全 文 ：［收稿日期］ 20100718(001)
［通讯作者］ * 黄 显 章，Tel:13569262483，E-mail:hxzgreat @
163. com。
瓜子金有效部位群抗炎作用机制研究
赵清超1，黄显章1* ，胡久略1，袁林2，毛秉豫1
(1. 南阳理工学院张仲景国医学院，河南 南阳 473004;
2. 湖北中医药大学“中药资源与中药复方”省部共建教育部重点实验室，武汉 430061)
［摘要］ 目的:采用体外炎症模型研究瓜子金有效部位群抗炎作用机制。方法:建立脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞系
RAW264. 7 细胞体外炎症模型，研究不同浓度瓜子金有效部位群对一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6
(IL-6)的释放及对 TNF-α 和 IL-6 mRNA 表达的影响。结果:瓜子金有效部位群能显著降低 LPS 诱导的 RAW264. 7 细胞 NO，
IL-6 及 TNF-α 的释放，显著降低 TNF-α 及 IL-6 mRNA 的表达。结论:瓜子金有效部位群抗炎作用与其减少巨噬细胞炎症介质
的生成与释放及降低 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的表达密切相关。
［关键词］ 瓜子金;有效部位群;一氧化氮;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)02-0131-04
Studies on Anti-inflammatory Mechanism of
Polygala japonica Effective Ingredients in Vitro
ZHAO Qing-chao1，HUANG Xian-zhang1，HU Jiu-lue1，YUAN Lin2，MAO Bing-yu1
(1 . ZHANG Zhong-jing Traditional Chinese Medicine (TCM)College，Nangyang University of Technology，
Nanyang 473004，China;2 . Key Laboratory of Resources and Cooperation of TCM，
Ministry of Education，Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China)
［Abstract］ Objective:The inflammatory model in vitro was used to evaluate the anti-inflammatory
mechanism of Polygala japonica effective ingredients. Method:RAW264. 7 macrophage line was induced by
lipopolysaccharide(LPS)to set up the inflammatory model. To study the effect of P. japonica effective ingredients on
the inflammation factors by assaying the concentration of nitric oxide (NO)，tumor necrosis factor-α (TNF-α)and
interleukin-6 (IL-6). The mRNA expression of TNF-α and IL-6 was assayed with real-time quantitative polymerase
chain reaction (PCR)too. Result:P. japonica effective ingredients could significantly reduce the release of NO，IL-
6 and TNF-α in LPS-induced RAW264. 7 macrophage line，and obviously decrease the mRNA expression of TNF-α
and IL-6，too. Conclusion:The anti-inflammatory mechanism of P. japonica effective ingredients may be related to
reducing the release of inflammation factors in macrophage cell and inhibiting the mRNA expression of TNF-α and
IL-6.
［Key words］ Polygala japonica;Effective Ingredients;nitric oxide;tumor necrosis factor-α;interleukin-6
瓜子金 Polygala japonica Houtt.，又名小远志、
地藤草、银不换，为远志科(Polygalaceae)远志属
(Polygala L.)植物，多年生草本。瓜子金最早见载
于《植物名实图考》，曾被 1977 年版《中国药典》收
载，全草入药，具有祛痰止咳、宁心安神、散血止瘀的
作用，主治咳嗽痰多、咽喉肿痛、心悸失眠、痈肿疮疡
等症［1］。河南伏牛山地区民间用其治疗肺结核、咽
喉肿痛、无名疖肿、食道癌、呼吸道炎症、毒蛇咬伤等
疾病，均有良好的疗效。研究资料显示瓜子金体内
给药具有显著的抗炎活性［2-4］。本试验室前期研究
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第 17 卷第 2 期
2011 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 2
Jan.，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.02.040
中采用大孔吸附树脂纯化技术获得以总黄酮、总皂
苷为主要成分的有效部位群(总黄酮、总皂苷含量达
77%以上)，本文利用体外炎症模型对瓜子金有效部
位群抗炎机制进行初步的研究。
1 材料
1. 1 RAW264. 7 细胞株 购于武汉大学典型培养
物保藏中心。
1. 2 药物与试剂 瓜子金有效部位群，秋季成熟时
采集瓜子金全草，洗净，晒干，70%乙醇提取，大孔吸
附树脂纯化后喷雾干燥，其中总黄酮、总皂苷含量达
77%以上(其中总黄酮含量不低于 33%，总皂苷含
量不低于 44%);试验时用二甲基亚砜及无水乙醇
(1 ∶ 9)溶解，配成实验所需浓度。脂多糖(LPS，
011B4)，Sigma 公司;RPMI 1640 培养基，Invitrogen
公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公
司;Trizol Reagent，Invitrogen 公司;人肿瘤坏死因子-
α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)ELISA 试剂盒，美国
R＆D 公司;其余试剂为国产分析纯。
1. 3 主要仪器 多元定量 PCR 仪 (美国 MJ
RESEARCH 公司);多功能荧光酶标仪(瑞士 Tecan
公司);EDC-810 基因扩增仪(东盛创新生物科技有
限公司);BS110S 分析天平(德国 Sartorius 公司);
Napco 5410 型二氧化碳孵箱，美国 NAPCO 公司;
BCN-1360 型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有
限公司;XDS-1B 倒置显微镜，重庆光电仪器公司。
2 方法
2. 1 细胞培养与处理 RAW264. 7 细胞株培养于
含 10%胎牛血清 100 U·mL － 1青霉素的 RPMI 1640
培养基中，在 37 ℃ 5% CO2 条件下培养。
2. 2 瓜子金有效部位群对 RAW264. 7 细胞的细胞
毒作用［5］ RAW264. 7 细胞按 2 × 105 /孔接种于 96
孔板中，培养 24 h 后，弃上清，分别加入质量浓度为
100，50，20，10，1 mg·L － 1的瓜子金有效部位群，每个
浓度设 5 个复孔，37 ℃ 5% CO2 培养箱中孵育 24 h，
每孔加入 MTT (5 g·L － 1，PBS 配制)20 μL，继续孵
育 4 h，弃去上清，每孔加入 150 μL DMSO，震荡 10
min，于 492 nm 波长处测定吸光度(A)。药物对细
胞生长的抑制作用以存活率表示，存活率越高，表明
药物毒性越低。存活率计算公式如下:
存活率 =(药物干预孔 A － 空白对照孔 A)/(正常细胞
孔 A －空白对照孔 A)× 100%
2. 3 考察瓜子金有效部位群干预后细胞上清液中
亚硝酸盐含量的变化［6］ 细胞悬液以每孔 1 × 105 /
100 μL 接种于 96 孔板，培养 24 h。空白组采用含
0. 1% DMSO 的 RMPI 1640 培养细胞，模型组采用
LPS (1 mg·L － 1)刺激细胞，瓜子金有效部位群组采
用 10，20，50 mg·L － 1 3 个剂量处理细胞。各组分别
刺激 24，48 h 后，吸取 96 孔板中的培养液 100 μL 到
另一 96 孔板中，加入等体积的 Griess reactin 试剂，
室温放置 10 min，用酶标仪读取 540 nm 处 A，计算瓜
子金有效部位群各剂量组在不同处理时间对细胞上
清液中亚硝酸盐抑制率。
抑制率 =(模型组 A －各剂量干预组 A)/(模型组 A －空
白对照组 A)× 100%
2. 4 瓜子金有效部位群对 LPS 诱导的 RAW264. 7
细胞生成 TNF-α 和 IL-6 的影响 将 RAW264. 7 细
胞随机分为正常对照组，LPS 刺激组和瓜子金有效
部位群组，每组设 3 个复孔，正常对照组用 RPMI
1640 完全培养液常规培养;LPS 刺激组加入 LPS 使
终浓度为 1 mg·L － 1;瓜子金有效部位群组加入药物
使终浓度为 50 mg·L － 1，同时加入终浓度为 1 mg·
L － 1的 LPS。37 ℃ 5% CO2 孵育 12 h，收集上清液，
用 ELISA 法检测细胞上清液中 TNF-α 和 IL-6 含量。
操作步骤按试剂盒说明书进行。
2. 5 瓜子金有效部位群对 TNF-α 和 IL-6 mRNA 表
达的影响 细胞的培养与分组同 2. 4。分组后分别
加入药物和 LPS 刺激 2，4，8，12 h，收集细胞，加入 1
mL Trizol 裂解，按说明书方法提取总 RNA。按总
RNA 12 μL，5 × RT Buffer 4 μL，2. 5 mmol·L － 1 dNTP
混合液 2 μL，100 U·μL － 1 RT Ace 1 μL 比例配制混
合液，混合液在 PCR 分析仪中按如下程序进行逆转
录:30 ℃ 10 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5
min，获得 cDNA。按 Realtime PCR Master Mix 12. 5
μL，三蒸水 11. 0 μL，引物 0. 25 μL，cDNA 模板 1. 0
μL 配制 Real-time PCR 反应液，反应液置 Real-time
PCR 仪上进行 PCR 反应，以 GAPDH 为内参照，根据
C(t)值计算 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的相对表达量。
2. 6 统计学处理 采用 SPSS 11. 5 软件，统计分析
采用方差分析，结果用 珋x ± s 表示，P < 0. 05 差异有统
计学意义。
3 结果
3. 1 瓜子金有效部位群对 RAW 264. 7 细胞的毒性
作用 结果表明，瓜子金有效部位群质量浓度为
100 mg·L － 1时细胞存活率低于正常对照组，与正常
对照组相比有极显著性差异(P < 0. 01);药物质量
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第 17 卷第 2 期
2011 年 1 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 2
Jan.，2011
浓度在 1 ～ 50 mg·L － 1各给药组与正常对照组比较，
细胞存活率无显著性差异，说明瓜子金有效部位群
在 1 ～ 50 mg·L － 1无明显细胞毒性。
3. 2 瓜子金有效部位群对细胞中 NO 生成的影响
LPS 刺激 RAW264. 7 细胞可产生大量的 NO，模型
组细胞上清液中 NO 产物亚硝酸盐含量显著提高，
与空白对照组相比有显著性差异(P < 0. 01)。瓜子
金有效部位群组不同剂量在不同时间点均能显著抑
制细胞上清液中亚硝酸盐的含量，并呈良好的剂量
依赖关系，如表 1 所示。
表 1 瓜子金有效部位群对 LPS 刺激 RAW264. 7 细胞生成 NO 的影响 (珋x ± s，n = 4)
组 别 终质量浓度 /mg·L － 1 24 h /A 抑制率 /% 48 h /A 抑制率 /%
空白 － 0. 1890 ± 0. 0257 － 0. 2194 ± 0. 0330 －
模型 － 0. 352 ± 0. 013801) － 0. 4942 ± 0. 03191) －
瓜子金有效部位群 10 0. 2887 ± 0. 03072) 38. 8 0. 3465 ± 0. 03842) 53. 7
20 0. 2637 ± 0. 02672) 54. 2 0. 3114 ± 0. 03442) 66. 5
50 0. 2174 ± 0. 02532) 82. 6 0. 2555 ± 0. 02382) 86. 9
注:与空白组比较1)P < 0. 01;与模型组比较2)P < 0. 01。
3. 3 瓜子金有效部位群对 LPS 诱导的 RAW264. 7
细胞生成 TNF-α 和 IL-6 的影响 如表 2 所示，空白
对照组仅有少量 TNF-α 和 IL-6 表达，LPS 刺激组
TNF-α，IL-6 含量明显增加(P < 0. 01);瓜子金有效
部位群组与 LPS 刺激组相比，TNF-α 和 IL-6 蛋白的
含量明显减少(P < 0. 01)，说明瓜子金有效部位群
可显著抑制 TNF-α 和 IL-6 的表达。
表 2 瓜子金有效部位群对 LPS 诱导的 RAW264. 7 细胞
上清液中 TNF-α和 IL-6 含量的影响(珋x ± s，n = 3) ng·L － 1
组别
终质量浓度
/mg·L － 1
TNF-α IL-6
对照 － 8. 61 ± 0. 78 352. 84 ± 29. 12
LPS 1 425. 65 ± 17. 521) 561. 73 ± 32. 331)
瓜子金有
效部位群
50 66. 79 ± 4. 132) 382. 52 ± 26. 972)
注:与对照组比较1)P < 0. 01;与 LPS 组比较2)P < 0. 01。
3. 4 瓜子金有效部位群对 TNF-α 及 IL-6 的 mRNA
表达的影响 RAW264. 7 细胞经 LPS 刺激后，TNF-α
和 IL-6 mRNA 的相对表达量在不同的时间点均显著
增加，其中 TNF-α mRNA 在 2 h 时相对表达量最高，
IL-6 mRNA 在 8 h 时相对表达量最高;与 LPS 刺激
组相比，瓜子金有效部位群组在各时间段 TNF-α 和
IL-6 mRNA 的相对表达量均明显降低(P < 0. 01 或
P < 0. 05)。如图 1 ～ 2 所示。
4 讨论
巨噬细胞是炎症过程的重要效应细胞，广泛参
与机体的炎症反应，当受某些因素激活后会产生大
量的 NO 和 TNF-α，并进一步诱导 IL-6 等炎症细胞
因子的产生。脂多糖(LPS)为炎症刺激物，可激活
图 1 瓜子金有效部位群对 RAW264. 7 细胞经 LPS 刺激后
TNF-α mRNA 表达的影响
与 LPS 刺激组比较1)P < 0. 05，2)P < 0. 01(图 2 同)
图 2 瓜子金有效部位群对 RAW264. 7 细胞经 LPS 刺激后
IL-6 mRNA 表达的影响
巨噬细胞，促使 NO、氧自由基、胞因子、趋化因子、细
前列腺素等的表达，加剧炎症反应［7］。
本试验针对瓜子金有效部位群对 LPS 诱导
RAW264. 7 细胞释放 NO，TNF-α 及 IL-6 等炎症因子
的影响进行了研究，结果表明瓜子金有效部位群能
显著抑制 NO，TNF-α 及 IL-6 的生成与释放，能显著
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赵清超，等:瓜子金有效部位群抗炎作用机制研究
降低 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的表达。由此可以推测
瓜子金有效部位群可能通过调节巨噬细胞产生 NO，
TNF-α 及 IL-6 等炎症因子来发挥抗炎作用。
本试验室前期研究中已采用现代大孔吸附树脂
纯化技术获得瓜子金有效部位群(总黄酮、总皂苷含
量达 77%以上)，本研究是在前期研究的基础上，对
瓜子金有效部位群抗炎的作用机制进行探讨，以期
为其二次开发出物质基础明确、作用机制清楚的现
代中药制剂提供科学依据。
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［责任编辑 聂淑琴］
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