全 文 ：第 51 卷 第 10 期
2 0 1 5 年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 10
Oct．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151007
收稿日期: 2014 － 10 － 20; 修回日期: 2014 － 12 － 02。
基金项目: 国家自然科学基金项目“竹子叶黄素循环分子调节机制研究”(31370588) ; 国际竹藤中心基本科研业务费专项资金项目“毛竹
快速生长期特异转录调控网络的构建及其应用”(1632015008)。
* 高志民为通讯作者。
毛竹 β －胡萝卜素羟化酶基因的分子特征
及其功能*
孙化雨 陈 颖 赵韩生 董丽莉 王丽丽 娄永峰 高志民
(国际竹藤中心 竹藤科学与技术重点开放实验室 北京 100102)
摘 要: 【目的】β － 胡萝卜素羟化酶(BCH)是催化 β － 胡萝卜素经中间产物 β － 隐黄素合成玉米黄质的关键
酶，玉米黄质在植物光保护过程中发挥着重要作用。通过研究毛竹 β － 胡萝卜素羟化酶基因(PeBCH)的结构特
点、表达特征和功能，为揭示强光胁迫条件下 PeBCH 在竹子光保护中的作用提供证据，为培育抵抗强光胁迫的植物
新品种提供新的基因资源。【方法】以毛竹为对象，通过同源克隆的方法分离 PeBCH，利用生物信息学软件分析其
结构特点，采用实时荧光定量 PCＲ 技术分析基因的组织表达特性，构建 PeBCH 基因的过量表达载体，并在拟南芥
中异位表达，通过对转基因拟南芥植株的表型和生理变化来鉴定 PeBCH 基因的功能。【结果】从毛竹中获得了
1 个BCH 同源基因序列，命名为 PeBCH; 该基因的全长 1 385 bp，编码区为 927 bp，编码区对应的基因组序列为
1 566 bp，包含 5 个内含子、6 个外显子，内含子完全符合 GT-AG 剪接原则。PeBCH 编码 1 个 308 个氨基酸的蛋白，
PeBCH 蛋白具有 BCH 家族的特征结构域 PD095142 和 PD011050，存在 4 个跨膜结构，二级结构含有无规则卷曲、延
伸链和 α 螺旋 3 种，其中以无规则卷曲覆盖的氨基酸残基最多。组织表达特异性分析表明，PeBCH 基因在毛竹的
根、幼茎、叶片、叶鞘、节中均检测到表达，但表达丰度存在着显著差异，其中在叶片中的相对表达丰度最高。不同
光照处理影响 PeBCH 基因的表达，随着光强的增大该基因的表达丰度呈现先上升后下降的趋势，其中光强
1 000 μmol·m － 2 s － 1处理后基因的表达丰度最高，约为对照的 1. 5 倍，但光强 1 500 μmol·m － 2 s － 1处理后，PeBCH 基
因的表达丰度显著下降，仅为对照的 5%，明显受到强光的抑制。利用 PeBCH 基因转化拟南芥后，ＲT-PCＲ 分析表
明 PeBCH 基因在转基因植株中得到表达; 与野生型拟南芥相比，转 PeBCH 基因拟南芥植株生长健壮，叶绿素、类胡
萝卜素、胡萝卜素和叶黄素含量均有所增加; 在实验室环境光强(145 μmol·m － 2 s － 1 )和强光(530 μmol·m － 2 s － 1 )条
件下，转 PeBCH 基因植株的 NPQ 明显高于野生型植株，二者 NPQ 的稳定值间差异达到极显著水平 (P ＜ 0. 01)。
【结论】PeBCH 在毛竹中为组成型表达，光照处理( ＜ 1 000 μmol·m － 2 s － 1 )诱导其在叶片中的表达。该基因的过量
表达有助于提高转基因植株的热耗散能力，抵抗强光胁迫。该基因将是今后植物抗逆分子育种的重要基因资源
之一。
关键词: 毛竹; β －胡萝卜素羟化酶基因; 拟南芥; 色素含量; 叶绿素荧光参数
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)10 － 0053 － 07
Molecular Characteristics and Functional Analysis of β-Carotene
Hydroxylase Gene from Phyllostachys edulis
Sun Huayu Chen Ying Zhao Hansheng Dong Lili Wang Lili Lou Yongfeng Gao Zhimin
(Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Ｒattan International Center for Bamboo and Ｒattan Beijing 100102)
Abstract: 【Objective】Zeaxanthin plays an important role in light protection for plants under light stress． β- carotene
hydroxylase (BCH) is a key enzyme in catalyzing β-carotene to form zeaxanthin via β-cryptoxanthin． To reveal the role of
BCH in light protection for bamboo under stress conditions of high light intensity and provide new genetic resource for the
breeding of new varieties，the study of bamboo β-carotene hydroxylase gene (PeBCH) structural features，expression and
functional characteristics will be carried out． 【Method】Moso bamboo (Phyllostachys edulis) was used for the isolation of
PeBCH by homologous cloning method，the structural characteristics of PeBCH was analyzed using bioinformatics software，
the analysis of gene expression in different tissues was performed with real-time quantitative PCＲ，gene function was
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identified through the phenotypic and physiological analyses of transgenic Arabidopsis thaliana with overexpressed PeBCH．
【Ｒesult】A homologous gene of BCH was obtained from P． edulis and named as PeBCH． The full length cDNA of PeBCH
was 1 385 bp including an open reading frame (OＲF) of 927 bp，which encoded a 308 aa protein with the characteristic
domains，PD095142 and PD011050 of BCH family． The genomic sequence corresponding to the OＲF was 1 563 bp
containing five introns and six exons，which was in full compliance with the intron splicing principles of GT-AG． There
were four transmembrane domains in PeBCH，which comprised three kinds of second structures such as random coil，
extended strand and α helix，of which the random coil covered the largest number of amino acid residues． Tissue specific
expression showed that PeBCH was differently expressed in root，young stem，leaf，sheath and node，with the highest level
in leaf． The expression of PeBCH was affected by light treatment in a trend of upward followed by downward with increasing
light intensity． The expression was in an upward trend with the light intensity no more than 1 000 μmol·m － 2 s － 1，and
reached the highest level (about 1. 5 times of the control) after 2 h treatment with 1 000 μmol·m － 2 s － 1 ． However，it was
inhibited significantly after 2 h treatment with 1 500 μmol·m － 2 s － 1，which was only 5% of the control． ＲT-PCＲ
analysis demonstrated that PeBCH was expressed in the transgenic plants of A． thaliana． Compared with wild type，
transgenic plants were vigorous，the content of pigments including chlorophyll，carotenoid，β-carotene and lutein were
all increased compared with those of wild-type plants． Meanwhile，the values of non-photochemical quenching ( NPQ)
of transgenic plants were all increased under the laboratory light intensity (145 μmol·m － 2 s － 1 ) and the intensity of 530
μmol·m － 2 s － 1，and the difference between the stable values of NPQ reached a significant level ( P ＜ 0. 01 ) ．
【Conclusion】PeBCH was constitutively expressed in moso bamboo，and it was induced in leaf by high light intensity
( ＜ 1 000 μmol·m － 2 s － 1 ) ． The overexpression of PeBCH was helpful to improve heat dissipation capability of transgenic
plant to resist high light stress，indicating that PeBCH will be an important genetic resource for molecular breeding of
plant resistence in future．
Key words: Phyllostachys edulis; β-carotene hydroxylase gene; Arabidopsis thaliana; pigment content; chlorophyll
fluorescence parameter
β －胡萝卜素羟化酶(BCH)是植物类胡萝卜素
合成代谢途径中的关键酶之一，催化 β － 胡萝卜素
经中间产物 β － 隐黄素合成玉米黄质( Tian et al．，
2004)。在强光胁迫下，玉米黄质通过参与植物过
量光能的非放射性释放过程，帮助植物释放掉多余
的能量，降低集中到反应中心的激发能，减少自由基
的形成，抑制光破坏的发生，从而起到光保护的作用
(Demmig et al．，1987)。BCH 广泛存在于植物、蓝藻
和细菌等生物中，拟南芥( Arabidopsis thaliana) ( Sun
et al．，1996 )、甜橙 ( Citrus sinensis ) (徐昌杰等，
2003)、南丰蜜橘(Citrus reticulata var． kinokuni) (冯
唐锴等，2007)等多种植物的 β －胡萝卜素羟化酶基
因相继被克隆。在拟南芥中 β －胡萝卜素羟化酶基
因的过量表达，能够提高植物的抗逆性 ( Davison
et al．，2002)。而利用反义抑制或者T-DNA突变的
方法，获得了抑制 β － 胡萝卜素羟化酶基因表达的
拟南芥株系，它们合成隐黄素、玉米黄质等类胡萝卜
素的能力下降，抗逆性也随之下降 ( Pogson et al．，
2000; Tian et al．，2003)。甜橙中 Csβ-CHX 基因沉
默导致果实表型为深黄色，其果汁中的 β 胡萝卜素
含量显著增加 (最高可达 36 倍 ) ( Pons et al．，
2014)。因此，开展 BCH 基因研究对了解植物的光
保护能力以及 β 胡萝卜素的生物合成具有重要
意义。
竹子是重要的森林资源之一，主要分布在低
纬度的热带或亚热带季风气候区，种植区在春
季、夏季和秋季常出现持续的高温强光天气，这
会直接影响竹子的生长，尤其是存在其他胁迫的
条件下，竹子很容易产生光抑制，甚至光破坏。
而适应各种光照环境是植物生存的本能，为适应
复杂多变的光胁迫环境形成了多种保护机制，如
通过改变叶片的角度以减少光能的吸收，从而避
免吸收过量的光能 ( Powles，1984 ) ;提高核酮
糖 － 1，5 － 二磷酸羧化酶 /加氧酶的活性或数量
来增加碳同化的能力，从而减少过量激能的形
成，避免植物受到光破坏的危害 ( Spreitzer et al．，
2002) ;通过叶黄素循环将过量光能以无害的热
能形式耗散掉(Hieberet al．，2004 )等。本研究以
毛竹( Phyllostachys edulis)为对象，从合成玉米黄
质的另一关键酶基因———β － 胡萝卜素羟化酶基
因入手，在分析其结构特点、表达特征的基础上，
通过在拟南芥中异位表达对其功能进行了初步
验证，以期从分子水平上揭示 β － 胡萝卜素羟化
酶基因在毛竹光破坏防御中的作用，为采用基因
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第 10 期 孙化雨等: 毛竹 β －胡萝卜素羟化酶基因的分子特征及其功能
工程手段培育抵抗强光胁迫的植物新品种提供
参考。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
毛竹盆栽实生苗(0． 5 年生)，培养于本实验室的
培养室，培养温度 25 ℃，光照 145 μmol·m － 2 s － 1，光
周期为 16 h /8 h。采集毛竹新根及新生枝条的幼
茎、节、叶片和叶鞘，用于试验。
分别对毛竹苗采取黑暗、不同光照 (100，300，
500，1 000，1 500 μmol·m － 2 s － 1)处理 2 h，每个处理
重复 3 次，同时以培养室光照下的竹苗为对照，处理
完成之后，采取顶端第 3 片叶用于后续试验。
1． 2 基因克隆与生物信息学分析
以玉 米 β － 胡 萝 卜 素 羟 化 酶 基 因 BCH1
(GQ131287)(Li et al．，2010)为诱饵，采用同源比对
方法从 NCBI 数据库中调取毛竹的同源序列，根据
该序列利用 Primer Premier 5． 0 软件设计 PCＲ 引物
(BCH-F:5-ATGGCCGCAGGACTCTCCG-3 和 BCH-
Ｒ: 5-AACACTCCTGTTCCGGTTGATTCTC-3)，由北
京六合华大基因科技有限公司合成。
采用 Trizol 法(Gao et al．，2006)分别提取毛竹
新根及新生枝条的幼茎、节、叶片和叶鞘的 ＲNA 以
及光照处理植株叶片的 ＲNA，按照 ＲNA 反转录试
剂盒说明合成 cDNA。采用 CTAB 法 (高志民等，
2006)提取毛竹叶片基因组 DNA，用分光光度计测
定浓度，检测质量，用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 分
子量大小。
分别以叶片 cDNA 和基因组 DNA 为模板，扩增
编码区及其对应的基因组序列。PCＲ 反应体系为:
DNA(0． 04 μg·L － 1)1 μL，正向引物(10 μmol·L － 1)
1 μL，反向引物(10 μmol·L － 1 )1 μL，dNTP(各 2． 5
mmol·L － 1 ) 1. 6 μL，5 × Primer STAＲTM Buffer 4 μL，
Primer STAＲTM酶(2． 5 U·μL － 1 )0． 2 μL，补加ddH2O
至总体积 20 μL。PCＲ 反应条件:95 ℃ 30 s，64 ℃
30 s，72 ℃ 1 min，共 32 个循环。PCＲ 产物电泳分析
后，用 BIOMIGA 试剂盒回收，按照 pGEM-T easy 载体
快速连接试剂盒操作流程，将回收的 DNA 片段连接
到载体上，转化大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α 菌
株，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆并经酶切图谱分析
后，由北京六合华大科技有限公司测序。
利用在线软件 Spidey( http: / /www．ncbi．nlm．nih．
gov / spidey /)分析基因组结构。分别利用 ProtScale
(http: / /web．expasy．org / protscale)、TMHMM Server v．
2． 0 ( http: / /www． cbs． dtu． dk / services /TMHMM /)、
FoldIndex ( http: / / bip．weizmann． ac． il / fldbin / findex )、
GOＲ ( http: / / npsa-pbil．ibcp．fr / cgi-bin / npsa _ automat．
pl? page = npsa _ gor4．html)、Phyre 2 ( http: / /www．sbg．
bio．ic．ac．uk / phyre2 / html / page．cgi? id = index)预测蛋白
的疏 /亲水性、跨膜结构域、折叠状态、二级结构、三级
结构;利用 ProDom ( http: / / prodom．prabi． fr / prodom /
current / html / form．Php)和 ScanProsite( http: / / prosite．
expasy．org / scanprosite /)预测蛋白结构域和模体。
1. 3 基因表达检测
根据目的基因序列设计实时荧光定量 PCＲ 引
物 ( QBCH-F: 5-GACTCTCCGGCGCCGCTAT-3 和
QBCH-Ｒ: 5-TTCCTCCAGGGCCGAAGCAG-3)。 分
别以毛竹根、茎、叶片、叶鞘和节，以及光照处理植株
叶片的 cDNA 为模板，采用 LightCycler 480 SYBＲ
Green I Master 实时荧光定量 PCＲ 试剂盒，进行实时
荧光定量 PCＲ 扩增。
反应体系(10 μL):Mix 5 μL，H2O 3. 2 μL，cDNA
1 μL，QBCH-F /QBCH-Ｒ 各 0. 4 μL (10 μmol·L － 1)。
PCＲ 反应在 qTOWEＲ 仪器上进行，反应程序:95 ℃
预变性 10 min;95 ℃变性 20 s，62 ℃退火 10 s，40 个
循环。同时，以 NTB 作为内参 ( Fan et al．，2013)。
反应结束后，应用 2 － △△ C t算法分析试验结果( Livak
et al．，2001)。
1． 4 基因植物表达载体构建
根据本实验室保存的植物表达载体 pC1301-
35S-OCS(由 pCAMBIA1301 改造引入启动子 35S 和
章鱼碱合成酶终止序列 OCS 而成)的多克隆位点以
及目的基因序列的酶切位点特征设计特异引物
( BCHFs: 5-ggtaccATGGCCGCAGGACTCTCCG-3，
BCHＲs: 5-ggatccAACACTCCTGTTCCGGTTGATTC
TC-3)，在目的基因编码区的 5和 3端分别添加
KpnⅠ和 BamHⅠ酶切位点，采用高保真酶进行 PCＲ
扩增，回收的扩增产物加 A 后连接到 pGEM-T easy
载体上，经测序验证后，用 KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切
将测序正确的克隆连入植物表达载体。
1． 5 拟南芥转化、检测
采用电击法将目的基因的植物表达载体质粒转
入农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens) EHA105 感受
态细胞中，转化拟南芥(Clough et al．，1998)。经连
续抗性(潮霉素 50 mg·L － 1)筛选植株，获得不分离
的 T3 代植株，提取总 ＲNA 并反转录成 cDNA，采用
ＲT-PCＲ 方法对目的基因的表达进行检测，同时以
质粒和野生型拟南芥作为对照。
1． 6 转基因拟南芥植株色素含量、荧光参数分析
对转基因植株进行色素含量的测定，采集长
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林 业 科 学 51 卷
势好的叶片，黑暗下称取约 0 ． 10 g 叶片，剪成长、
宽约为 0 ． 2 ～ 0 ． 4 cm 的碎片置于 10 mL 的离心管
中，加入 5 mL 的萃取液［丙酮 ∶ 酒精 = 1 ∶ 1 ( V /V)
混合液］，避光浸泡，至叶片完全失去绿色，期间黑
暗下颠倒混匀 2 ～ 3 次。以萃取液为空白对照，用
分光光度计测定其在 462 ． 5，470，474，485，665 nm
波长下的吸光值，并计算色素的含量(许元明等，
2013)。用 Imaging PAM 测定转基因植株叶片的叶
绿素荧光参数 Y(Ⅱ)和 NPQ，测定 5 株数据进行
分析。
2 结果与分析
2． 1 毛竹 PeBCH 基因编码区及其对应基因组序
列的获得
通过搜寻比对，获得了 1 个玉米 ( Zea mays)
BCH1 基因的毛竹同源序列 ( FP098087 )，命名为
PeBCH。该基因的全长 1 385 bp，5和 3非编码区的
长度分别为 37 bp 和 421 bp，编码区的长度为
927 bp。以毛竹叶片 cDNA 为模板，用引物 BCH-F
和 BCH-Ｒ 扩增，PCＲ 产物电泳结果显示，在 1 000
bp 左右有 1 条清晰条带，与目的基因片段大小一
致。测序结果分析表明，获得的序列与 FP098087 的
编码区完全一致。
以毛竹叶片基因组 DNA 为模板的 PCＲ 扩增产
物电泳显示，在 1 500 bp 左右有 1 条清晰条带，测序
结果目的片段为 1 566 bp。基因组序列结构分析显
示，该基因组序列包含 6 个外显子，5 个内含子分别
位于 403—517 bp，580—673 bp，879—1015 bp，
1142—1296 bp 和 1354—1491 bp(图 1)，内含子完
全符合 GT-AG 剪接原则(Moore et al．，1993)。
图 1 PeBCH 基因组 DNA 的结构
Fig． 1 Structure of PeBCH genomic DNA
2． 2 毛竹 PeBCH 基因编码蛋白性质与结构预测
分析
PeBCH 编码的蛋白含 308 个氨基酸，分子量和
理论等电点分别为 33． 8 kDa 和 9． 78。疏 /亲水性预
测表明，PeBCH 蛋白 N 端为疏水区，C 端为亲水区，
总体呈现亲水性。PeBCH 包含 3 个保守结构域
PDA0W9I6(9—65 aa)、PD095142 (111—175 aa)和
PD011050 (173—268 aa)，其 中 PD095142 和
PD011050 是 β －胡萝卜素羟化酶家族中的特征结
构域。另外，该蛋白中还含有 10 个保守的组氨酸残
基，这些组氨酸残基能够形成 2 组“HXXXXH”和
“HXXHH”模体，构成一个具有催化作用的结构域，
可能是该酶的催化位点。
结构预测显示，PeBCH 蛋白存在 4 个跨膜结
构，分 别 位 于 105—127 aa，142—164 aa，194—
211 aa，215—237 aa;含有无规则卷曲、延伸链和
α 螺旋共 3 种二级结构，其中无规则卷曲覆盖 144
个氨基酸残基(46. 75% )，α 螺旋覆盖 119 个氨基酸
残基 ( 38. 64% )，延伸链覆盖 45 个氨基酸残基
(14. 61% );折叠状态显示该蛋白具有比较稳定的
三级结构。
2． 3 毛竹 PeBCH 基因表达分析
实时荧光定量 PCＲ 结果表明，PeBCH 基因在毛
竹的新根、幼茎、叶片、叶鞘、节中均检测到表达，但
表达丰度存在着明显的差异，其中在叶片中的相对
表达丰度最高，叶鞘、幼茎和节中依次减少，而根中
的表达丰度最低(图 2)。
图 2 PeBCH 基因在毛竹不同组织中的表达
Fig． 2 PeBCH expression in different tissues of P． edulis
不同光照处理后，叶片中基因表达分析表明:随
着光强( ＜ 1 500 μmol·m － 2 s － 1 )的增大，PeBCH 基
因的表达丰度呈现上升的趋势;与对照组相比，黑暗
处理 PeBCH 基因的表达丰度最低;光强 100 μmol·
m － 2 s － 1处理后基因的表达丰度与对照相接近，光强
300 μmol·m － 2 s － 1处理后基因表达上升不明显，而
光强 500，1 000 μmol·m － 2 s － 1处理后基因的表达丰
度则上升明显，比对照组高 0． 5 ～ 1． 0 倍;但光强 1
500 μmol·m － 2 s － 1处理后，PeBCH 基因的表达丰度
显著下降，仅为对照的 5%，明显受到强光的抑制
(图 3)。
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第 10 期 孙化雨等: 毛竹 β －胡萝卜素羟化酶基因的分子特征及其功能
图 3 不同光照处理毛竹叶片中 PeBCH 基因的表达
Fig． 3 Expression of PeBCH in P． edulis leaves under different light
2． 4 PeBCH 基因在拟南芥中表达检测
为了进一步验证基因的功能，将 PeBCH 基因
克隆到植物表达载体 pC1301-35S-OCS 的多克隆
位 点，形 成 基 因 的 过 量 表 达 载 体 pC1301-35S-
PeBCH-OCS(图 4)，并在拟南芥中异位表达。经连
续抗性筛选获得了 T3 代抗性植株 4 个单株，
ＲT-PCＲ检测结果表明，转基因植株中均含有与阳
性对照一致的目的片段，而野生型拟南芥中没有
检测到(图 5)，表明 PeBCH 基因在转基因植株中
得到了表达。
图 4 PeBCH 的植物表达载体
Fig． 4 Plant expression vectors of PeBCH
图 5 转 PeBCH 拟南芥植株的 ＲT-PCＲ 检测
Fig． 5 ＲT-PCＲ detection of PeBCH transgenic Arabidopsis thaliana
M:DNA 分子量标准;1 － 4:转基因植株;5:质粒对照;6:野生型对
照;7:水对照。M: DNA molecular marker; 1 － 4: Transgenic plant; 5:
Plasmid control; 6: Wild type; 7: Water control．
2． 5 转基因拟南芥植株色素含量及叶绿素荧光参
数分析
表型分析发现，与 野生 型拟 南芥 相比，转
PeBCH 基因植株生长健壮，叶色较深。色素含量测
定结果表明，转基因植株的叶绿素、类胡萝卜、胡萝
卜素和叶黄素含量比野生型植株分别增加了
5. 0%± 0． 7%，26. 9% ± 4． 5%，38． 3% ± 5． 7%，
26. 9%± 8． 5%。
叶绿素荧光参数测定结果表明，在实验室环境
光强(145 μmol·m － 2 s － 1)下，转 PeBCH 基因植株的
实际光化学速率 Y(Ⅱ)虽比野生型有所增加，但没
有明显差异，而转基因植株的非光化学猝灭系数
NPQ 明显高于野生型植株，达到极显著水平 ( P ＜
0. 01)(图 6)。在强光(530 μmol·m － 2 s － 1)条件下，
转 PeBCH 基因植株与野生型的 Y(Ⅱ)也没有明显
差异，而 NPQ 的动力学曲线显示，转 PeBCH 基因植
株的 NPQ 明显高于野生型植株，且稳定后差异达到
极显著水平(P ＜ 0． 01)(图 7)。
图 6 实验室环境光下拟南芥叶绿素荧光参数比较
Fig． 6 Chlorophyll fluorescence parameters comparison of
A． thaliana under laboratory light
＊＊，极显著水平(P ＜ 0． 01) Significant differences
(P ＜ 0． 01) compared to that of wild type．
图 7 强光下拟南芥 NPQ 随时间的变化比较
Fig． 7 Comparison of NPQ changes of
A． thaliana under high light
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林 业 科 学 51 卷
3 讨论
全球环境的变化使得高产、优质、抗逆林木品种
的选育工作显得尤为重要。自然条件下，光效率的
调节随时在发生，植物 PSⅡ光化学效率下降的发生
和玉米黄质的积累之间存在着密切联系 (Demmig-
Adams et al．，2012)。BCH 是叶黄素循环之外的又
一个玉米黄质生物合成的重要酶基因，基因的分子
特征决定着其编码蛋白的结构和功能。对毛竹叶黄
素循环关键酶基因———紫黄质脱环氧化酶基因的研
究表明，该基因的体外表达产物具有将紫黄质经中
间体花药黄质转化为玉米黄质的生物学活性 (Gao
et al．，2013)。本研究虽然对 PeBCH 编码蛋白进行
了生物信息学分析，但其生物活性如何，尚需要通过
试验进一步验证。
启动子是参与特定基因转录及其调控的序列，
通过其所含作用元件的分析可以预测影响基因表达
的环境因素。对 PeBCH 启动子序列(转录起始位点
上游 2 000 bp 序列)中作用元件的分析发现，其中
存在 3-AF1 binding site，Box Ⅰ，GAG-motif，GATA-
motif，GT1-motif，Ⅰ-box，Sp1，as-2-box，Box 4 和
LAMP-element 等多种光应答元件，以及参与光应答
的 ACE 和 G-box 顺式作用元件，因此推测 PeBCH 在
毛竹中的表达可能受到光的调节。不同光处理后对
PeBCH 表达检测结果表明，该基因的表达受到光照
的 诱 导， 随 着 处 理 强 度 增 加 ( 0 ～
1 000 μmol·m － 2 s － 1)而呈现上升的趋势，但光强
1 500 μmol·m － 2 s － 1处理 2 h 后，其表达受到严重抑
制，这可能是光照强度过强引起的。
NPQ 是反映逆境胁迫条件下植物热耗散能力
的重要荧光参数。本研究中，过量表达 PeBCH 的转
基因拟南芥植株的 NPQ 明显增加，这意味着转基因
植株热耗散的能力提高，抵抗强光逆境的自我保护
能力相对增强，这与过量表达 BCH 基因 DSM2 的水
稻(Oryza sativa)的表现一致(Du et al．，2010)。究
其原因，在拟南芥中有 3 个催化 β － 胡萝卜素生成
玉米黄素的相关基因 ( BCH1，BCH2，CYP97A3)，但
它们之间功能存在冗余(Kim et al．，2009)，而毛竹
PeBCH 基因的过量表达促进了胡萝卜素向玉米黄
素的转化，使得其含量增加，抗光胁迫能力增强。同
时，转 PeBCH 基因拟南芥植株叶片的叶绿素、类胡
萝卜、胡萝卜素和叶黄素含量比野生型植株均有所
增加，使得 PSⅡ中的天线色素含量增加，吸收光能
的总量提高，有助于增强光化学效率，其 Y(Ⅱ)值略
有增加证明了这一点。本研究为培育抵抗强光胁迫
的植物新品种提供了新的基因资源，对于今后竹类
植物的分子育种具有重要参考价值。
参 考 文 献
冯唐锴，李思光，汪艳璐，等 ． 2007． 南丰蜜橘 β －胡萝卜素羟化酶
基因的克隆和序列分析 ． 西北植物学报，27(2) : 238 － 243．
(Feng T K，Li S G，Wang Y L，et al． 2007． Cloning and sequence
analysis of β-carotene hydroxylase gene from Nanfeng orange (Citrus
reticulata Blanco var． kinokuni ( Tanaka ) H． H． Hu ) ． Acta
Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，27 ( 2 ) : 238 － 243． ［in
Chinese］)
高志民，范少辉，高 健，等 ． 2006． 基于 CTAB 法提取毛竹基因组
DNA 的探讨 ． 林业科学研究，19(6) : 725 － 728．
(Gao Z M，Fan S H，Gao J，et al． 2006． Extract genomic DNA from
Phyllostachys edulis by CTAB-based method． Forest Ｒesearch，
19(6) :725 － 728． ［in Chinese］)
徐昌杰，陈昆松，张上隆，等 ． 2003． 甜橙 β － 胡萝卜素羟化酶
cDNA 克隆及其瞬间反义表达 ． 农业生物技术学报，11 ( 6 ) :
593 － 597．
(Xu C J，Chen K S，Zhang S L，et al． 2003． Cloning of β-carotene
hydroxylase cDNA from orange ( Citrus sinensis) and its transient
antisense expression． Journal of Agricultural Biotechnology，11(6) :
593 － 597． ［in Chinese］)
许元明，韦友欢，曾加源 ． 2013． 三种植物叶片类胡萝卜素含量的
比较分析 ． 广西民族师范学院学报，30(3) :18 － 19．
(Xu Y M，Wei Y H，Zeng J Y． 2013． Comparative analysis on the
content of carotenoid in the leaves of the three general plants．
Journal of Nanning Junior Teachers College，30(3) : 18 － 19． ［in
Chinese］)
Clough S J，Bent A F． 1998． Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana． Plant
J，16(6) : 735 － 743．
Davison P A，Hunter C N，Horton P． 2002． Overexpression of beta-
carotene hydroxylase enhances stress tolerance in Arabidopsis．
Nature，18(6894) : 203 － 206．
Demmig-Adams B，Cohu C M，Muller O，et al． 2012． Modulation of
photosynthetic energy conversion efficiency in nature: from seconds
to seasons． Photosynth Ｒes，113(1 － 3) : 75 － 88．
Demmig B，Winter K，Krüger A， et al． 1987． Photoinhibition and
zeaxanthin formation in intact leaves: a possible role of the
xanthophyll cycle in the dissipation of excess light energy． Plant
Physiol，84(2) : 218 － 224．
Du H，Wang N L，Cui F，et al． 2010． Characterization of the β-carotene
hydroxylase gene DSM2 conferring drought and oxidative stress
resistance by increasing xanthophylls and abscisic acid synthesis in
rice． Plant Physiol，154(3) : 1304 － 1318．
Fan C，Ma J，Guo Q，et al． 2013． Selection of reference genes for
quantitative real-time PCＲ in bamboo (Phyllostachys edulis) ． PLoS
One，8(2) : e56573．
Gao Z M，Li X P，Li L B，et al． 2006． An effective method for total
ＲNA isolation from bamboo． Chinese Forest Sci Tech，5(3) : 52 －
54．
Gao Z M，Liu Q，Zheng B，et al． 2013． Molecular characterization and
85
第 10 期 孙化雨等: 毛竹 β －胡萝卜素羟化酶基因的分子特征及其功能
primary functional analysis of PeVDE，a violaxanthin de-epoxidase
gene from bamboo (Phyllostachys edulis) ． Plant Cell Ｒep，32(9) :
1381 － 1391．
Hieber A D，Kawabata O，Yamamoto H Y． 2004． Significance of the
lipid phase in the dynamics and functions of the xanthophyll cycle as
revealed by PsbS overexpression in tobacco and in-vitro de-
epoxidation in monogalactosyldiacylglycerol micelles． Plant Cell
Physiol，45 (1) : 92 － 102．
Kim J，Smith J J，Tian L，et al． 2009． The evolution and function of
carotenoid hydroxylases in Arabidopsis． Plant Cell Physiol，50(3) :
463 － 79．
Li Q， Farre G， Naqvi S， et al． 2010． Cloning and functional
characterization of the maize carotenoid isomerase and beta-carotene
hydroxylase genes and their regulation during endosperm maturation．
Transgenic Ｒes，19(6) : 1053 － 1068．
Livak K J，Schmittgen T D． 2001． Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCＲ and the 2 － △△Ct method．
Methods，25(4) : 402 － 408．
Moore M J，Query C C，Sharp P A． 1993． Splicing of precursors to
mＲNA by the spliceosome / /Gesteland Ｒ F，Atkins J F． The ＲNA
world． Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press，
303 － 357．
Pogson B J，Ｒissler H M． 2000． Genetic manipulation of carotenoid
biosynthesis and photoprotection． Philos Trans Ｒ Soc Lond B Biol
Sci，355(1402) : 1395 － 1403．
Pons E，Alquézar B，Ｒodríguez A，et al． 2014． Metabolic engineering of
β-carotene in orange fruit increases its in vivo antioxidant properties．
Plant Biotechnol J，12(1) : 17 － 27．
Powles S B． 1984． Photoinhibition of photosynthesis induced by visible
light． Annu Ｒev Plant Physiol，35: 15 － 44．
Spreitzer Ｒ J， Salvucci M E． 2002． Ｒubisco: structure， regulatory
interactions，and possibilities for a better enzyme． Annu Ｒev Plant
Biol，53: 449 － 475．
Sun Z，Gantt E，Cunningham F X Jr． 1996． Cloning and functional
analysis of the beta-carotene hydroxylase of Arabidopsis thaliana． J
Biol Chem，271(40) : 24349 － 24352．
Tian L，DellaPenna D． 2004． Progress in understanding the origin and
functions of carotenoid hydroxylases in plants． Arch Biochem
Biophys，430(1) : 22 － 29．
Tian L，Magallanes-Lundback M，Musetti V，et al． 2003． Functional
analysis of beta- and epsilon-ring carotenoid hydroxylases in
Arabidopsis． Plant Cell，15(6) : 1320 － 1332．
(责任编辑 徐 红)
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