全 文 ：收稿日期:2007-08-22;修订日期:2007-10-25
作者简介:汪艳璐(1981-), 女 ,安徽黟县人 , 硕士 ,从事微生物学研究工作。
基金项目:江西省教育厅科技项目(赣教技字 [ 004]号)。
第 25卷　第 6期
2007年 12月
江　　西　　科　　学
JIANGXI　SCIENCE
Vol.25No.6Dec.2007
　　文章编号:1001-3679(2007)06-0688-05
南丰蜜橘 β -萝卜素羟化酶
的生物信息学分析
汪艳璐 ,罗玉萍 ,李思光 ,冯唐锴
(南昌大学生命科学学院 ,江西　南昌 330031)
摘要:利用多种在线软件对本实验室克隆测序的南丰蜜橘(CitrusreticulataBlancovar.kinokuni(Tanaka)H.H.
Hu)β -胡萝卜素羟化酶(chy,蛋白序列号 CAL63739)的理化性质 、亲水性 、跨膜区及空间结构进行了预测。
理化性质分析显示其含 311个氨基酸分子量为 34 785.4, pI值为 9.03。该酶定位于类囊体膜上 , TMpred跨膜
分析显示它含有 4个显著的跨膜螺旋区 , 这些区域与 ProtScale预测的疏水区基本重叠。该酶二级结构以 α-
螺旋为主 , 且含多种磷酸化位点。结构域分析显示该酶含 β -羟化酶家族的特征结构域 PD095142(99 ～
156aa)和 PD011050(157 ～ 280aa)。借助 HHpred三级结构预测结果 ,分析了该酶的结构特征及可能的膜定位
方式。本文为进一步研究该酶结构和功能的关系打下了基础。
关键词:南丰蜜桔;β -胡萝卜素羟化酶基因;基因克隆;β -隐黄素
中图分类号:Q789　　　　文献标识码:A
BioinformaticAnalysisofβ -caroteneHydroxylasefromNanfengOrange
WANGYan-lu, LUOYu-ping, LISi-guang, FENGTang-kai
(ColegeofLifeSciences, NanchangUniversity, JiangxiNanchang330031 PRC)
Abstract:Inthepresentstudy, theNanfengorangeβ -carotenehydroxylase(chy, proteinaccession
numberCAL63739), studiedinourlaboratoryrecently, wasanalyzedbyusingaseriesofonlinesoft-
ware.Thisβ -carotenehydroxylasecontains311 aminoacidresidues.Itsmolecularweightis34
785.4, andthetheoreticalpIis9.03.TMpredanalysisshowthatitcontainsfourdistinguishedtrans
membraneheliceswhichareoverlapwiththehydrophobicregionsthatpredictedbyProtScale, sug-
gestingthisenzymeisamembraneproteinlocatedinthylakoidmembrane.Inaddition, structure
anaylisisshowthatα-helixisthemainsecondarystructureofthisenzyme, anditcontainsmany
kindsofphosphorylationsites.TheNanfengorangeβ -carotenehydroxylasecontainscharacteristic
domainsofβ -hydroxylasefamilyPD095142(99 ～ 156aa)andPD011050(157 ～ 280aa), andits
structuralfeatureandorientationinthemembranewereanalyzedaccordingtothetertiarystructure
predictedbyHHpred.Theresultofpresentpaperwilprovidedataforthefurtherstudyoftheβ -
carotenehydroxylase.
Keywords:Orange, β -carotenehydroxylasegene, Cloning, β -cryptoxanthin
DOI :10.13990/j.issn1001-3679.2007.06.010
0　前言
β -胡萝卜素羟化酶(简称 β -羟化酶)是植
物类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶 ,它在植
物叶黄素的生物合成中催化 β -胡萝卜素经中间
产物 β -隐黄素合成玉米黄素[ 1] 。该酶广泛存在
于植物 、蓝藻和细菌等生物中。目前柑橘[ 2, 3] 、辣
椒 [ 4] 、拟南芥 [ 5, 6]等多种植物 β -羟化酶基因都
已被克隆 , GenBank数据库收录了几十种植物和
微生物 β -羟化酶基因 ,总计 200多条序列 。
β -羟化酶定位于叶绿体中类囊体膜上 ,是
一种无血红素双铁单加氧酶 [ 1] 。该酶作用过程
中 ,羟化反应所需电子可能来自于光系统 Ⅱ和光
系统 Ⅰ 或铁氧还蛋白氧还酶 (feredoxinoxi-
doreductase, FNR),它们传递的电子再通过铁氧
还蛋白(ferredoxin, Fd)传递给羟化酶中的铁离
子 。铁离子接受电子后被还原成亚铁离子 ,亚铁
离子激活分子氧(见图 1(a))[ 4] 。在酶的作用下
C(3)处的 C-H键被打断 ,并将活化氧所形成的
羟基加在该处(见图 1(b))[ 1] 。一些外源表达的
β -羟化酶在提供亚铁离子的条件下 ,有较高的
活性 ,这表明 β -羟化酶的活性需要有亚铁离子
的参与 [ 7] 。但是目前关于 β -羟化酶蛋白分子的
结构和功能的进一步报道很少 。最近 ,从南丰蜜
橘基因组中克隆鉴定了 β -羟化酶基因 [ 2] 。结果
表明该基因含有 7个外显子和 6个内含子 ,外显
子编码了 1个含 311个氨基酸的蛋白(蛋白序列
号 CAL63739)。为了对该酶的结构和功能进行
深入研究 ,本文利用生物信息学方法 ,对南丰蜜橘
β -羟化酶蛋白的结构和特点做了初步分析 。
图 1　β -胡萝卜素羟化酶的作用原理及电子传递
　　途径
1　材料和方法
1.1　材料
本实验室克隆测序的南丰蜜橘 β -羟化酶基
因 (chy)相关 数据 。 GenBank蛋白 序列 号
CAL63739。
1.2　方法
利用 ProtParam[ 8]分析蛋白质的理化性质;利
用 ProtScale[ 8] 分析蛋白质的亲水性区域;利用
TMpred[ 9]分析蛋白质的跨膜区域;利用 Predict-
Protein[ 10]分析蛋白质所含模体 、二级结构;利用
ProDom分析蛋白质的结构域;利用 HHpred[ 11]分
析蛋白质的三级结构 。
2　结果
2.1　南丰蜜橘 β -羟化酶蛋白质理化性质分析
对本实验室测定的南丰蜜橘 β -羟化酶氨基
酸序列(取自 AM408552的注释)的理化性质分
析结果表明 ,该酶含 311个氨基酸;总相对分子量
34 785.4;pI=9.03;负电荷氨基酸(Asp+Glu)29
个 ,正电荷氨基酸 34个;原子总数 4 906;分子式
C1602H2447N423O421S13;摩尔消光系数 1.252(胱氨酸
全按照半胱氨酸计);该酶蛋白不稳定性指数 52.
73,应归类为不稳定蛋白;其脂肪系数 83.44;总
平均亲水性(GRAVY)0.033。
2.2　南丰蜜橘 β -胡萝卜素羟化酶蛋白质亲水
性 、跨膜区分析
南丰蜜橘 β -羟化酶蛋白的亲水性区域预测
结果表明(见图 2)该蛋白 N端为疏水区 , C端为
亲水区 。在该蛋白 100 ～ 150aa和 190 ～ 240aa处
有 2个显著疏水峰 ,其它区域以亲水性为主。利
用 TMpred在线软件预测南丰蜜橘 β -羟化酶蛋
白的跨膜螺旋区域 (transmembranehelices, TM
helices)。该软件预测得分超过 500的区域为可
能的跨膜螺旋区域 ,符合该条件的区域有 5个。
其中膜外向膜内的跨膜螺旋为 1 ～ 17aa, 143 ～
161aa, 214 ～ 237aa,膜内向膜外的跨膜螺旋为 104
～ 126aa, 193 ～ 211aa(见图 3、图 4、图 5)。此外 ,
在线软件 PHDhtm预测该酶跨膜螺旋为 4个 ,与
TMpred预测的后 4个跨膜螺旋基本一致。跨膜
区域位于膜结构中 ,应为蛋白的疏水区域。上述
5个预测的跨膜螺旋 ,都与 ProtScale预测的蛋白
疏水区对应 。因此 ,被预测的跨膜螺旋区的可信
度较高 。
·689·第 6期　　　　　　汪艳璐等:南丰蜜橘 β -萝卜素羟化酶的生物信息学分析
图 2　南丰蜜橘 β -胡萝卜素羟化酶蛋白的疏水
　　　性分析
图 3　南丰蜜橘 β -胡萝卜素羟化酶蛋白跨膜螺
　　　旋区的分析
2.3　南丰蜜橘 β -胡萝卜素羟化酶蛋白质结构
分析
　南丰蜜橘 β -羟化酶蛋白的模体分析显示 ,南
丰蜜橘的 β -羟化酶蛋白含多种磷酸化位点的模
体(见图 4)。其中包括 1个酪氨酸激酶 I磷酸化
位点(M5), 2个依赖于 cAMP或 cGMP的蛋白质
激酶磷酸化位点(M3), 2个酪蛋白激酶 I磷酸化
位点(M4), 5个蛋白质激酶 C磷酸化位点(M2),
7个 N-肉豆蔻酰化位点(M1)。二级结构分析
显示 , 南丰蜜橘 β -羟化酶蛋白的二级结构以 α
-螺旋为主 ,在 80 ～ 180aa之间 ,有 3段不连续的
α-螺旋(80 ～ 101aa, 107 ～ 131aa, 140 ～ 179aa),
此外 193 ～ 212aa, 219 ～ 229aa, 255 ～ 267aa, 292 ～
306aa亦为 α-螺旋。上述 TMpred软件预测的跨
膜螺旋 ,基本都位于这些区域内 。其次是一些重
要的 β -环结构 (21 ～ 23aa, 66 ～ 76aa, 181 ～
187aa, 247 ～ 254aa)。该蛋白的 β -折叠较少 ,只
有 2个很短的 β -折叠(57 ～ 63aa, 230 ～ 242aa)。
结构域分析显示 ,南丰蜜橘 β -羟化酶蛋白含有
β -羟化酶相关家族共有的典型结构域 PD095142
(99 ～ 156aa)和 PD011050(157 ～ 280aa)。
　　三级结构分析(见图 5)显示了南丰蜜橘 β -
羟化酶蛋白各二级结构组件之间的空间位置关
系 。植物 β -羟化酶蛋白定位于叶绿体中的类囊
体膜上 [ 1] ,图 5中 , Ⅰ实线箭头指示了后 4个跨膜
螺旋 ,根据 TMpred预测的跨膜螺旋方向 ,可以推
测类囊体膜的可能位置(虚线之间)及蛋白在膜
上的定位方向。南丰蜜橘 β -羟化酶中也含有 10
个保守组氨酸 , 它们形成 2组 “HXXXXH” +
“HXXHH”模体 。研究表明缺少或改变 β -羟化
酶中任何 1个保守组氨酸 ,都会使酶失活[ 3 ～ 5] 。
这两组组氨酸模体在一级结构上距离较远 ,隔了
2个跨膜螺旋(见图 4)。但它们在空间上靠的很
近 ,集中于各 α-螺旋以外的 2个类囊体膜内侧
的亲水性环上(见图 5)。跨膜螺旋和组氨酸模体
·690· 江　西　科　学 2007年第 25卷
在空间上相互分隔 ,这充分体现了酶分子结构和
功能上的一致性 。
实线矩形内为 10个保守组氨酸聚集的区域;空心短箭头指示了
预测蛋白的起始位点和终止位点;实线箭头指示预测的跨膜螺旋
区域;两虚线之间指示类囊体膜的大致位置 ,两边分别为膜的内
外侧。
图 5　预测的 β -羟化酶的三级结构
3　讨论
植物及多种微生物的 β -羟化酶都含 2组
“HXXXXH” +“HXXHH”模体(见图 4)[ 1, 4] ,它们
可能共同构成了一个具有催化作用的结构域 ,该
结构域即为酶的催化位点 。参与催化电子传递的
亚铁离子可能就是与 2组组氨酸模体结合 ,并在
羟化反应中将电子传递给组氨酸模体 。这种模体
同样存在于膜脂肪酸脱氢酶中 ,膜脂肪酸脱氢酶
也是一种无血红素双铁单加氧酶。显然含组氨酸
模体是这类酶的一个显著特征。目前已知的 β -
羟化酶可以分为 4大类 ,即植物 β -羟化酶 、非光
合细菌 β -羟化酶 、蓝藻 β -羟化酶和嗜热菌
(Sulfolobussolfataricus)β -羟化酶 。虽然这 4种
β -羟化酶之间的保守性较低 ,但是它们都含有
上述组氨酸模体 ,同属于无血红素双铁单加氧酶。
但是最近在嗜热菌 (Thermusthermophilus)
HB27中发现了一种具备 β -环羟化能力的来自
P450超家族的单加氧酶 CYP175A1[ 12] 。一些人
工重组的体外系统中 ,该酶能将 β -胡萝卜素羟
化成 β -隐黄素或玉米黄素[ 13] 。 CYP175A1虽然
与已知的 4类 β -羟化酶具有相同的功能 ,但是
在蛋白质一级结构上存在很大的差异。显然该酶
是一种新型的 β -羟化酶 。因此 ,无血红素双铁
单加氧酶家族的 β -羟化酶和 P450超家族的 β
-羟化酶的结构与功能关系上的比较将有助于人
们进一步了解 β -羟化反应的机制及所需条件 。
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(上接第 676页)
　　区域支撑能力与压力演进速度的差异 ,使得
江苏省演进的耦合度快速演变 。区域压力演进速
度的加剧主要是由于江苏省社会经济快速发展 ,
带来的人口密度增大 ,资源耗损加剧 ,环境破坏日
益严重;而区域支撑能力演进速度的减退主要是
由于重视不够 ,自身建设不足 ,以及区域压力对其
的胁迫 ,使得演进速度不但没有跟上社会经济发
展的速度 ,而且还愈加变慢。江苏省社会经济发
展快速 ,但其区域发展已经处于不可持续发展的
状态 ,因此应该转变发展理念 ,改变经济增长模
式 ,调整产业结构 ,并且大力提高资源环境的利用
效率 ,提倡循环经济 ,加强生态环境建设 ,努力实
现区域的协调发展。
4　结论
本文在建立了区域协调发展的动态耦合模型
与评价指标体系的基础上 ,对江苏省区域发展的
耦合演进状态进行了实证分析 。结果表明 , 1990
年 ～ 2005年江苏省区域支撑能力与压力水平均
呈上升态势 ,但二者的演进速度表现出显著的差
异 ,其中区域支撑能力的演进速度呈现不断下降
的态势 ,而区域压力子系统的演进速度则呈逐年
快速上升的态势。在选取的研究时段内 ,江苏省
区域发展的耦合状态经历了区域可持续发展
(1990年 ～ 1996年)和区域不可持续发展(1997
年 ～ 2005年)2个阶段。 2005年江苏省区域发展
耦合度已经高达 76.05°,而且增长趋势显著 ,如
不加以控制可能进入极限增长阶段 ,这将会使区
域发展矛盾加剧 ,区域的支撑系统遭到破坏。因
此 ,应该转变发展理念 ,改变经济增长模式 ,调整
产业结构 ,并且大力提高资源环境的利用效率 ,提
倡循环经济 ,加强生态环境建设 ,努力实现区域的
协调发展。
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