达量像素灰度的比值作为 P450亚酶 mRNA表达
的相对水平 。特异性引物序列见表 1。
表 1　用于 RT-PCR分析的大鼠 P450亚酶引物序列　
P450同工酶 5’正义链引物 3’反义链引物 片段长度 /bp
CYP1A2 GTCACCTACGGGAATGCTGTG GTTGACAATCTTCTCCTGAGG 236
CYP2E1 CTCCTCGTCATATCCATCTG GCAGCCAATCAGAAATGTGG 473
CYP3A1 ATCCGATATGGAGATCAC GAAGAAGTCCTTGTCTGC 579
CYP3A2 AGTAGTGACGATTCCAACATAT TCAGAGGATTCTGTGTTTCCT 252
CYC CTTCGACATCACGGCTGATGG CAGGACCTGTATGCTTCAGG 265
1. 10　统计学方法　实验数据用均数 ±标准差 (x ±s)
表示 ,采用 SPSS10. 0统计软件单因素方差分析进行组
间比较 。P <0. 05表示差异有显著性。
2　结果　
2. 1　乌头 、白蔹合用后对大鼠肝脏 CYP1A2、CYP2E1、
CYP3A 1 /2酶活性的影响　见图 1,与空白对照组比
较 ,单用白蔹能显著降低 CYP1A2 的活性 , (P <
0. 05),与乌头合用后也能降低 CYP1A2的活性 ,但没
有统计学意义;从图 1可见 ,与空白对照组比较 ,白蔹
单用及与乌头合用对 CYP2E1的活性基本无影响;从
图 1-Ⅲ可见 ,与空白对照组比较 ,白蔹与乌头均能降低
CYP3A 1 /2活性 ,白蔹组更明显 (P <0. 01),合用组虽
然表现出一定的活性抑制趋势 ,但没有统计学意义 。
图 1　乌头 、白蔹单用 、合用对 CYP1A2、
CYP2E1、 CYP3A1 /2酶活性的影响　
　　 Ⅰ 表示药物对 CYP1A2酶活性的影响;Ⅱ表示药物对
CYP2E1酶活性的影响;Ⅲ表示药物对 CYP3A1 /2酶活性的影
响。 A为空白对照组;B为乌头组;C为白蔹组;D为乌头加白
蔹组。与 A组比较 , *1 P <0. 05, *2 P <0. 01
2. 2　乌头 、白蔹配伍后对 CYP450及 b5含量的影响　
同时测定了 CYP450及 b5的含量 ,以期找到酶活性之
间的相关性 。从表 2可见 ,药物合用后没有影响 P450和
b5的含量(n=8)。
2. 3　乌头 、白蔹配伍后对 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1、
CYP3A 2蛋白质表达的影响　在酶活性测定及 P450 、b5
总蛋白含量测定的基础上 , 采用蛋白质免疫印迹
(W estern blo t)评 价 CYP1A2、 CYP2E1、 CYP3A1、
CYP3A2这几个亚型的蛋白质表达水平与酶活性改变
的相关性 。从图 2可以看出 ,与空白对照组比较 ,乌头
与白蔹配伍后使 CYP3A 2的蛋白表达水平明显降低 ,
而对 CYP1A2、CYP3A1蛋白质表达的影响表现为诱导
作用;白蔹组有明显抑制 CYP3A2蛋白质表达的作用。
　表 2　白蔹 、乌头单用 、合用对 CYP450、b5含量的影响　
nm o l m g- 1 , x±s
组别 大鼠 /只 P450 b5
对照组 8 0. 55±0. 19 0. 18±0. 17
乌头组 8 0. 49±0. 16 0. 16±0. 06
白蔹组 8 0. 53±0. 17 0. 37±0. 03
白蔹加乌头组 8 0. 52±0. 08 0. 18±0. 04*1
　　与白蔹组比较 , *1 P <0. 01
图 2　乌头 、白蔹单用 、合用对 CYP1A2、
CYP2E1、 CYP3A1 、CYP3A2蛋白表达的影响　
　　Ⅰ表示药物对 CYP1A2的影响;Ⅱ表示药物对 CYP2E1的
影响;Ⅲ表示药物对 CYP3A1的影响;Ⅳ表示药物对 CYP3A2
的影响;A表示空白对照组;B表示乌头组;C表示白蔹组;D表
示乌头加白蔹组
2. 4　乌头 、白蔹合用后对 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1、
CYP3A2 mRNA表达的影响 　由于药物合用后 , 对
CYP1A2、CYP3A1、CYP3A2等几个亚型蛋白质水平的
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影响有抑制 ,也有诱导 ,于是进一步设想这种效应是否
发生在转录前的水平上 。实验采用逆转录-聚合酶链
式反应 (RT-PCR)评价了 CYC(cycloph ilin,看家基因)、
CYP1A 2、CYP2E1、CYP3A1、CYP3A2的 mRNA表达 。
从图 3 可见 , 乌头与白蔹合用 后 , 对 CYP1A2、
CYP3A 1、 CYP3A 2 的 mRNA 表 达 呈 诱 导 作 用 。
CYP1A 2、CYP3A1的 mRNA水平与其蛋白质表达相一
致 。但 CYP3A 2在这两个水平上的结果正好相反。
图 3　乌头 、白蔹单用 、合用对 CYP1A2、
CYP2E1、 CYP3A1 、CYP3A2mRNA水平的影响　
　　Ⅰ表示药物对 CYP1A2 mRNA表达的影响;Ⅱ表示药物对
CYP2E1m RNA表达的影响;Ⅲ表示药物对 CYP3A1 mRNA表
达的影响;VI表示药物对 CYP3A2 mRNA表达的影响。 A为空
白对照组;B为乌头组;C为白蔹组;D为乌头加白蔹组
3　讨论　
在人类肝脏微粒体中 ,参与内源性和外源性物质
(包括药物 、环境污染物等 )代谢的细胞色素 P450亚型
主要有 CYP1A2、CYP2E1和 CYP3A等 ,它们分别占
CYP总量的 13%, 7%和 30%[ 10] 。 CYP1A2参与了咖
啡因 、非那西丁 、醋氨酸 、17-β雌二醇 、普萘洛尔 、维拉
帕米 、硝苯地平 、丙米嗪等二十几种药物的代谢 ,另外
在十几种前致癌物的激活或灭活中发挥重要作用 ,且
其活性与药物的疗效或毒性及某些肿瘤的易感性密切
相关[ 11] 。实验结果表明白蔹与乌头合用后对 CYP1A2
的酶活性的作用表现出一定的抑制趋势。
CYP2E1是许多低分子有机化合物及药物在体内
的主要代谢酶 ,如乙醇 、蒽氟烷 、氟烷 、氯唑沙宗 、对乙
酰氨基酚及烟草中的许多成分等均通过 CYP2E1在体
内进行生物转化 。实验结果表明白蔹与乌头合用后对
CYP2E1的酶活性的影响并不明显。
CYP3A在许多内外源化合物的代谢中起着重要
作用 ,可参与化合物红霉素 、尼莫地平 、利多卡因 、环孢
霉素 、奥美拉唑等 38个类别共 150多种药物在体内的
代谢;内源性化合物代谢包括睾酮 、黄体酮 、氢化可的
松 、雄烯二酮的 6-β羟化反应 ,雌二醇的 2 , 4-羟化反
应 ,去氢表雄酮的 16-α羟化反应等。此外还参与部分
前致癌物的活化[ 12, 13] 。实验结果表明白蔹与乌头合
用后对 CYP3A1 /2的酶活性的作用表现出一定的抑制
趋势 。
为了进一步研究药物导致 CYP450主要亚型酶活
性发生改变的机制 ,即究竟是哪一个环节受到影响而
使酶活性发生改变 。是在基因水平受到了影响  还是
在蛋白质水平受到了影响  实验评价了药物合用后对
CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1、CYP3A2在蛋白质水平和
mRNA水平的影响 。实验结果表明 ,乌头白蔹合用后
诱导了 CYP1A2、CYP3A1蛋白质表达 ,抑制了 CYP3A 2
蛋白质表达;诱导了 CYP1A2、CYP3A1、CYP3A2的
mRNA表达。可见 ,在酶活性 、蛋白质表达和 mRNA水
平上 ,除了 CYP3A2的蛋白质表达与酶活性保持一致
外 ,其余几个亚型 ,在蛋白质表达和 mRNA水平上具有
相关性 ,但与酶活性正好相矛盾。在一个细胞 、器官和
组织中 ,单个蛋白质表达水平并不完全反映这种蛋白
质的生物活性 ,这种现象是普遍存在的。蛋白质活性
是一个复杂的综合过程 ,它涉及到蛋白质翻译后修饰 ,
在组织 、细胞和亚细胞中的定位以及它与别的蛋白质
间的相互作用 。分析蛋白质活性必须考虑每个方面并
把所得各部分的数据综合起来 。有研究结果显示 ,毒
性效应可以通过蛋白质修饰的方式显示出来。在
mRNA水平研究基因表达似乎是一种比蛋白质更简单
而且灵敏的手段 ,但是 ,通过 mRNA浓度的测定得到的
基因调控研究是间接的 ,仅能代表一种间接的测量 ,还
有很多现象未能检出;在翻译水平的基因表达调控在
多数情况下是起决定作用的 ,这类调控通过 mRNA的
定量分析检测不到 。以上这些观点或许可以成为本次
实验中酶活性测定结果与蛋白质水平和 mRNA水平不
一致的一种解释。
结合实验室前期工作中对乌头碱代谢亚型研究的
结果 [ 2] ,初步认为乌头 、白蔹合用存在产生相互作用的
可能性 。因为:①乌头与白蔹合用后对 CYP1A2、
CYP3A1 /2的活性有抑制趋势;②乌头碱的代谢亚型
主要是 CYP3A和 CYP1A2;③ CYP3A和 CYP1A 2对乌
头碱的代谢过程是一个逐渐降低毒性的解毒过程。从
理论上而言 ,白蔹与乌头合用后 ,有可能会导致乌头碱
毒性增加的结果。原因是药物合用抑制了代谢乌头碱
的亚型酶 CYP1A2、CYP3A1 /2的活性致使乌头碱的被
肝细胞色素 P450酶代谢的速度减慢使其在体内的停留
时间延长或相对血药浓度增加 ,从而产生乌头碱毒性
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增加的相互作用 。当然这种推断有待于进一步的实验
验证。
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979 医药导报 2007年 9月第 26卷第 9期