全 文 ：水产科技
FISHERIES SCIENCE & TECHNOLOGY
田海军
（信阳农业高等专科学校水产科学系，河南 信阳 464000）
摘要：用 95％的乙醇来提取地锦草中的化合物，接着又分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水对地
锦草乙醇提取物进行分极性段萃取，研究地锦草各极性段二甲基亚砜萃取溶液对嗜水气单胞菌、温和气单
胞菌、柱状屈挠杆菌、鳗弧菌等 4种常见水产动物病原菌的抑菌效果。结果表明：地锦草各极性段的抑
菌作用强度有明显差别（p<0.5)，其中乙酸乙酯、石油醚极性段的抑菌作用最为强烈，对温和气单胞菌的
MIC均 12.5mg.ml-1；乙酸乙酯极性段对嗜水气单胞菌、鳗弧菌的MIC均 50 mg.ml-1；石油醚极性段
对嗜水气单胞菌、鳗弧菌的MIC≥25mg.ml-1；正丁醇和水极性段对四种菌的MIC均≥50mg.ml-1。
关键词：地锦草，抑菌环，嗜水气单胞菌，温和气单胞菌，柱状屈挠杆菌，鳗弧菌
The invitro Growth-Inhibitory Effect of Euphorbia Humifusa
Willd. (EWH) on Bacteria
Tian Haijun
（Department of Aquatic Science，Xinyang Agricultural College，Xinyang 464000，China）
Abstract: The Euphorbia Humifusa Willd was extracted by 95% ethanol.Then the primary product was
extracted by sherwood oil, ethyl acetate, normal butanol and water expectively to prepare four preperations
containing different content of Euphorbia humifusa Willd. The growth inhibiting of these Euphorbia humi－
fusa Willd preperations on the commen aquatic pathogenicbateria such as backwoods coli, bacillus subtilus,
golden yellow staphylococcus and eel vibrio bacteriostasis were studied. The results showed that: Euphorbia
humifusa the polar intensity of antimicrobial effect paragraphs significant differences (p<0.5) , where ethyl
acetate, petroleum ether segment polarity strongest antimicrobial effect against Aeromonas bacteria in MIC
were 12.5mg.ml-1; ethyl acetate-polar segment of the Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum MIC were
50mg.ml-1; petroleum ether-polar segment of the Aeromonas hydrophila , Vibrio anguillarum MIC ≥25mg.
ml-1; n-butanol and water-polar segment of the four kinds of bacteria in MIC were ≥50mg.ml-1.
Key words: Euphorbia Humifusa Willd, bacteriostasis circle, Aeromonas hydrophil，Aeromonas sobria，
Flexibacter columnaris，Vibrisis angnillarumz
地锦草对水产病原菌体外抗活性的研究
1作者简介： 田海军 （1980-）， 男， 湖北枣阳人， 硕士， 讲师， 研究方向： 水产动物病理与病害研究。
地锦草 (EuphorbiahumifusaWild.) 属大戟科、
大戟属植物，有铺地锦、血见愁、草血竭、花被
单、奶汁草等 40 多个别名，生于田间路旁和庭
院，全国各地均有分布。地锦草属清热解毒类中
药，具有清热解毒、活血止血、利湿通乳之功效，
常用于治疗泻痢、痈肿疔疮、出血、湿热黄疸和
乳汁不通等病证，其成分主要有黄酮、有机酸、
甾醇、萜和单宁类化合物、没食子酸甲酯、没石
子酸、槲皮苷及槲素、鞣质、肌醇等 [1-4]。地锦草
对水产病原菌体外抗活性的研究尚未见报道。本
试验旨在通过对地锦草的不同萃取段提取物对嗜
水气单胞菌、温和气单胞菌、柱状屈挠杆菌、鳗
弧菌等常见水产动物病原菌的体外抑菌活性的比
较，为地锦草制剂的进一步研制及其在水产动物
疾病中的应用提供试验依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品
地锦草全草（采自信阳农业高等专科学校校
园内）。
1．1．2 菌种
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嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、温
和气单胞菌（Aeromonas sobria）、柱状屈挠杆菌
（Flexibacter calumnaris）、 鳗 弧 菌 （Vibrisis
angnillarumz）。
1．1．3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、2216E培养基。
1．1．4 试剂
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、酵母膏、溴化钠、
氯化镁、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、氯
化钠、氢氧化钠、二甲基亚砜等。
1．1．5 仪器
分液漏斗、广口瓶、旋转蒸发仪、真空干燥
箱、高压灭菌锅、三角瓶、培养皿、恒温控制箱、
超净工作台等。
1．2 方法
1．2．1 地锦草提取液的制备
地锦草用乙醇浸泡，将乙醇提取物分别旋转
蒸发（中国药村公司，1994）。将地锦草的醇提物
分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水于分液漏
斗中萃取，每种溶剂萃取三次，得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ段提取物。分别取地锦草四层的提取物于真空
干燥箱中干燥两小时。分别取干燥后的样品各
100mg用二甲基亚砜配成 100mg/ml的药液[5]。
1．2．2 菌悬液的制备
牛肉膏蛋白胨培养基适合嗜水气单胞菌、温
和气单胞菌、柱状屈挠杆菌的生长；2216E 培养
基适合鳗弧菌的生长。将供试菌种接种于相应的
试管斜面培养基上。37℃恒温箱中培养 18～24h。
用接种环分别挑取少量菌体于装有无菌生理盐水
的试管内。震荡均匀，制成菌悬液[6]。调整菌悬液
的浓度，用平板菌落计数法测定其菌液浓度，并
用 生 理 盐 水 将 菌 液 稀 释 至 105 ～106cfu/ml
（TABATA N，1997）。
1．2．3 抑菌圈的测定
中草药提取物液抑菌圈的测定采用 Kirby-
Baue纸片扩散法（Zhao F等，2005）。在超净工
作台上用无菌吸管吸取 0.1ml 菌悬液于相应的营
养平板上，用涂布棒将菌液涂布均匀。将已浸过
药液的干燥药敏滤纸片（直径 6mm） 贴在含菌培
养皿上，每皿贴三片（用二甲基亚砜作对照），每
种菌做三次重复。将培养皿置于 37℃恒温箱中培
养 24h，测定含药滤纸片的抑菌圈直径大小，取平
均值，比较抑菌浓度。Kirby-Baue纸片扩散法抑
菌圈判断标准：抑菌圈直径大于 6 mm者判为有
抑菌作用；抑菌圈直径小于或等于 6 mm者判为
无抑菌作用；抑菌圈直径大于 6 mm小于 10 mm
为低度敏感；大于 10 mm小于 15 mm为中度敏
感；大于 15 mm为高度敏感[7]。
1．2．4 最小抑菌浓度的测定
用液体稀释法测定各极性段的最小抑菌浓度
（Mininum Inhibitory Concentration，MIC） 即配
置细菌液体培养基按每管 5ml分装试管，再加入
不同浓度的药液，配成系列浓度梯度的培养基。
接种相同量的菌液，于 37℃恒温震荡培养箱中培
养 48h,另取不接种任何菌种的培养基做为空白对
照。以培养基中完全没有细菌生长时的最低浓度
为MIC[8-12]。
1．2．5 最小杀菌浓度的测定
从各段药物的MIC和高于MIC的试管中吸取
0.1ml 培养物转接于相应的培养基上 37℃培养
48h，观察菌落的生长情况，无菌落生长的最小浓
度即为该药物对该菌株的最小杀菌浓度（Mininum
Bactericidal Concentration，MBC）。
2 实验结果与分析
2．1 地锦草各极性段的抑菌圈
表1 四个极性段提取液的抑菌作用（抑菌圈直径mm）
Table 1 in paragraph 4 -polar extract of an－
timicrobial effect (inhibition zone diameter mm)
由表 1 中结果可知地锦草四极性段的药液
（100mg/ml）对四种供试菌均有一定的抑制作用。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段对四种菌的抑制作用均很明显，而Ⅳ段
的抑菌效果较其它三个稍弱。通过统计分析Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ段与Ⅳ段抑菌作用差异极显著（p<0.01)，Ⅰ、Ⅱ、
Ⅲ之间差异显著（p<0.5),Ⅱ段对四种细菌的抑制效
果都很明显。按照 Kirby-Baue纸片扩散法判断标
准，地锦草石油醚极性段和乙酸乙酯极性段提取物
均对嗜水气单胞菌和鳗弧菌中度敏感，对温和气单
胞菌高度敏感，对柱状屈挠杆菌低度敏感；正丁醇
极性段提取物对嗜水气单胞菌中度敏感、对温和气
单胞菌和柱状屈挠杆菌高度敏感，对鳗弧菌低度敏
感；水提取物对温和气单胞菌中度敏感，对其他三
种病原菌低度敏感。结果提示地锦草石油醚和乙酸
乙酯提取物对四种病原菌均有很好的抑制效果，在
利用地锦草治疗这 4种水产病原细菌引起的感染
时，应选用石油醚和乙酸乙酯作为提取溶剂。
2．2 最小抑菌浓度（MIC）
组别 嗜水气单胞菌 温和气单胞菌 柱状屈挠杆菌 鳗弧菌
Ⅰ 12.3±1.2 17.5±1.4 6.9±1.2 11.7±1.5
Ⅱ 11.6±0.8 21.8±1.1 7.1±1.2 14.8±0.9
Ⅲ 14.8±0.6 15.5±0.8 16.9±1.3 8.9±1.2
Ⅳ 7.3±0.5 12.5±1.4 8.0±0.7 7.2±1.6
二甲基亚砜 0 0 0 0
技术研究
Technical research18
水产科技
FISHERIES SCIENCE & TECHNOLOGY
表 2 地锦草各极性段的MIC的测定
Table 2 Euphorbia humifusa the MIC
determination of segment polarity
注：+++表示高度浑浊，++表示中度浑浊，+表示轻
微浑浊，- 表示不浑浊。
从表 2可知，地锦草Ⅰ、Ⅱ段对温和气单胞
菌的MIC均≥12.5mg.ml-1，其中Ⅰ段对嗜水气单
胞菌、鳗弧菌的MIC均≥50mg.ml-1，而Ⅱ段对嗜
水气单胞菌、鳗弧菌的MIC≥25mg.ml-1。Ⅲ、Ⅳ
对上述四种菌的MIC均≥50mg.ml-1。结果提示，在
利用地锦草石油醚和乙酸乙酯提取物治疗温和气
单胞菌引起的感染时，药物浓度应≥12.5mg.ml-1，
治疗嗜水气单胞菌、鳗弧菌引起的感染时，药物
浓度应 50mg.ml-1。
2．3 最小杀菌浓度的测定
据菌落的生长状况可知，Ⅰ对温和气单胞菌
的 MBC为 25mg.ml-1 ,对嗜水气单胞菌、柱状屈
挠杆菌、鳗弧菌的MBC则均为 100mg.ml-1 ；Ⅱ
段对温和气单胞菌的 MBC为 25mg.ml-1，对嗜水
气单胞菌、柱状屈挠杆菌的 MBC 为 50mg.ml-1，
对鳗弧菌的 MBC 为 100mg.ml-1；Ⅲ段对温和气
单胞菌的MBC为 50mg.ml-1；Ⅳ无明显的杀菌效
果。
将结果与表 2数据比较可得地锦草各极性段
的MIC均小于MBC。
3 结论
实验表明：地锦草各极性段的抑菌作用强度
有明显差别，其中以乙酸乙酯、石油醚的抑菌作
用最为强烈，对 4 种水产病原菌均有抑制作用，
在利用地锦草治疗这 4种水产病原细菌引起的感
染时，应选用石油醚和乙酸乙酯作为提取溶剂。
地锦草乙酸乙酯提取部分所含的化学成分多为黄
酮类，而黄酮类化合物本身就有很好的抑菌作用[13]。
石油醚提取部分所含的化学成分多为单萜类、倍
半萜类） 也具有较好的抑菌作用[14]。正丁醇和水提
取部分所含的化学成分多为糖苷类，其抑菌作用
较差。
在人类医学上地锦草属清热解毒类中药，具
有清热解毒、活血止血、利湿通乳之功效，常用
于治疗泻痢、痈肿疔疮、出血、湿热黄疸和乳汁
不通等病证，但是长久以来地锦草一直被作为一
种杂草或动物饲料，尤其是地锦草的水产药用价
值有待开发利用，本试验证实了地锦草的抗菌作
用，可探讨其在水产动物饲料添加剂或者水产药
物方面的应用。
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药物 浓度 /mg.ml- 1 嗜水气单胞菌温和气单胞菌柱状屈挠杆菌 鳗弧菌
Ⅰ
50 - - + -
25 + - + +
12.5 ++ - ++ ++
6.25 +++ + +++ +++
Ⅱ
50 - - + -
25 + - ++ +
12.5 + - ++ +
6.25 ++ ++ ++ ++
Ⅲ
50 - - - +
25 + + + ++
12.5 ++ ++ ++ +++
6.25 +++ +++ +++ +++
Ⅳ
50 + - + +
25 + + ++ +
12.5 ++ ++ +++ ++
6.25 +++ +++ +++ ++
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