全 文 ：粗糠柴毒素对 SD大鼠抗心肌缺血-再灌注损伤的作用
李鸿博 郎小娥1 (北京协和医学院，北京 100005)
〔摘 要〕 目的 研究粗糠柴毒素对抗心肌缺血-再灌注损伤的作用。方法 结扎雄性 SD大鼠心脏冠状动脉左前降支 40 min造成心肌缺血，
剪断结扎线进行 120 min再灌注，以此构建心肌缺血-再灌注模型。实验组大鼠缺血处理前给予 1 μmol /L粗糠柴毒素处理，对照组予生理盐水处理。
抽取血液检测血清乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶(CK-MB)活性。随后取出心脏并取样，将细胞裂解并离心，对提取物进行 Western 印迹测定，其中
乙醛脱氢酶(ALDH)2 磷酸化比例。结果 实验组 LDH 活性(4 079. 6±88. 3)U /L，对照组(5 703. 7±451. 9)U /L。实验组 CK-MB 活性(3 228. 5 ±
257. 4)U /L，对照组(4 433. 4±319. 9)U /L。实验组磷酸化 ALDH2 占总 ALDH2 比例(0. 340±0. 032) ，对照组(0. 101±0. 037)。两组各指标均存在显
著差异(均 P＜0. 05)。结论 粗糠柴毒素可显著提升缺血-再灌注心肌的 ALDH2 磷酸化水平并降低血清 LDH 和 CK-MB 水平，诱导心脏保护。AL-
DH2 激活可能参与了粗糠柴毒素的心脏保护作用。
〔关键词〕 粗糠柴毒素;乙醛脱氢酶 2;心脏保护;蛋白激酶 Cδ
〔中图分类号〕 Ｒ54 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2014)10-2811-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 10. 093
1 山西医科大学第一医院
通讯作者:郎小娥(1964-) ，女，副主任医师，主要从事冠心病基础与临
床研究。
第一作者:李鸿博(1993-) ，男，在读博士，主要从事基础医学研究。
及时开通梗死相关动脉恢复心肌血流灌注，挽救濒死心肌
是治疗急性心肌梗死最有效最关键的措施。然而缺血心肌的
再灌注(I /Ｒ)可引起心肌 I /Ｒ 损伤(MIＲI)。随着心脏外科手
术和介入治疗技术的进展以及心肌缺血病人的增加，MIＲI 已
成为临床上常见的一种病理生理过程。随着研究的深入，缺血
预处理、麻醉预处理等一系列心肌保护措施已被发现〔1 ～ 3〕，且
已被证明可以有效地对抗 MIＲI。心脏保护的机制较为复杂，
其中乙醛脱氢酶 2(ALDH2)的磷酸化与激活被证明在心脏保
护中起关键介导作用〔4〕。另外，有研究发现在再灌注初期蛋白
激酶 Cδ(PKCδ)活化可通过调控线粒体介导细胞的凋亡和坏
死，抑制 PKCδ则会减轻 I /Ｒ的各项损伤指标〔5〕。粗糠柴毒素
是从植物粗糠柴中提取出的一种小分子物质〔6〕。Gschwendt
等〔7〕首次报道粗糠柴毒素是一种 PKCδ 的选择性抑制剂后，大
量实验研究以施用粗糠柴毒素作为抑制 PKCδ 活性的药理学
手段。另一方面，关于粗糠柴毒素的潜在药物用途的研究也有
报道，但就其对抗 MIＲI 的效果却研究较少。本研究通过构建
大鼠在体心肌 I /Ｒ模型并观察粗糠柴毒素的处理效果来阐明
粗糠柴毒素的心脏保护作用。
1 材料和方法
1. 1 实验动物 选取雄性 SD大鼠，体重 200 ～ 220 g。由清华
大学实验动物中心提供。安置于无特殊病原体、温度(23℃ ±
3℃)和湿度(60% ±5%)的控制室内，光暗周期为 12 h:12 h(光
照早上 8 点开始)。饮用水和标准饲料均经灭菌后供动物自由
取用。
1. 2 急性心肌 I /Ｒ模型制备 给予实验 SD 雄性大鼠腹腔注
射戊巴比妥钠(30 mg /kg)麻醉，气管切开术后，大鼠肺组织进
行机械正压通气，使用 30% ～40%的空气 /氧气混合物，通过调
整呼吸频率和潮气量，在整个实验中维持动脉血气 pH 值在生
理范围内。心肌梗死是由结扎冠状动脉左前降支(LAD)引起。
在大鼠胸骨左缘第 4 或第 5 肋间隙开胸，实施胸廓切开术及心
包切开术后，暴露心脏，在距 LAD 基部 2 ～ 3 mm 处用 6 ～ 0 无
创伤性丝线进行结扎，通过结扎 LAD 造成心肌梗死即可建立
大鼠急性心肌缺血模型。剪断结扎线心肌复灌。对所有大鼠
进行区域性心肌缺血 40 min，之后进行 120 min再灌注处理〔8〕。
将大鼠随机分为两组，各 8 只:实验组在缺血处理前 5 min给予
1 μmol /L粗糠柴毒素处理，对照组以生理盐水处理。
1. 3 血清乳酸脱氢酶(LDH)活性和肌酸激酶同工酶(CK-MB)
活性的测定 再灌注 5 min后，从各实验组大鼠采集 5 ml静脉
血样本，使用台式离心机以 5 000 r /min离心 5 min，血清保存于
液氮中。样品解冻后进行分析测定。使用 7 600 全自动生化分
析仪及商用试剂盒 Creatine Kinase-MB Liquid Ｒeagent 和 Cyto-
toxicity Detection Kit (LDH)测定 LDH 和 CK-MB 的活性，作为
评价心肌损伤的指标。
1. 4 Western 印迹测定心肌组织 phos-ALDH2 和 Total-ALDH2
蛋白的表达 取血后，迅速剪下各组大鼠的心脏，每只大鼠取
相同部位的左心室前壁心肌组织 0. 2 g，用生理盐水冲洗，剪碎
心肌组织后加入 2 ml ＲIPA裂解液(1 ml ＲIPA+10 μl PMSF)至
玻璃匀浆器中，冰浴下进行机械匀浆，匀浆液在冰上静置
30 min直至充分裂解后，以 12 000 r /min 4℃离心 30 min，取上
清，用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白质浓度。用 ＲIPA 裂解液
均衡每一样品中的蛋白液浓度，保证每个样品孔蛋白上样量一
致，加入 5×loading buffer后，于 100℃煮沸变性 5 min，分装蛋白
上样液并于－70℃储存。取 50 μg蛋白上样进行十二烷基硫酸
钠-聚丙烯酸胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳分离蛋白后，将目
标蛋白带转移至聚偏氯乙烯(PVDF)膜上，将印迹后的 PVDF
膜放入盛有封膜液的平皿中室温孵育封闭 2 h。用抗体稀释液
按 1 ∶1 000 分别稀释兔抗大鼠 ALDH2 抗体和兔抗大鼠 Phos-
ALDH2 抗体，按 1 ∶500 稀释抗大鼠 β-actin 抗体，将 PVDF 膜蛋
白面朝下放于抗体液面上，4℃孵育过夜。用 Tris 盐酸缓冲液
(TBST)洗涤 PVDF 膜 3 次，5 min /次。然后将膜用 TBST(1 ∶
2 000)稀释的 HＲP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗室温下孵育 2 h
·1182·李鸿博等 粗糠柴毒素对 SD大鼠抗心肌缺血-再灌注损伤的作用 第 10 期
后，用 TBST 室温下洗膜 3 次，10 min /次。增强化学发光法
(ECL)显色。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分
析目标带的分子量和净光密度值等记录相应的表达量，得出磷
酸化 ALDH2 占总 ALDH2 的比例。
1. 5 统计学分析 采用 SPSS15. 0 软件进行 t检验。
2 结 果
粗糠柴毒素处理显著抑制大鼠 MIＲI所导致的血清 CK-MB
和 LDH升高。另外，粗糠柴毒素处理使 I /Ｒ 心肌细胞 ALDH2
磷酸化水平显著增加，这提示粗糠柴毒素可能通过激活 AL-
DH2 来诱导心脏保护。各组 LDH、CK-MB活性及 ALDH2 磷酸
化比例见表 1。典型的 Western 印迹条带，见图 1。
表 1 两组 LDH、CK-MB活性与 phos-ALDH2 /Total-
ALDH2 比值比较(x±s，n=8)
项目 LDH (U /L) CK-MB (U /L) phos-ALDH2 /Total-ALDH2
对照组 5 703. 7±451. 9 4 433. 4±319. 9 0. 101±0. 037
实验组 4 079. 6±88. 3 3 228. 5±257. 4 0. 340±0. 032
P值 ＜0. 05 ＜0. 05 ＜0. 05
图 1 Western 印迹结果
3 讨 论
自从 1994 年粗糠柴毒素被首次报道以来，关于粗糠柴毒
素药理作用的研究一直在进行〔7〕。目前已发现的作用包括抗
过敏、诱导肿瘤干细胞自噬及凋亡以及抑制肿瘤细胞转移
等〔8 ～ 11〕。也有文献报道〔6〕粗糠柴毒素有希望作为新的肿瘤化
疗药物。
关于粗糠柴毒素的作用机制至今尚存在争议。最初认为
粗糠柴毒素是一种选择性的 PKCδ 抑制剂〔7〕，并用于大量对
PKCδ生物学功能的研究中〔6〕。然而，随后有证据表明在很多
条件下粗糠柴毒素对 PKCδ活性并无直接影响，而且特异性不
强，对蛋白激酶家族的多个成员如 PKB、PＲAK 等均具有抑制
作用〔12〕。也有研究表明在 PKCδ敲除的大鼠中，粗糠柴毒素还
可表现其抑制蛋白磷酸化的作用〔13〕。目前一般认为粗糠柴毒
素的作用机制复杂，存在 PKCδ 依赖和非 PKCδ 依赖两类途
径〔6〕。粗糠柴毒素的线粒体氧化磷酸化解耦联作用已被证明
不依赖于 PKCδ，其下游事件可能是粗糠柴毒素多种生物学功
能的真正机制〔14〕。
粗糠柴毒素与细胞凋亡的关系也较为复杂。研究证实粗
糠柴毒素有促凋亡与抑制凋亡的双重作用，且可能为 PKCδ 依
赖或非 PKCδ依赖性〔14〕。已有研究〔10〕表明粗糠柴毒素具有胰
腺肿瘤干细胞凋亡的作用，而本研究中粗糠柴毒素表现为抑制
I /Ｒ心肌细胞的凋亡及物质释放。ALDH2 作为一种醛类代谢
的关键酶，在清除缺氧条件下产生的毒性醛类起关键作用，其
磷酸化参与了多种药物预处理方式如乙醇预处理〔5〕、麻醉预处
理〔15〕等诱导的心脏保护。本实验提示了无论粗糠柴毒素在对
抗 MIＲI方面的机制如何，这一物质最终能够激活 ALDH2 保护
通路，减轻 I /Ｒ引起的心肌细胞死亡。虽然粗糠柴毒素尚未被
批准药用〔16〕，且其作用机制有待于进一步阐明，然而本研究提
示了一种新的药物预处理方式，对 MIＲI 的机制研究提供了新
的途径。
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·2182· 中国老年学杂志 2014 年 5 月第 34 卷
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〔2012-06-13 收稿 2012-10-10 修回〕
(编辑 袁左鸣)
二甲双胍对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠空间认知、学习记忆及
脑能量代谢的影响
莫 巍 钱国锋1 (台州市中西医结合医院泽国院区内科，浙江 台州 317500)
〔摘 要〕 目的 探讨二甲双胍(Met)对高脂诱导胰岛素抵抗(IＲ)大鼠空间认知、学习记忆及脑能量代谢的影响。方法 采用高脂饮食喂养
法制备 IＲ大鼠模型，将 60 只 SPF级雄性 Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、Met低剂量组和 Met高剂量组(n=15)。除对照组给予普通饲料外，其
余 3 组均给予高脂饲料 12 w。在 IＲ诱导成功后，仅 Met低、高剂量组分别给予 100 mg·kg－1·d－1和 200 mg·kg－1·d－1 Met连续灌胃 4 w，其余两组
均给予同等体积的蒸馏水。分析 4 组的外周胰岛素敏感性参数(体重、内脏脂肪、血浆总胆固醇、血糖、血浆胰岛素和 HOMA指数) ;采用 Morris水迷
宫实验检测空间认知功能;Y型电迷宫法检测学习和记忆行为;检测试剂盒检测脑组织中乳酸水平及 Na+-K+-ATPase 活性。结果 相比对照组，模
型组的血浆总胆固醇、胰岛素、HOMA指数及脑部乳酸升高，登台潜伏期延长，学习次数增多，站台所在象限停留时间、记忆次数及脑部 Na+-K+-AT-
Pase活性减少(P＜0. 05) ;Met处理可改善高脂饮食诱导 IＲ引起的以上异常指标，且高剂量 Met的效果强于低剂量，除 Met高剂量组的血浆胰岛素和
HOMA指数外，其余仍与对照组有差异(P＜0. 05)。结论 高脂饮食导致 IＲ可影响空间认知、学习记忆功能及脑能量代谢，Met 可改善以上功能，对
IＲ具有保护作用。
〔关键词〕 二甲双胍;胰岛素抵抗;空间认知;学习记忆;脑能量代谢
〔中图分类号〕 Ｒ587 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202(2014)10-2813-03;doi:10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 10. 094
1 浙江大学医学院附属第一医院内分泌科
第一作者:莫 巍(1976-) ，女，主治医师，主要从事内分泌疾病诊治
研究。
2 型糖尿病(T2DM)早期常伴有胰岛素抵抗(IＲ)〔1〕，长期
进食高脂饮食可诱发 IＲ〔2〕。此外，Pratchayasakul 等〔3〕指出高
脂饮食不仅可诱导外周胰岛素抵抗，还可损伤中枢胰岛素受体
功能，由于该受体在中枢分布较广，因此，高脂饮食在一定程度
上对脑部功能有影响。多项研究指出长期食用高脂饮食可影
响空间认知，并造成海马依赖的学习记忆功能受损〔4〕。二甲双
胍(Met)是治疗 T2DM的首选药物，可迅速穿越血脑屏障，在脑
部发挥消炎和保护作用，也可改善 IＲ〔5，6〕。但目前对其能否改
善高脂饮食诱导的 IＲ 的空间认知、学习记忆及脑能量代谢尚
不清楚，故本研究对此进行相关研究。
1 材料与方法
1. 1 实验动物及分组 选取 180 ～ 200 g SPF级雄性 Wistar大
鼠 60 只(购于北京维通利华公司) ，采用喂养高脂饮食的方法
制备 IＲ大鼠模型，将大鼠随机分为对照组、模型组、Met低剂量
组和 Met高剂量组(n = 15)。所有大鼠均采用普通饲料(碳水
化合物 60%，蛋白质 22%，脂肪 10%，其他 8%)适应性喂养
1 w，然后对照组继续给予普通饲料，其余 3 组更换为高脂饲料
(碳水化合物 30%，蛋白质 12%，脂肪 52%，其他 6%) ，连续喂
养 12 w。在 IＲ 诱导成功后，仅 Met 低、高剂量组分别给予
100 mg·kg－1·d－1和 200 mg·kg－1·d－1 Met 连续灌胃 4 w，其
余两组分别给予同等体积的蒸馏水。所有大鼠均于 12 h /12 h
明暗周期下饲养，湿度 60% ～70%，可自由获取饮水、饮食。
1. 2 血浆指标检测 采用血糖仪检测血糖水平，生物化学分
析仪检测血浆总胆固醇水平，采用酶标仪及 ELISA试剂盒检测
血浆胰岛素水平，同时采用稳态模型评估(HOMA)外周胰岛素
抵抗情况。
1. 3 Morris 水迷宫实验〔4〕 水迷宫为一圆形水池(直径
130 cm、高 50 cm) ，共分四个象限，并在第一象限放置圆形平台
(直径 9 cm、高 29 cm)。采用带有显示系统的摄像机同步记录
游泳轨迹。在迷宫外设置固定参照物，进行为期 6 d的实验:第
1天让大鼠自由游泳适应环境;从第 2 天起，每天分别从四个象
限的入水点训练，观察并记录大鼠从入水至登上水下隐蔽平台
的时间(逃避潜伏期)、游泳速度及在站台所在象限停留的
时间。
1. 4 学习记忆功能检测 采用 Y型电迷宫法检测学习和记忆
功能。检测前 1 w将大鼠放入 Y 型电迷宫，待其适应环境，在
电击区给予大鼠足部 70 mV的电击，其会向 3 等分辐射式反射
箱逃避，由电击区逃至无电区为正确反应。记录每组的学习成
绩(连续 10 次中有 9 次正确反应所需要的电击次数)和记忆成
绩(连续 10 次测试中的正确反应次数)。
1. 5 脑部能量代谢水平检测 检测脑部的乳酸含量和 Na+-
K+-ATPase的活性来评价能量代谢:将脑组织加入 4℃的生理
盐水碾磨，制成 10%组织匀浆，将匀浆分为两份，将其中一份的
上清液高速离心 12 000 r /min×20 min，保留沉淀成分(线粒体)
并制成混悬液，超声波粉碎法破碎，并按照试剂盒说明检测
·3182·莫 巍等 二甲双胍对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠空间认知、学习记忆及脑能量代谢的影响 第 10 期