全 文 ：论著 　　　 文章编号:1000-5404(2005)08-0742-03
甘遂配伍甘草对大鼠肝脏 CYP2E1表达及活性的影响
代方国1 ,罗　仁1 ,王宇光2 ,夏成云3 ,谭洪玲2 ,肖成荣2 ,赵永红2 ,高　月2　　(1 南方医科大学中医系 , 广州 510515;
2 军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室 ,北京 100850;3 川北医学院附属医院中医科 , 南充 637000)
　　提　要:目的　通过检测细胞色素氧化酶 CYP2E1的表达和活性变化 ,从分子水平探讨中药配伍禁忌“十八反” 理论
中甘遂配伍甘草的药理机制。方法　利用 RT-PCR 检测大鼠肝脏 CYP2E1 mRNA 水平;通过Western blot 检测大鼠肝脏
CYP2E1蛋白表达;采用高效液相色谱(HPLC)法测定 CYP2E1酶活性 。结果　甘遂组 、甘草组和甘遂甘草配伍组均明显诱
导大鼠肝脏 CYP2E1 的表达与活性上升 ,并发现甘草组和甘遂甘草配伍组对CYP2E1活性的诱导作用显著高于甘遂组。结
论　甘遂可能通过诱导肝脏 CYP2E1 的表达与活性上升 ,促使其所含的前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物 ,导致
对机体的毒性作用;甘遂甘草配伍使用时 ,甘草对 CYP2E1 活性的诱导能力更强 , 故而甘草可促进甘遂所含前致癌物质和
前毒物转化成为致癌物和毒物的过程 ,并导致对机体毒性作用的增强 ,从而表现出“十八反” 中药物配伍禁忌的特征。
　　关键词:甘遂;甘草;十八反;CYP2E1
　　中图法分类号:R282.71;R285.5;R322.47 文献标识码:A
Compatible effects of euphorbia and glycyrrhiza on CYP2E1 expression and activity in
rat liver
DAI Fang-guo1 , LUO Ren1 , WANG Yu-guang2 , XIA Cheng-yun3 , TAN Hong-ling2 , XIAO Cheng-rong2 , ZHAO Yong-
hong
2 , GAO Yue2(1Department of Traditional Chinese Medicine , The South Medical University , Guangzhou 510515;2Department of Pharmaco-
logical Toxicology , Institute of Radiation Medicine , Academy of Military Medical Science , Beijing 100850;3Department of Traditional Chinese Medi-
cine , The Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College , Nanchong 637000 , China)
　　Abstract:Objective　To study the compatible effects of euphorbia and glycyrrhiza on the levels of mRNA ,
protein expression and the activity of cytochrome P450 2E1(CYP2E1)in male rat liver and explore the significance
in chinese medicine principle of “Eighteen imcompatible pairs” .Methods　The mRNA expression level of CYP2E1
was determined by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The protein expres-
sion level of CYP2E1 was detected by Western blotting.The activity of CYP2E1 was quantitated by HPLC method.
Results　The expression levels of mRNA and protein of CYP2E1 were significantly increased in co-administration
group with concomitant enhanced enzyme activity.Conclusion 　Euphorbia exerts its toxicity through inducing
CYP2E1 expression and activities in rat liver.Glycyrrhiza may enhance the toxicity of euphorbia via predominant ca-
pability in CYP2E1 activity induction when co-administrated with euphorbia.
　　Key words:euphorbia;glycyrrhiza;eighteen imcompatible pairs;CYP2E1
　　细胞色素氧化酶 P450(cytochrome P450)超家族在
肝脏的药物代谢机制和有毒化合物的生物降解过程中
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070936)
　　　　　 　Supported by the National Natural Science Foundation of China
(30070936)
　　作者简介:代方国(1974-),男 ,吉林省敦化市人 ,博士 ,讲师 ,主要从事中药
药理 、毒理方面的研究。电话:(010)66931233
　　通讯作者:高　月 ,电话:(010)66931312 , E-mail:gaoyue @nic.bmi.ac.cn
　　收稿日期:2005-02-07;修回日期:2005-04-01
发挥重要作用 ,研究表明 Cytochrome P450超家族中部
分成员酶能催化许多前致癌物质和前毒物转化为致癌
物质和有毒物 ,并对机体造成危害;细胞色素氧化酶
P450 2E1(cytochrome P450 2E1 , CYP2E1)即是这部分成
员中较重要的一种。
CYP2E1在体内负责 6大类 、70余种低分子化学
物质的代谢[ 1] ,包括苯胺 、乙醇 、丙酮 、氨基甲酸乙酯以
及亚硝胺类化合物等;其中大部分为前致癌物和前毒
物 ,小部分为临床药物。CYP2E1主要通过催化前致癌
742
第 27 卷第 8期
2005 年4 月 　　　　
第　三　军　医　大　学　学　报
ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAE　　　　
Vol.27 , No.8
Apr.2005
DOI :10.16016/j.1000-5404.2005.08.023
物去烷基 、去硝基等反应而使之转化为致癌物 。某些
药物可诱导或抑制该酶的表达及活性 ,如果这些药物
与其它药物联合用药时 ,将会对其它药物的代谢产生
影响 ,并可能由此导致不良反应的产生和药物毒性的
加重。因此 ,CYP2E1一直受到药理 、毒理和药物致癌
等研究领域的关注。
甘遂与甘草配伍是中药配伍禁忌“十八反”理论中
的重要药对 ,两种药物的药效之间为何存在冲突一直
是历代医家关注的热点。本研究试图通过检测甘遂与
甘草配伍对大鼠肝脏 CYP2E1的表达与活性的影响 ,
来进一步探讨二者配伍使用导致毒性作用增强的分子
水平机制 。
1　材料与方法
1.1　材料
　　甘遂(河北省安国市中药材市场)、甘草(北京同仁堂中药
厂)均产自河北。经本所马百平教授鉴定分别为双子叶植物药
大戟科植物甘遂 Euphorbia 的干燥根和双子叶植物药豆科植物
甘草Glycyrrhiza 的干燥根。甘遂称其质量后加入 10 倍量水 , 浸
泡 90 min 后煎煮 3次 , 每次 1 h , 提取液合并后 , 旋转蒸发 ,浓缩
药物浓度为 0.75 kg L;甘草水煎液制备同上 , 药物浓度为 1.50
kg L;甘遂 、甘草混合煎液按 1∶2称质量后混合 ,制备方法同上 ,
药物浓度为 2.25 kg L。 RNA 提取试剂盒 、逆转录聚合酶链反应
试剂盒(Promega公司);CYP2E1 及内参照亲环蛋白(cyclophilin ,
CYC)的引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成;DL 2000
DNA Marker(TaKaRa 公司);CYP2E1 , β-actin 及相关抗体(Chemi-
con 公司);蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche 公司);SD 雄性大鼠
32 只 ,购自军事医学科学院实验动物中心 , 体质量 180～ 200 g。
标准蛋白 BSA为 Pierce公司产品。
1.2　方法
1.2.1　动物分组及给药　　将动物随机分为空白组 、甘遂组
(7.5 g kg)、甘草组(15.0 g kg)及甘遂甘草合用组(22.5 g kg), 每
组 8只。空白组用生理盐水 , 其他各药物组按上述剂量连续灌
胃给药 14 d , 禁食 24 h 后脱臼处死动物 ,取微粒体 、RNA 和裂解
微粒体蛋白。
1.2.2　肝组织总 RNA 提取及 CYP2E1 mRNA 测定　　将大鼠
处死后迅速取出肝脏 , 置于液氮中保存。按 RNA 提取试剂盒
说明书提取肝脏总 RNA。测 D(260) D(280)值为 1.6～ 1.8。取
总 RNA 1μg , 加入相关试剂 ,加 CYP2E1 和 CYC 特异性引物[2] 各
5 μl , RNase-free H2O 补足反应终体积至 25 μl。扩增 20 轮循环
后。将 CYP2E1 和 CYC 等体积的 RT-PCR扩增产物 10 μl上样 ,
做琼脂糖凝胶电泳。
1.2.3　肝微粒体的制备　　将大鼠处死后打开腹腔和胸腔 ,
剪开心脏 ,用注射器吸 4 ℃生理盐水由门静脉灌洗至肝脏呈土
黄色。采用超速离心法制备微粒体[ 3] , 于-80 ℃分装保存备
用。微粒体蛋白浓度采用 Lowery 法定量 ,使用牛血清白蛋白作
为标准。
1.2.4　裂解微粒体蛋白　　取部分上述制备的微粒体沉淀用
蛋白裂解液(5%巯基乙醇 , 2%SDS , 60 mmol L Tris HCl pH 6.8 ,
10%甘油 , 0.5%去氧胆酸钠 , 1%蛋白酶抑制剂)变性溶解 ,裂解
蛋白浓度采用 Bradford 法定量 ,使用牛血清白蛋白作为标准。
1.2.5　Western blot检测 CYP2E1 蛋白表达　　裂解的蛋白于
100 ℃水浴 10 min 后 , 上样于 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电
泳 , 80 V、30 min和 100 V、90 min后 , 经200 mA , 120 min 将蛋白从
胶上转印到孔径 0.2 μmol L 的硝酸纤维素膜上。 将该膜浸于
含50 g L脱脂奶粉的 1×TBST 中室温轻摇 60 min 以封闭非特
异性结合位点。 1 ×TBST 洗 3 次 , 每次 5 min。 加入一抗
(CYP2E1 兔抗血清 , 1∶1 000;β-actin 羊抗血清为内参照 ,
1∶2 000)在室温下孵育 1 h 后 ,移去一抗 , 1×TBST洗 3 次 ,每次
5 min。加入二抗(辣根过氧化物酶标记的抗羊和抗兔 IgG ,
1∶5 000)在室温下作用 1 h , 移去二抗 , 1×TBST 浸洗 3 次。 按
Amersham Pharmacia公司手册用增敏的化学发光底物(ECL)进
行显影。
1.2.6　高效液相(HPLC)法检测 CYP2E1 酶活性　　温孵反应
体系中含肝微粒体蛋白 0.2 mg , NADPH 1.0 mmol L , 代谢底物对
硝基酚(4-Nitrophenol)0.15 mmol L , 维生素 C 1.0 mmol L , 以 0.1
mol L的Tris·HCl pH 7.4 定容至 0.5 ml。参照文献[ 4] 的方法进
行测定。用对硝基酚经 CYP2E1 代谢的特异性产物 1 , 2-二羟基
-4-硝基苯测定标准曲线。
1.3　统计学处理
　　实验数据用 x ± s表示 , 采用 SAS 软件进行单因素方差
分析。
2　结果
2.1　给药后大鼠肝脏 CYP2E1 mRNA表达水平的变化
　　RT-PCR检测结果显示 , 与对照组比较 , 甘遂组 、甘草组及
甘遂甘草合用组均明显诱导了 CYP2E1 mRNA的表达 , 其中又
以合用组最为明显(图 1)。
A:Cyclophilin;B:P450 2E1;1:Control group;2:Euphorbia
group;3:Glycyrrhiza group;4:Euphorbia + Glycyrrhi za group;
5:Marker
图 1　甘遂 、甘草单用及配伍使用对大鼠肝脏 CYP2E1 mRNA表达
水平的影响
Fig 1　Effects of administration or co-administration of euphorbia
glycyrrhiza on the CYP2E1 mRNA expression in rat liver
743第 8 期　　　　　　　　　　代方国 , 等.甘遂配伍甘草对大鼠肝脏 CYP2E1表达及活性的影响　　　　　　　　　　　　　
2.2　给药后大鼠肝脏 CYP2E1蛋白表达的变化
　　Western blot检测结果显示 , 与对照组比较 , 甘遂组和甘草
组中CYP2E1 蛋白表达有相似程度的增加 , 而甘遂甘草合用组
中增加更为明显一些(图 2)。
A:P459 2E1;B:β-actin;1:Cont rol group;2:Euphorbia group;
3:Glycyrrhiza Group;4:Euphorbia +Glycyrrhiza group;5:Marker
图 2　甘遂 、甘草单用及配伍使用对大鼠肝脏 CYP2E1蛋白表达水
平的影响
Fig 2　Effects of administration or co-administration of euphorbia
glycyrrhiza on the expression of CYP2E1 protein in rat liver
2.3　给药后大鼠肝脏 CYP2E1酶活性的变化
　　HPLC 分析结果显示 , 以 1 , 2-二羟基-4-硝基苯测定的标准
曲线为:Y=0.046 3X+0.365 2 , r=0.998 6 , 据此换算出各组
CYP2E1酶活性 , 结果分析表明 , 与对照组(0.969±0.232)比较 ,
甘遂组(1.444±0.228)、甘草组(1.721±0.337)和合用组(1.713
±0.176)中 CYP2E1酶活性显著上升(P <0.05);而甘草组和合
用组的上升又显著高于甘遂组(P<0.05)。
3　讨论
　　中药配伍禁忌歌诀“本草名言十八反 ,半蒌贝蔹及
攻乌 ,藻戟遂芫俱战草 ,诸参辛芍叛藜芦”最早见于金
元时期张子和的《儒门事亲·卷十四·十八反》 。后世医
家从各个角度对此进行了验证 , 现代病理学研究也发
现“十八反”配伍对大鼠的心 、肝 、肾功能有较明显的毒
性[ 5] 。本研究即从分子水平对“十八反”中甘遂与甘草
配伍禁忌药对的作用机制进行了探索。
　　中药甘遂中含有巨大戟萜醇及其衍生物和一些二
萜酯类化合物 ,如甘遂萜酯A 、甘遂萜酯 B等 ,这些物
质经研究表明均对机体有毒性作用;中华人民共和国
药典也将甘遂列为有毒中药。研究也表明 ,甘遂存在
激活 EB病毒早期抗原活性 、皮肤刺激及促进肿瘤发
生作用 , 并证实甘遂中含有多种前致癌物质和前毒
物[ 6] 。而中药甘草的特性是性甘 ,平和无毒 。
CYP2E1可将多种前致癌物质转化为致癌物质 ,并
导致机体增加机体罹患肿瘤的几率增加 ,故而其蛋白
表达及活性检测是药物毒理学研究中的重要指标 。本
研究通过检测表明 ,甘遂组 、甘草组和甘遂甘草配伍组
均明显诱导大鼠肝脏 CYP2E1的表达与活性上升 ,并
提示甘草组和甘遂甘草配伍组对 CYP2E1活性的诱导
作用显著高于甘遂组。基于这些实验结果 ,我们得出
两个结论:①甘遂可能通过诱导肝脏 CYP2E1的表达
与活性上升 ,促使其所含的前致癌物质和前毒物转化
成为致癌物和毒物 ,导致对机体的毒性作用;②当甘遂
甘草配伍使用时 ,因为甘草对 CYP2E1 活性的诱导能
力更强 ,故而甘草可促进甘遂所含前致癌物质和前毒
物转化成为致癌物和毒物的过程 ,并导致对机体毒性
作用的增强 ,从而表现出“十八反” 中药物配伍禁忌的
特征 。
参考文献:
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(编辑　薛国文)
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