全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2006, 26( 12): 50~ 55
珍稀濒危树种毛红椿微卫星 DNA分离及
SSR反应体系优化*
刘 军 1 孙宗修 2 陈益泰 1** 何贵平 1 吴天林 1
( 1中国林业科学院亚热带林业研究所 富阳 311400 2中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室 杭州 310006 )
摘要 以江西宜丰种源毛红椿为材料, 成功提取其基因组 DNA。利用改良的链亲和素磁珠法亲
和捕捉出毛红椿基因组微卫星 DNA片段,并构建了富含微卫星的基因组文库。从构建的基因组
文库中随机挑选了 63个单克隆进行测序,其中 50个单克隆成功测序, 含有微卫星的单克隆有 18
个,并根据测序结果设计并合成 SSR引物 18对。利用所合成的引物优化 SSR反应体系,对影响
SSR反应的各个因子进行了探讨。确定了模板 DNA最适浓度为 30ng; dNTP的最适浓度为 0.
3mmol /L; 0. 3Lmol /L是引物在反应体系中的最合适浓度。建立了重复性好、稳定性好的 SSR反
应体系,为下一步进行毛红椿群体遗传结构和遗传变异研究提供了技术支持。
关键词 毛红椿 微卫星 链亲和素磁珠 SSR反应体系
中图分类号 Q819
收稿日期: 2006-07-28 修回日期: 2006-10-24
* 浙江省科技重点项目 ( 011102198)
** 通讯作者,电子信箱: ytc. yalin@ yahoo. com. cn
毛红椿 [Toona cilia ta var. pubescens ( F ranch. )
Hand. ]是楝科香椿属植物,零星分布于江西、湖南、湖
北、四川、广东、贵州和云南等地 [1]。毛红椿为落叶大乔
木,生长迅速,树干通直,素有 /中国桃花木0之称,材质曙
红,木纹美丽,是珍贵的用材树种,具有很高的经济价值
和开发前景。由于环境变化、人为砍伐以及其天然更新
比较慢,数量不断减少。在《中国植物红皮书》中,毛红椿
被列为国家二级保护濒危种,毛红椿也被各分布省列为
珍惜濒危树种 [2, 3 ]。目前毛红椿人工林的用种主要采自
数量较少的天然林和人工林,所以进行系统的良种选育
和分子生物学研究,扩大毛红椿的种植面积并研究其濒
危原因,进而采取积极有效的保护措施是非常必要的。
微卫星 DNA又称简单重复序列 ( sing le sequence
repea,t SSR),是由 1~ 6个核苷酸组成的重复单元以首
尾相接的方式重复出现多次而形成的一段 DNA序列,
广泛分布于所有原核生物和真核生物基因组中 [4]。
SSR标记是一种基于 DNA长度多态性的分子标记技
术,它具有共显性、高度可重复性、高度丰富的多态性
等优点,是构建遗传连锁图谱、研究群体遗传学、进行
分子标记辅助育种和系谱分析的理想工具 [ 5, 6 ]。微卫
星最大的缺点是对首次研究的物种要从中分离微卫星
DNA,这主要是因为微卫星通常存在于基因组的非编
码区。传统的微卫星 DNA分离方法是先建立基因组
文库,再用含微卫星的探针与之杂交筛选文库,可以说
是一种费时费力的工作。应用这种传统方法分离微卫
星 DNA所得到的阳性克隆 (含微卫星 DNA)的数量只
有全部克隆的 0. 04% ~ 12% [4 ]。近几年来,一些新的
微卫星 DNA分离方法相继出现,解决了传统方法所遇
到的困难, 提高了微卫星分离效率 [7]。本研究主要目
的: ( 1)用改良的链亲和素磁珠法首次分离毛红椿基因
组微卫星 DNA并测序; ( 2)根据所分离的微卫星 DNA
序列设计、合成 SSR引物; ( 3)利用所合成的引物优化
SSR反应体系,建立重复性好、稳定性好的 SSR反应体
系,为下一步进行毛红椿群体遗传结构和遗传变异研
究提供了技术支持。
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 植物材料 2004年 11月采集江西宜丰种源天
DOI：10.13523/j.cb.20061210
2006, 26( 12) 刘 军 等:珍稀濒危树种毛红椿微卫星 DNA分离及 SSR反应体系优化
然林种子, 2005年 3月, 在浙江省富阳市新登苗圃
(N30b03cE119b57c)播种。 7月份采集毛红椿幼苗幼
嫩叶片用塑料袋密封, 用冰袋保鲜, 迅速带回实验室
后,保存到 - 70e 低温冰箱。
1. 1. 2 微卫星分离材料 链亲和素磁珠 ( Promega)一
管 (约 600L l);磁力架 ( Promega)一个;生物素标记探针
( Sangon): 5c-生物素 (AG) 10;接头Ⅰ序列为 O ligoA: 5c-
ATGACCATGATTACGCCAG-3, Oligo B: 5c-GATCCTGG
CGTACTCATGGTCAT3c;接头Ⅱ序列为 O ligo C: 5cTAC
TGGTACTAATGCGGT3c, OligoD: 5cAGCTTACCGCATTA
GTACCAGTA3c; 限制性核酸内切酶 Hind III、BamH I
( TaKaRa);大肠杆菌菌株 DH5A等。
1. 1. 3 SSR反应体系优化所用材料 Taq酶和 dNTP
( TaKaRa)、琼脂糖 ( Sangon)等。
1. 2 方 法
1. 2. 1 微卫星 DNA的分离 ( 1 )基因组 DNA的提
取、纯化以及限制性内切酶酶切 用改良的 CTAB
法 [9, 10 ]提取基因组 DNA。根据王彩虹方法纯化基因组
DNA,用 HindIII和 BamH I两种限制性内切酶对纯化
的基因组 DNA进行复合酶切。 ( 2 )接头与酶切片段的
连接 OligoA和 O ligoB、OligoC和 O ligoD分别等摩尔
混合, 95e 变性 5m in, 65e 杂交 10m in合成接头Ⅰ和
Ⅱ。酶切产物 70e 水浴 15m in灭活限制性内切酶, 再
与接头Ⅰ和Ⅱ接。 ( 3)连接产物的扩增 以连接产物
为模板,以 O ligo A和 O ligo D为引物在 PE9600型 PCR
基因扩增仪扩增,反应程序:先 94e 预变性 4m in,然后
进行 35个循环 ( 94e 变性 1m in, 55e 退火 0. 5m in, 72e
延伸 1m in),最后 72e 延伸 10m in。 ( 4)链亲和素磁珠
亲和捕捉微卫星 DNA 向 50L l扩增物中加入 10L l
50pmol /L生物素标记的探针 [生物素 -( AG) 10 ]、3L l 20
@SSC和 37L l ddH 2O,混匀后 95e 变性 10m in, 65e 杂
交 1h。取出 4e 保存的链亲和素磁珠,倒置数次, 使磁
珠充分悬浮。用磁力架吸附磁珠,吸出磁珠保存液。
用 0. 5 @SSC洗磁珠 3次,每次 200L ,l把杂交产物加入
含磁珠的管中,轻弹混匀。室温放置 1h, 中间轻轻摇
动。磁力架吸附,去除清液,用 0. 1 @SSC洗磁珠 2次,
每次 200L ,l再用 200L l 0. 06 @SSC洗磁珠 1次,加入
100L l ddH2O, 溶解含微卫星 DNA单链片段。 40ng左
右的微卫星 DNA单链为模板, 以 O ligoA和 Oligo D为
引物扩增出微卫星 DNA双链片段。扩增程序同 ( 5 )。
( 5)微卫星 DNA片段与 T-载体的连接并转化感受态大
肠杆菌 将上述 PCR扩增产物直接与 pGEM-T载体连
接,连接后转化感受态大肠杆菌 DH 5A,涂到含氨苄霉
素的 LB培养基平板上培养。 37e 过夜培养,挑取单克
隆接种到含氨苄霉素的 LB液体培养基中, 180r /m in摇
10h,取 0. 5m l菌液送公司 (联合基因 )测序。 ( 6) SSR
引物设计与合成 根据测序结果,利用 primer prim ier 5
软件设计引物,设计结果送交公司 ( Sangon)合成。
1. 2. 2 SSR反应体系的优化 SSR反应体系的建立以
枫香 PCR扩增程序为基础 [8 ],以江西宜丰种源毛红椿
为材料,利用合成的 SSR引物 S22( Sangon)进行 PCR
扩增反应 (引物序列见表 1)。试验中采用 15L l反应体
系, 成分: 10 @ buffer 1. 5L ,l Taq酶 ( 2U /L l) 013L ,l
dNTP( 2. 5 mmol /L),引物 ( 10 mmol /L), DNA模板 15
~ 60ng。用 PE9600型 PCR基因扩增仪扩增, 反应程
序:先 94e预变性 4m in,然后进行 35个循环 ( 94e变性
1m in, 55e 退火 0. 5m in, 72e 延伸 1m in), 最后 72e 延
伸 10m in,取出用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果通过
凝胶成像分析系统记录。扩增结果为有条带扩出以及
谱带清晰度, 对 dNTP浓度、引物浓度、DNA模板用量
等方面进行优化, 研究各成分不同浓度对扩增效果的
影响,确定合适的 PCR扩增体系。
( 1)不同 DNA模板浓度对 PCR结果的影响 本研
究中,设置 DNA模板浓度梯度,研究不同 DNA模板浓
度对 PCR结果的影响。 DNA模板浓度设置为 15、30、
45、60ng。
( 2)不同 dNTP浓度对 PCR结果的影响 dNTP浓
度对 PCR扩增出的谱带亮度有一定的影响。试验中把
dNTP浓度设置为 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol /L 4个浓度
梯度。
( 3)不同引物浓度对 PCR结果的影响 为保证能
扩增出一定亮度的谱带,并节约引物用量,试验中设置
了 0. 1、0. 3、0. 5和 0. 7Lmol /L 4个浓度梯度,确定引物
合适的最低用量。
( 4)利用优化的反应体系进行扩增反应 利用建
立的 SSR反应体系和扩增程序,用 9对引物对毛红椿
基因组 DNA进行扩增。
2 结果与分析
2. 1 微卫星 DNA的分离
2. 1. 1 基因组 DNA的提取、纯化以及限制性内切酶酶
切 本研究所用的改良的 CTAB法是在 CTAB法基础
上加以改进后形成的,主要是在缓冲液中加入 2% PVP
和 2% B-巯基乙醇。从试验结果可以看出, 改良的
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 26No. 12 2006
CTAB法能有效地去除酚类化合物、多糖和蛋白质, 提
取的 DNA质量较高 (A260 /A280达 1. 85)。经纯化后
的 DNA,完全可以满足限制性内切酶酶切要求 (图 1)。
用 HindIII和 BamH I两种限制性内切酶对纯化的基因
组 DNA进行复合酶切,酶切结果见图 2。
图 1 毛红椿基因组 DNA
M: DNA标准 ( DL2000); 1, 2:样品
F ig. 1 G enom ic DNA ofToona c ilia ta var. pub escen s
图 2 基因组 DNA限制性内切酶酶切
M: DNA标准 ( DL2000); 1, 2:样品
F ig. 2 D igestion of genom ic DNA
w ith r estr ic tion en zym e
2. 1. 2 接头与酶切片段的连接和连接产物的扩增
接头与酶切片段连接后,为验证连接效果,利用 OligoA
和 O ligoD为引物进行扩增,扩增结果见图 3。从图 3可
以明显看出,扩增片段集中在 100~ 500bp范围,说明接
头与酶切片段连接上。
2. 1. 3 链亲和素磁珠亲和捕捉微卫星 DNA 通过杂
交、吸附、洗脱和溶解等一系列步骤, 得到含有微卫星
图 3 连接产物的 PCR扩增
M: DNA标准 ( DL2000 ); 1, 2:样品
F ig. 3 Amp lica tion of liga tion p rod uction
序列的单链微卫星 DNA片段,然后以 O ligoA和 O ligoD
为引物进行扩增获得双链微卫星 DNA片段 (图 4)。从
图 4可以看出, 亲和捕捉微卫星 DNA片段也主要集中
在 100~ 500bp范围,与连接产物扩增结果基本相符。
图 4 亲和捕捉微卫星 DNA的扩增
M: DNA标准 (DL2000 ); 1:样品
F ig. 4 Amp lica tion ofm icrosa te llite
DNA cap tur ed w ith b ead s
2. 1. 4 微卫星 DNA片段与 T-载体的连接并转化感受
态大肠杆菌 将含微卫星 DNA片段 PCR扩增产物直
接与 T-载体连接后转化感受态大肠杆菌, 平板培养。
白色菌斑为阳性克隆, 挑取 63个阳性克隆摇菌后
测序。
2. 1. 5 SSR引物设计与合成 50个阳性克隆成功测
序,利用 SSRhunter搜索含重复序列的片段,结果显示
有 18条含有重复序列。 18条序列利用 primer prim ier 5
软件设计引物,并送 Sangon公司合成 (表 1)。
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表 1 毛红椿基因组 18个微卫星位点的 PCR扩增引物
T ab le1 P r im er s for amp lifyin g 11 SSR loc i in Toona cilia ta va r. pub escen s
引物 primer 正向引物 5c-----------3c 反向引物 5c-----------3c Tm( e )
S5 GTGGCGTAACAGACCAAAAC CCAGAGATACTCCATTCCAG 60
S9 CACTTAGCCTGTAGCACTAG CTTCACCAAACTCATCTCTC 58
S11 AGTAATAGCCTGTAGAGCAG AGAGTGGGGTGGTCGATGAG 58
S22 GAAACCAGCAGGCAGAGC GAAGAAGGGTGAGCGAGA 58
S36 CCTGAGATTCGTCCAAGT ACCGCATTAGTACCAGTAG 54
S362 GATTACGCCAGGCAAACG TTGAATATGGGAGAAGGT 56
S38 ATTAGCTTACCGCATTAG CAAGGAGGCACTTGTTTT 50
S39 GGCGACTAATGAGTGAGA AGAACGCAGCGAACTACA 54
S42 GTGTTAGCCGACGAAGAA CATCAATTACAGTTGGTGGTA 54
S422 ATGGATGAGTGTGCGATAGG TGTGATGTAGGAGTCTGAAC 60
S50 AAGCCAGTCAGCAACCTA GATTAAGTAATATTGGGTGGT 54
S52 TGTCTCAGTTTATGCTGGCGT CTGCCCAATCAACAAGAG 53
S54 AACGGCTCAAATTCTATA CATTAGTACCAGTATCCA 48
S56 TTAGTACCAGCAGCTTACC AAGCCTGTCCACTTTCTC 56
S60 TCGACGATTATGACCATG TGCAGTCTCCCTACTCAA 52
S61 GCTTAGCTTACCGCATTAGT ATTACGCCAGGACTTTTCAC 58
S62 GGTGGACTTAGCAGGTAG ATCTCAGAGGAAAGGGAC 56
S63 CATCGGGAGGTTTAGGTC GTGTTCATGGGAGTAGGG 56
2. 2 SSR反应体系的优化
2. 2. 1 不同浓度 DNA模板对 PCR扩增效果的影响
为最大限度地节约 DNA模板,试验中在 15L l体系中加
入不同浓度的 DNA,以探讨合适的 DNA浓度。从图 6
可以看出,反应体系中 DNA的量为 15ng时,所扩增出
的条带不清晰,但当 DNA量提高到 30ng时,条带相对
清晰,适合进行 SSR扩增反应进行群体分析。
2. 2. 2 不同 dNTP浓度对 PCR扩增效果的影响
dNTP浓度对 PCR所扩增出条带的亮度有很大关系。
从图 6的电泳分析结果可以得出, 随 dNTP浓度的增
加,条带的亮度增加。在最低浓度 0. 1 mmol /L时,基本
上看不到条带的出现。而当浓度达到 0. 3 mmol /L时,
条带亮度基本上不再增加,清晰度也可以。
2. 2. 3 不同引物浓度对 PCR扩增效果的影响 引物
浓度大小和好坏是 PCR扩增的关键。试验结果表明
(图 5),各引物浓度都可以扩增出清晰的条带,为减少
引物用量, SSR反应中引物浓度选用 0. 3Lmol /L。
2. 3 利用优化的反应体系进行扩增反应
利用优化的 SSR反应体系和扩增程序 ( 15L l反应
体系,成分: 10 @ buffer1. 5L ,l Taq酶 ( 2U /L l) 0. 3L ,l
dNTP ( 0. 3mmol /L), 引物 ( 0. 3 Lmol /L), DNA模板
30ng),对毛红椿用其中 9对引物进行扩增, 扩增结果
见图 6。扩增的条带比较清晰,因此,优化的 SSR反应
体系能进行毛红椿群体的分子遗传研究。
图 5 不同浓度 DNA、dNTP和引物对 SSR扩增结果影响
M: DNA标准 ( DL2000 ); 1 ~ 4泳道代表 DNA模板浓度为 15、30、
45、60ng; 5~ 8泳道代表 dNTP浓度为 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4mmo l /L;
9 ~ 12泳道代表引物浓度为 0. 1、0. 3、0. 5和 0. 7Lmol /L
F ig. 5 The re su lts of SSR w ith d iffer en t con ten t
of DNA, dNTP and pr im er
3 讨 论
在以往分离基因组微卫星 DNA的方法中,膜杂交
法 [11 ]需要同位素,而磁珠富集法 [12 ]操作过程相对比较
繁琐。在本研究中改良了磁珠富集法, 首次从毛红椿
基因组中分离出微卫星 DNA。分离过程中简化了其操
作程序,更容易操作,而且富集效率也较高,达 34% ,比
传统方法 [4 ]高出 20多个百分点。林木基因组中最普
遍存在的微卫星是 (AG) n[13 ]、(AC) n[12 ]或 ( AT) n[ 13 ],
而在本研究中所用的生物素标记探针只为 ( AG) n,所
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 26No. 12 2006
以有必要用其他探针研究毛红椿基因组其他类型的微
卫星,以便开发出更多的微卫星分子标记。
图 6 毛红椿基因组 DNA的 SSR扩增
M: DNA标准 ( DL2000 ); 1~ 9泳道依次为 S5、S50、S56、
S34、S9、S11、S22、S42、S422引物所扩增的片段
F ig. 6 R esu lts of SSR am p lica tion of gen om ic DNA
在 PCR反应体系中, DNA模板用量过少, 引物与
模板结合机率降低,导致扩增产物的稳定性下降; 用量
过多,又可能将模板中杂质过多地带入反应体系, 导致
扩增产物稳定性下降或导致过量扩增,使电泳图谱呈
弥散状 [14, 15 ]。但研究表明在 DNA质量较好的前提下,
毛红椿 SSR体系具有较宽的模板用量范围,最合适浓
度为 30ng。引物浓度可对扩增结果产生重要影响, 过
多的引物会导致引物二聚体的形成,且易引起碱基错
配和产生非特异性扩增;引物浓度过低,其与 DNA模
板结合位点少,扩增产量下降并有可能出弥散现象 [16]。
研究中, 引物浓度确定为 0. 3Lmol /L, 建立了稳定的
SSR反应体系,为毛红椿分子育种打下了基础。
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2006, 26( 12) 刘 军 等:珍稀濒危树种毛红椿微卫星 DNA分离及 SSR反应体系优化
Isola tion ofM icrosa tellite DNA from Endanger ed TreeToona cilia ta
var. pubescen s and Op tmi iza tion of SSR R eaction System
LIU Jun1 SUN Zhong-xiu2 CHEN Yi- tai1 HE Gui-ping1 WU T ian- lin1
( 1 Research In stitu te of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400, Ch ina)
( 2 State K ey Laboratory of R ice Biology, Ch ina N ationa lR ice Research Inst itu te, H angzhou 310006, China)
Ab stract T. cilia ta var. pubescen is an endangered tree spec ie s. The population gene tic structu re
shou ld be essen tia l to conserve it e ffec tive ly. Genom ic DNA was successfully extracted from fresh leaves ofToona
cilia ta var. pubescens using CTAB method. M icrosate llite DNA was isolated from genomic DNA with improved
me thod of streptavitin beads. Some ted ious and ine fficient processes, such as gel extrac tion were discarded. The
genom ic lib rarywhich enriched withm icrosa tellite was construc ted. A fter sequencing the positive clones, we found
eigh teen positive c lones enriched w ith m icrosa te llite were found. E igh teen SSR primer pairs we re designed and
synthesized. The factors which affected on the SSR reaction ofToona cilia ta var. pubescens we re studied. The
resu lts showed that the optim ized concentration ofDNA was 30ng; the concen tra tion of dNTP was 0. 3mmol /L; 0.
3Lmol /Lwas the op tim ized concen tra tion of prime rs. Th rough above PCR system, repetitive and steady SSR
reaction system was constructed. This is the base of studying the popula tion genetic struc ture and genetic va ria tion
ofToona cilia ta var. pubescens.
K ey word s Toona cilia ta va r. pubescens Microsa te llite Strep tavitin bead SSR reac tion system
55