全 文 : 本实验中,与 CON 组相比,MD-SIM 组、SD-
SIM组、HD-SIM组及CHF组 HSP22含量明显增
多,证实了 HSP22属于应激性蛋白,具有保护性作
用,其含量与心肌细胞的损伤程度成负相关,因此,
HSP22可以认为是心肌保护性细胞因子。SD-SIM
组、MD-SIM 组、HD-SIM 组 与 CHF 组 相 比,
HSP22的表达明显减少,其中 MD-SIM 组最低,说
明辛伐他汀对阿霉素造成的慢性心力衰竭受损心肌
细胞有保护作用,其机制可能为辛伐他汀具有抗氧
化损伤能力,抑制 HSP22的表达,减少氧自由基的
产生。
他汀类药物在临床作用非常广泛,不仅有降脂
作用,而且还有抑制炎症因子的生成、减轻炎性反应
和氧化应激、抑制心肌重塑、抑制心肌纤维化等作
用[10];他汀还可以改善慢性心力衰竭患者的症状和
预后,降低慢性心力衰竭患者的死亡率[11-12],提示他
汀类药物可能是治疗CHF的新途径。本研究表明
辛伐他汀对慢性心力衰竭具有较好的治疗效果,中
剂量组效果最好。对于阿霉素所致心力衰竭模型,
辛伐他汀具有抑制心室重塑、提高心功能的作用,适
当的剂量能有效提高辛伐他汀的治疗效果,其机制
可能与辛伐他汀抑制HSP22的表达、减少氧自由基
的产生有关。
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[收稿日期]2013-12-20
[基金项目]福建省战略性新兴产业技术应用基础研究项目(编号:2013J01368),福建医科大学青年骨干教师培养专项基金(编号:JGG201302)
[作者简介]柯蒙,女,硕士,主管药师,研究方向:临床药理,电话:0591-87981628,E-mail:1012899907@qq.com [通讯作者]林翠鸿,男,博
士,副主任药师,研究方向:临床药学,电话:0591-87981628,E-mail:lincuihong1974@sina.com
粗糠柴毒素对前列腺癌细胞经典 Wnt信号通路影响
柯蒙,林翠鸿 (福建医科大学附属第一医院药学部,福建 福州350005)
[摘要] 目的:探讨粗糠柴毒素(Rottlerin)对前列腺癌细胞PC-3经典 Wnt信号通路作用。方法:以不同浓度Rottlerin处理
PC-3细胞24 h,谷胱甘肽转移酶-E-钙粘蛋白(GST-E-cadherin)结合法提取胞浆游离β-连环蛋白(β-catenin),Western blot法
测定总β-连环蛋白、胞浆游离β-连环蛋白、低密度脂蛋白相关受体-6(LRP6)及磷酸化LRP6(p-LRP6)蛋白水平。结果:Rot-
tlerin可明显降低PC-3胞浆游离β-连环蛋白水平、LRP6及p-LRP6蛋白水平,并成剂量依赖性,和对照组比较,Rottlerin
0.25、0.5、1.0和2.0μmol·L
-1组胞浆游离β-连环蛋白水平分别下降54.0%,78.6%,79.7%和79.6%,LRP6表达分别下降
17.9%,38.8%,63.2%和85.0%,p-LRP6水平分别下降29.4%,67.1%,96.3%和97.4%。结论:Rottlerin可通过LRP6受体
抑制PC-3细胞经典 Wnt信号通路。
[关键词] 粗糠柴毒素;低密度脂蛋白相关受体-6;经典 Wnt信号通路
·6621· 中国医院药学杂志2014年8月第34卷第15期Chin Hosp Pharm J,Aug 2014,Vol 34,No.15
[中图分类号]R963 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)15-1266-04 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.15.07
Effects of rottlerin on Wnt/β-catenin signaling pathway in prostate cancer cel
KE Meng,LIN Cui-hong(Department of Pharmacy of the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fujian
Fuzhou 350005,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the relationship between rottlerin and Wnt/β-catenin signaling pathway in prostate
cancer cel.METHODS PC-3 cels were incubated with rottlerin at several concentrations for 24 hours.Freeβ-catenin in cyto-
plasm of PC-3 was harvested by GST-E-cadherin binding method.Western blot analysis was performed to detect the changes of
totalβ-catenin,freeβ-catenin,low-density lipoprotein receptor-related protein6(LRP6)and p-LRP6level.RESULTS Rottlerin
reduced freeβ-catenin,LRP6 and p-LRP6 level significantly,showing dose-dependent manner.Compared with the control
group,after treatment of PC-3 cels with rottlerin 0.25,0.5,1.0and 2.0μmol·L
-1,the freeβ-catenin level in cytoplasm de-
creased by 54.0%,78.6%,79.7%and 79.6%respectively,the expression of LRP6 decreased by 17.9%,38.8%,63.2%and
85.0%respectively,the level of p-LRP6 decreased by 29.4%,67.1%,96.3%and 97.4%respectively.CONCLUSION Rot-
tlerin can inhibit Wnt/β-catenin signaling pathway,which is related to LRP6.
KEY WORDS:rottlerin;low-density lipoprotein receptor-related protein 6;classic Wnt signaling pathway
粗糠柴毒素(Rottlerin)为大戟科植物粗糠柴的
提取物,其分子式为C30H28O8,分子量516.5。Rot-
tlerin具有良好的驱肠虫效果,此外尚被试用于治
疗支气管炎、脾肿大及一些皮肤、眼部疾病。PKC-δ
是蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亚型中的一
种,在许多类型细胞凋亡及细胞周期调节中发挥重
要作用[1-2]。Rottlerin是否为PKC-δ抑制剂目前存
在一些争议,近年研究发现其对前列腺癌、乳腺癌等
具有明显的抑制作用,且对肿瘤细胞转移亦有一定
抑制作用,在抗肿瘤领域有广阔开发前景[3-5]。其抗
肿瘤机制尚未完全明确,细胞凋亡及自噬可能参与
其中,对多个信号通路抑制作用亦可能相关[3,6-7]。
Wnt信号通路在肿瘤的发生发展及转移中具
有重要作用[8],目前经典 Wnt通路,即 Wnt/β-连环
蛋白(Wnt/β-catenin)通路在肿瘤中作用研究较多,
Rottlerin是否影响该通路目前未见报道,本文即对
该领域进行探索性研究。
1 材料
人前列腺癌细胞株PC-3(美国 ATCC公司);
CO2培养箱、生物洁净安全柜(美国Thermo公司);
Western Blot免疫印迹体系(美国Bio-Rad公司);
胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);
RPMI 1640培养基(美国 GIBCO公司);Rottlerin
(批号 SLBD3670V,纯度≥85%,美国 Sigma公
司);LRP6多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);磷
酸化LRP6(Ser1490)单克隆抗体(美国Cel Signa-
ling公司);β-连环蛋白单克隆抗体(美国BD公司);
Actin单克隆抗体(美国Sigma公司);谷胱甘肽转
移酶-E-钙粘蛋白质粒(美国 Addgene公司);谷胱
甘肽琼脂糖凝胶珠(美国Pharmacia公司)。
2 方法
2.1 细胞培养 PC-3细胞接种于含10%胎牛血
清、100 U·ml-1青霉素、100μg·ml
-1链霉素的1640
培养基中,置37℃、5% CO2培养箱中培养,2~3 d
换液1次。
取对数生长期PC-3细胞,按2×105/ml的密度
接种于6孔板,培养24 h后分别加入Rottlerin至
0.25,0.5,1.0,2.0μmol·L
-1,以不加药的PC-3细
胞为阴性对照组,再培养24 h,收集细胞,提取游离
β-连环蛋白并进行相关蛋白检测。
2.2 游离β-连环蛋白提取 主要参考Bafico A
等[9]报道方法,其基本原理是E-钙粘蛋白可与胞浆
中游离β-连环蛋白结合,在较高温度下,两者又可分
离。
将谷胱甘肽转移酶-E-钙粘蛋白质粒在大肠杆
菌中培养,0.1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,细菌裂
解液(含谷胱甘肽转移酶-E-钙粘蛋白)和谷胱甘肽
琼脂糖凝胶珠结合制成均匀提取混合物,用于游离
β-连环蛋白提取。细胞裂解液裂解 Rottlerin处理
后的PC-3细胞,加入谷胱甘肽转移酶-E-钙粘蛋白
提取混合物,4℃过夜,用细胞裂解缓冲液(含0.1%
SDS)与PBS缓冲液交替洗2次,加入SDS上样缓
冲液,煮沸,14 000 r·min-1离心,上清液即含提取
的胞浆游离β-连环蛋白,直接用于 Western blot检
测。
2.3 Western blot法检测β-连环蛋白、LRP6和p-
LRP6蛋白 取不同浓度Rottlerin作用24 h后的
PC-3细胞,收集各组细胞进行蛋白提取、定量(加细
·7621·中国医院药学杂志2014年8月第34卷第15期Chin Hosp Pharm J,Aug 2014,Vol 34,No.15
胞裂解液、BCA法测定蛋白质浓度),根据蛋白浓度
调整上样量,SDS-PAGE电泳,转膜(通过电转移法
将蛋白转移至PVDF膜),5%脱脂奶粉封闭1 h,加
入鼠抗人LRP6抗体 (1∶1 000)、兔抗人p-LRP6抗
体(1∶500)、鼠抗人β-连环蛋白抗体(1∶5 000)及鼠
抗人β-actin抗体(1∶5 000),4℃过夜,TBST充分
漂洗(10 min×3次),加入Ⅱ抗(1∶5 000),37℃1
h,TBST 充分漂洗(10 min×3次),化学荧光法
(ECL)显色,观察结果,并对条带进行分析,总β-
catenin蛋白、胞浆游离β-catenin蛋白、LRP6蛋白
及磷酸化LRP6蛋白条带分别与各自的Actin蛋白
条带的比值作为其蛋白表达的相对量。
3 结果
3.1 Rottlerin降低PC-3细胞胞浆游离β-连环蛋
白水平 Rottlerin对PC-3细胞总β-连环蛋白(to-
talβ-catenin)水平无明显影响,但可显著降低其胞
浆中游离β-连环蛋白(freeβ-catenin)水平,且呈剂
量相关性;和对照组比较,Rottlerin 0.25,0.5,1.0
和2.0μmol·L
-1组游离 β-连环蛋白分别下降
54.0%,78.6%,79.7%和79.6%,见图1。由于胞
浆游离β-连环蛋白水平下降是经典 Wnt信号通路
被抑制的最关键标志,这提示Rottlerin对PC-3细
胞经典 Wnt信号通路有抑制作用。
图1 Rottlerin降低PC-3细胞胞浆游离β-连环蛋白水平
Fig 1 Reduction of freeβ-catenin in PC-3 cytoplasm by rottlerin
3.2 Rottlerin降低LRP6蛋白水平及其磷酸化水
平 LRP6为 Wnt蛋白受体,Wnt蛋白和该受体结
合后将导致其磷酸化(p-LRP6),进而活化信号通
路。结果显示,Rottlerin可明显降低LRP6的蛋白
水平及其磷酸化水平,并呈剂量相关性,和对照组比
较,Rottlerin 0.25,0.5,1.0和2.0μmol·L
-1组
LRP6分别下降17.9%,38.8%,63.2%和85.0%,
p-LRP6 分 别 下 降 29.4%,67.1%,96.3% 和
97.4%,见图2。
4 讨论
经典 Wnt通路(即 Wnt/β-连环蛋白通路)中,
Wnt糖蛋白和Frizzled受体-LRP5/6受体复合物结
合,抑制细胞质内糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、轴蛋
白(Axin)和结肠腺瘤性息肉病蛋白(APC)的相互
作用,进而升高胞浆游离β-连环蛋白水平,而游离β-
图2 Rottlerin降低PC-3细胞低密度脂蛋白相关受体-6蛋白及其
磷酸化水平
Fig 2 Reduction of LRP6 and p-LRP6 of PC-3 by rottlerin
连环蛋白能够转移到细胞核内,与Lef/TCF靶基因
结合,诱导多种癌基因如c-myc和cyclinD1的转
录,该通路如异常激活,将导致大量癌基因表达,致
使肿瘤发生或进展。因此开发抑制该通路抗肿瘤药
物有重要临床意义[10]。LRP6为 Wnt蛋白关键受
体,经典 Wnt通路激活与该受体密切相关,近年研
究发现LRP6本身可能为一癌基因,参与肿瘤发生
与进展,靶向阻断该受体抗肿瘤药物亦在研发
中[11-13]。
Rottlerin对包括乳腺癌、前列腺癌等在内的多
种肿瘤具有抑制作用,但其具体机制未完全明确,目
前认为Rottlerin诱导凋亡及自噬为其抗肿瘤作用
重要机制,其中Ras/MEK/ERK和 mTOR信号通
路可能参与其中[3,14-15]。本研究显示,Rottlerin可
显著降低胞浆中游离β-连环蛋白水平,由于胞浆游
离β-连环蛋白水平升高为经典 Wnt信号通路激活
的核心事件,这提示Rottlerin可抑制经典 Wnt信
号通路;研究还发现,Rottlerin可降低LRP6及其
磷酸化水平,由于LRP6为 Wnt蛋白的关键受体之
一,提示 Rottlerin可能通过LRP6抑制 Wnt信号
通路。鉴于细胞信号通路的复杂性,多种通路之间
可能存在关联,Rottlerin抑制 Wnt信号通路和其他
信号通路如Ras/MEK/ERK及mTOR相关性有待
进一步研究。
总之,本研究首次报道 Rottlerin可阻断经典
Wnt信号通路,且该作用可能和LRP6受体被抑制
有关。今后将进一步深入探讨Rottlerin引起LRP6
水平变化机制,包括其对 LRP6 mRNA 水平及
LRP6降解影响,以及Rottlerin对 Wnt信号通路靶
基因如c-myc和cyclinD1影响研究。
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[收稿日期]2013-11-20
[基金项目]河北省自然科学基金(编号:C2008000655);河北省教育厅资助项目(编号:2010104) [作者简介]赵春颖,女,硕士,副研究员,研
究方向:中药新药研究与开发,E-mail:zhchy-50@sohu.com,zhaochunying1908@163.com,电话:0314-2291908
赤雹不同药用部位最佳采收期的考察
赵春颖,苗光新,毛晓霞,佟继铭 (承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室,河北 承德067000)
[摘要] 目的:确定赤雹果实和块根的最佳采收期。方法:2009年5月开始用种子种植赤雹,从2009—2011年3年内,每年
在赤雹的生长季节内,从8月15日—10月15日,每15天采收一次赤雹果实和块根,以不同采收时期和年限的赤雹果实和块
根药材的外观形态、单株鲜重和干重以及原儿茶醛和原儿茶酸含量为指标,采用高效液相色谱法测定赤雹块根和果实中原儿
茶醛和原儿茶酸的含量。色谱条件为:Discovery C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-5%磷酸水溶液梯度洗脱(0
~40 min,甲醇:20%~100%),紫外检测波长280 nm,流速为1 ml·min-1。结果:赤雹果实采收的时间为每年8月下旬到9
月下旬,选择饱满,个体较大,颜色鲜艳,成熟度高的果实随熟随采,此时果实中的原儿茶醛和原儿茶酸含量较高。不同生长
年限的果实中,原儿茶醛和原儿茶酸含量没有显著性差异;但一年生和两年生、三年生比较单株鲜重和干重有显著性差异,两
年生和三年生比较单株鲜重和干重没有显著性差异。赤雹块根采收期为9月中旬到10月上旬,此时块根单株产量较大,原儿
茶醛和原儿茶酸含量较高;不同生长年限比较,二、三年生单株鲜重和干重与一年生单株鲜重和干重比较有显著性差异,因此
确定赤雹块根采收期为第二、三年生的9月中旬到10月上旬。结论:赤雹果实最佳采收期为每年8月下旬到9月下旬,果实
随熟随采;赤雹块根最佳采收期为二、三年生的9月下旬到10月上旬。
[关键词] 赤雹;果实;块根;采收期
[中图分类号]R927.2 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)15-1269-05 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.15.08
Study on optimal harvesting time in the different medicinal parts of Thladiantha dubia Bunge
ZHAO Chun-ying,MIAO Guang-xin,MAO Xiao-xia,TONG Ji-ming(Institute of Chinese Mateia Medica,Chengde
Medical Colege/Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine,Hebei Chengde 067000,
China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To determine the optimal harvesting time ful of Thladiantha dubia Bunge fruits and tuberous roots
of medicine.METHODS Seeds of Thladiantha dubia Bunge were planted in2009 May;in the three years from2009-2011,ev-
ery year in the growth season of Thladiantha dubiafrom August 15th to October 15th,every 15 days Thladiantha dubia Bunge
fruits and tuberous roots were harvested once.The fruit and roots medicine appearance in the different growth seasons and
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