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（责任编辑：高国赋）
金柑抗冻实验模型的建立
郭 纯 1，杨 华 2，饶力群 2，李梦芸 2，马珊珊 3
（1. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2. 湖南农业大学生物科学技术学院，
湖南 长沙 410128；3. 湖南洞庭药业股份有限公司，湖南 常德 415001）
摘 要：冻害是威胁柑橘安全生产的重要因素之一，建立用于研究抗冻机理的柑橘抗冻实验模型十分重要。试验采用冷驯化诱发
金柑的抗寒能力，模拟柑桔越冬时气温低、土温高的环境，摸索金柑能耐受的最低温度和低温持续时间，建立了金柑抗冻实验模型。
研究结果表明：金柑在-10℃条件下冰冻 60 min后，对照组受到严重冻害，而经过冷驯化的处理组只有轻微冻害并能得到恢复。因
此，-10℃可以作为抗冻实验模型的处理温度。
关键词：金柑；冷驯化；抗冻；实验模型
中图分类号：S666 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2013）19-0092-04
Establishment of Freezing Resistance Experimental Model for Kumquat
GUO Chun1, YANG Hua2, RAO Li-qun2, LI Meng-yun2, MA Shan-shan3
（1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, PRC; 2. College of Bioscience and
Biotechnology, HNAU, Changsha 410128, PRC; 3. Hunan Dongting Pharm., Co., Ltd., Changde 415001, PRC)
Abstract: Freezing injury is one of the important harmful factors for safe production of citrus, so it is important to
establish the freezing resistance experimental model for citrus which use for studying the freezing resistance mechanism.
The experiment adopted cold acclimation to induce freezing resistance of Kumquat, which simulated over -winter
experiment of citrus (low in air temperature and high in soil temperature) to explore the lowest temperature and the longest
low temperature duration for Kumquat, and then to build freezing resistance experimental model for Kumquat. The results
showed that after freezing at -10℃ for 60 min, the Kumquat in control group froze badly, but the Kumquat in cold
acclimation treatment group froze slightly and can be recovery. Therefore, -10℃ can be used as the treating temperature
for freezing resistance experimental model.
Key words: Kumquat; cold acclimation; freezing resistance; experimental model
收稿日期：2013-08-26
基金项目：国家自然科学基金项目（31200963）；湖南省教育
厅项目（13B046）；湖南省科技厅计划项目（2009NK3096）；湖南省大
学生研究性学习与创新实验计划项目（2009126）
作者简介：郭 纯（1979-），女，湖南醴陵市人，博士，研究方
向为中药生物技术。
通讯作者：饶力群，杨 华
冻害是农业气象灾害的一种。常发生的有越冬
作物冻害、果树冻害和经济林木冻害等[1-3]。冻害对
农业威胁很大，如美国的柑橘生产、中国的冬小麦
和柑橘生产常因冻害而遭受巨大损失。历史上，我
国长江流域、美国柑橘产区就因严重的周期性冻害
数次遭受严重打击。自 1949年以来，我国出现了 5
次柑橘大冻害（1955年，1969年，1977年，1992年
和 2008年），仅 1992年 1月的冻害使我国柑橘受
冻面积达 56万 hm2，产量损失超过 200万 t；2008
年 1～2 月的冰冻对几个主要产区均造成严重影
响，特别是湖南、湖北等地更为严重。湖北的三峡
库区、丹江库区、富水库区等柑橘集中产区 75%以
上的柑橘受到不同程度的冻害，其中有 25%的柑
橘受到毁灭性损害。湘西的柑橘产业也遭到了毁灭
性打击，受灾面积达 6.67万 hm2，成灾 4.73万 hm2，
湖南农业科学 2013，（19）：92~95 Hunan Agricultural Sciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2013.19.034
表 1 -6℃下不同时间处理金柑叶片受冻情况
处理时间（min）
10
20
30
40
50
60
70
经冷驯化的金柑叶片
-
-
-
-
+
+
+
未经冷驯化的金柑叶片
-
-
-
+
+
++
++
注：“-”、“+”和“++”分别表示叶片正常、少量叶片受冻和多数叶片
受冻（下同）。
绝收近 1.93万 hm2，直接经济损失约 7亿元。面对
如此频繁的灾害影响，研究柑橘抗冻的机制显得十
分必要，而建立柑橘抗冻试验模型则是研究柑橘抗
冻机制的前提条件。试验采用冷驯化诱发抗寒能力
的金柑为实验组[4]，以未冷驯化诱发抗寒能力的金
柑为对照组，模拟柑橘越冬时气温低、土温高的环
境 [5-6]，摸索金柑能耐受的最低温度和低温持续时
间，以建立金柑抗冻实验模型。
1 材料与方法
1.1 试验材料
挑选生长健壮、粗细较一致的 2 a 生金柑
（Fortunella margarita (Lour.) Swingle）苗 200 株，用
钵高 24 cm、钵开口直径为 24 cm规格的营养钵栽
植，营养土为菜园土掺 1/3的火土灰，采用一般的
肥水管理和病虫害防治。所有材料放置室温 28℃
（室内温度变动 26.5℃～29.5℃。）正常生长 1个月
后，随机选取 100株移入控温室内进行冷驯化，温
度设定为 4℃，室内温度为 3.5～6.0℃，时间 15 d。
1.2 低温处理
试验材料在冷驯化半个月后，每 3株用棉絮
包裹营养袋及根颈，放入试验改装的控温箱进行
低温处理。控温箱温度在 0～-20℃（温度变化控制
在±0.2℃）。以未冷驯化的金柑经过不同时间不同
温度的低温处理后作为对照，取样进行生理生化分
析，单株设 3次重复。
1.3 细胞损伤分析
金柑受冻的叶片表现为水渍状、透明，颜色加
深呈墨绿色，质感变薄，叶片上的细小白点消失，数
小时后逐渐卷曲，2~3 d后叶片干枯。以成熟叶片
是否冻死（处理后叶片卷曲、干枯）为标准，配合电
解质渗出率及丙二醛（MDA）含量的测定，找到金
柑在试验条件下所能耐受的最低温度及能耐受低
温的持续时间。
1.3.1 电解质渗出率的测定 经低温处理的材料
分别放入 20 mL具塞刻度试管中，准确加入去离
子水 20 mL，盖上试管塞，在控温室浸泡 24 h，每次
浸泡时保持环境温度基本一致，搅动混匀后用精密
电导率仪（DDS-312 型，上海大普仪器有限公司）
测定溶液电导率，冷驯化处理样品的电导率为 E1，
对照材料的电导率为 E0。冷驯化处理的样品再放
入 98±2℃沸水浴中 1 h，以杀死植物组织，取出置
控温室冷却至室温，测其煮沸电导率 E2，按下式计
算各处理的电解质渗出率：电解质渗出率（%）=
[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。
1.3.2 丙二醛（MDA）含量的测定 取待测液 1.0
mL，加入 5.0 mL 20％的三氯乙酸（TCA）（含 0.5％
的硫代巴比妥酸：TBA）混匀后塞上塞子，水浴煮沸
30 min，冰浴快速冷却，4 000 r/min离心 10 min，以
20％TCA为参照，上清液用紫外分光光度计测定
532 nm和 600 nm处的吸光值 A532和 A600，重复 3
次求平均值，MDA含量=△A×N/W。△A=A532-A600，
N为稀释倍数，W为植物样品重量（g）。
2 结果与分析
2.1 实验模型的冰冻处理时间
为了探讨金柑生长期所能耐受的冰冻低温持
续时间，两种处理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下
处理不同时间，观察叶片受冻情况。两种处理的盆
栽苗冰冻 30 min均未表现出冻害症状；未经冷驯
化的金柑冰冻 40 min 出现冻害症状，60 min 其大
多数叶片受冻；而经冷驯化的金柑冰冻 50 min才
出现冻害症状，60 min只是轻微的冻害（表 1）。为
减少控温箱中缺乏光照的影响，并鉴于上述结果，
选定抗冻实验模型的冰冻处理时间为 60 min。
2.2 实验模型的冰冻处理温度
为了探讨金柑生长期所能耐受的致死温度，两
种处理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同温度下冰冻处
理 60 min，观察叶片受冻情况。两种处理的盆栽苗
0℃下均未表现出冻害症状；未经冷驯化的金柑-
3℃出现冻害症状、-6℃大多数叶片受冻、-12℃全
部叶片受冻；而经冷驯化的金柑-6℃才出现轻微的
冻害症状、-12℃大多数叶片受冻（表 2）。考虑到抗
冻实验模型中未经冷驯化的对照组要求表现受冻，
而经冷驯化的处理组不能表现受冻，因此抗冻实验
模型的冰冻温度需要选定在-9～-12℃。
2.3 低温胁迫对金柑叶片电解质渗出率的
影响
第 19期 郭 纯等：金柑抗冻实验模型的建立 93
表 2 不同低温处理 60 min金柑叶片受冻情况
处理温度（℃）
0
-3
-6
-9
-12
经冷驯化的金柑叶片
-
-
+
+
++
未经冷驯化的金柑叶片
-
+
++
++
+++
注：“-”、“+”和“++”表示同上，“+++”表示全部叶片受冻。
冷
驯
化
组
CK
组
平衡期
28℃处理 1个月
冷驯化期
处理组 4℃处理半个月
对照组 28℃处理半个月
冷驯化期
-10℃处理 1小时
恢复期
28℃恢复 1星期
图 3 -10℃条件下 60 min冰冻处理金柑叶片受冻情况
0 -3 -6 -9 -12
温 度（℃）
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
M
DA
（
nm
ol
g-
1 F
W）
图 2 不同冰冻温度处理下金柑叶片 MDA含量的变化
100
80
60
40
20
0
电
导
率
（
%）
0 -3 -6 -9 -12
温 度（℃）
图 1 不同冰冻温度处理下金柑叶片电解质渗出率的变化
两种预处理的金柑在温度高于-6℃条件下冰
冻 60 min，其叶片电解质渗出率均低于 50%；但未
经过冷驯化的金柑在-9℃条件下冰冻处理，其叶片
电解质渗出率增加到 58.4%，当温度下降到-12℃
时，电解质渗出率陡然增加到 96.2%，表现为所有
叶片均严重受损；而经过冷驯化的金柑叶片电解质
渗出率在-9℃条件下依然低于 50%，当温度下降
到-12℃时，电解质渗出率平缓地增加到 51.4%，表
现为部分叶片受损（图 1）。将温度-电解质渗出率
拟合 Logistic方程[7-8]，可以求出半致死温度。实验结
果表明经冷驯化的金柑的半致死温度低于-10℃。
当温度处于-10℃时，未经冷驯化的对照组受冻 60
min，其叶片的电解质渗出率远大于 50%，表现出严
重的冻害，可以作为抗冻实验模型的对照组；当温
度处于-10℃时，经冷驯化的实验组受冻 60 min，其
叶片的电解质渗出率低于 50%，不会表现出严重
的冻害，可以作为抗冻实验模型的实验组。
2.4 低温胁迫对金柑叶片中丙二醛（MDA）
含量的影响
MDA是膜质受氧自由基破坏的产物，是膜损
伤的重要指示指标。随着温度的降低，冻害加深，
MDA含量也逐步增加。到-9℃时处理 60 min出现
峰值，但到-12℃时 MDA含量反而急剧降低。对照
组在-12℃时处理 60 min的 MDA含量较-9℃时处
理 60 min的 MDA含量下降了 0.062 6，处理组下
降了 0.084 6（图 2）。
2.5 抗冻实验模型的检验
根据对不同温度和不同处理时间的研究，选定
处理温度为-9～-12℃之间，处理时间为 60 min。再
通过考察金柑叶片电解质渗出率和 MDA含量，选
定处理温度为-10℃。对照组和冷驯化组金柑经
过-10℃条件下冰冻 60 min处理，结果如图 3。研究
结果表明：未经冷驯化的对照组在-10℃条件下冰
冻 60 min后受到严重冻伤。叶片表现为水渍状、透
明，颜色加深呈墨绿色，质感变薄，叶片上的细小白
点消失，1 h后逐渐卷曲，2~3 d干枯，树枝变软、下
垂，逐步变黄，数日后干枯，最后整株死亡；经过冷
驯化的处理组在-10℃条件下冰冻 60 min 后受到
一定的冻害。叶片呈轻微水渍状，颜色加深呈浅绿
色，叶片上的部分细小白点消失，少部分嫩叶微卷
曲；嫩枝变软，叶片下垂；经过 28℃恢复 1星期，叶
色变浅，叶片背面呈白色，细小白点重新出现，嫩枝
变硬，叶片抬升；并有少数腋芽萌动。由此表明：
在-10℃条件下冰冻 60 min，对照组受到严重冻害，
而处理组只有轻微冻害并能得到恢复。因此，-10℃
可以作为抗冻实验模型的处理温度。
3 讨 论
3.1 材料的选择
柑橘的耐寒性与柑橘品种密切相关，柑橘品种
的耐寒能力依次为：枳>金柑>阔皮柑橘>酸橙>甜
湖南农业科学 第 19期94
橙>柚类>柠檬、枸橼[9-10]。枳耐寒能力最强，但枳到
冬天叶片会脱落，无法用其叶片开展抗冻研究[11]。
金柑，又名金桔，属芸香科，是著名的观果植物。金柑
虽然抗寒能力弱于枳，但其属常绿植物，而且叶形较
大，取材方便，是开展柑橘抗冻研究的理想材料。
3.2 金柑根系的保护
柑橘根系不耐低温，在自然条件下，柑橘越冬
时气温虽然低，但根际土壤的温度仍较高，使根系
不受低温影响。但在实验时，由于盆栽苗土壤少，
冰冻处理时无法维持较高温度，柑橘根系受损，影
响抗冻实验模型的建立。因此，试验采用棉絮包裹
营养钵及根颈的办法保护金柑根系。
3.3 处理时间和温度的选择
试验结果表明，冰冻处理时间 60 min的效果
和 70 min的效果相当。由于控温箱中缺乏光照，时
间过长，金柑将受到影响，因此选定处理时间为 60
min。
柑橘冻害的气象指标，按冻害的发生程度可分
为-5℃、-7℃、-9℃、-11℃等 4个温度等级，分别代
表柑橘开始受冻害、轻冻害、冻害和重冻害的指标。
但以往的研究表明，冷冻室冰冻处理与自然界冰冻
有差异。因此，根据前期的研究，将温度设置为
0℃、-3℃、-6℃、-9℃和-12℃。
3.4 金柑抗冻实验模型
以冷驯化后冰冻处理未表现冻害的金柑为抗
冻组，以未冷驯化后冰冻处理表现冻害的金柑为
对照组建立金柑抗冻实验模型。研究结果表明：金
柑在-10℃条件下冰冻 60 min后，对照组受到严重
冻害，而经过冷驯化的处理组只有轻微冻害并能
得到恢复。因此，-10℃可作为抗冻实验模型的处理
温度。
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（责任编辑：李 丹）
第 19期 郭 纯等：金柑抗冻实验模型的建立 95