全 文 ：中国农学通报 2011,27(7):442-446
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
金柑（Fortunella japonica）又名金橘、金枣、金弹，
属芸香科（Rutaceae）金柑属（Fortunella）植物，原产于中
国，已有1600多年的栽培历史[1-2]。福建尤溪是著名的
中国金柑之乡。金柑富含黄酮类化合物、色素、香精油
等活性成分。近年研究表明金柑黄酮有恢复免疫力、
抗氧化、抗菌、调节血糖含量和改善糖耐量等作用[3-7]。
黄酮类化合物的结构、来源不同，因而应根据其极
性和水溶性，选择合适的溶剂提取。目前，主要的提取
方法有醇类提取、热水提取、碱性稀纯或碱性水提取、
系统溶剂提取等；分离纯化黄酮类化合物的方法有柱
层析、薄层层析、铅盐沉淀、硼酸络合、pH梯度萃取、
HPLC、液滴逆流层析（DCCC）、大孔树脂吸附法等[1,7]。
酶提取方法与传统的方法相比，具有无毒性、效
率高、反应条件温和、催化活力可调节控制等优点。
然而有关酶法技术在黄酮类物质中已应用于紫苏、油
松花粉、银杏叶、甜茶、柑橘等植物上 [8-11]。其中柑橘
应用于温州蜜柑、甜橙，未见其应用于金柑、宽皮桔
上，不同品种间因素与最佳工艺有所差异[8]。苏东林
等以温州蜜柑为原料，对乙醇-纤维素酶溶液提取柑
桔皮总黄酮工艺进行研究[8-11]。不同品种植物的提取
工艺存在差异。因此本试验重点对纤维素酶辅助提
取金柑皮黄酮工艺进行研究，为金柑的进一步开发利
用提供支持。
酶法辅助提取金柑皮总黄酮的工艺优化研究
陈 源 1,2，潘东明 1，郭金鹏 1，林 俊 1
（1福建农林大学园艺学院，福州 350002；2福建省农业科学院农业工程技术研究所，福州 350003）
摘 要：采用纤维素酶辅助提取技术进行金柑皮总黄酮提取工艺研究。以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH可见光
分光光度显色法测定总黄酮含量，选用单因素试验探索料液比、温度、乙醇浓度、酶量和提取时间对金柑
黄酮提取率的影响，并在此基础上开展正交试验对工艺条件进行优化。结果表明，各因素对提取效果影
响由大到小依次为：乙醇浓度>温度>料液比>酶用量>提取时间，最佳提取工艺条件为：乙醇浓度是
70%，料液比1:35，酶用量75 U/mL、温度50℃，提取时间100 min，黄酮得率为1.39%，平均回收率103%。
关键词：金柑；黄酮；纤维素酶
中图分类号：TS255.4 文献标志码：A 论文编号：2011-0210
Study on Optimal Enzyme Extracting Technology of Flavonoids in Kumquat Peel
Chen Yuan1,2, Pan Dongming1, Guo Jinpeng1, Lin Jun1
(1College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;
2Agricultural Engineering Research Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003)
Abstract: With Fortunella japonica skin powder as raw material, ethanol-extracted cellulose solution
Fortunella japonica flavonoids from the study. Single factor tested to determine the impact of the extraction rate
of the main process parameters, namely ethanol concentration, water temperature, solid to liquid ratio, enzyme
amount, and extraction time, and on this basis to L16(45) orthogonal test. Optimum conditions for the optimum
temperature was 50℃, 70% ethanol concentration, solid to liquid ratio of 1:35, enzyme concentration 75 U/mL,
extraction time 100 min, can achieve the best extraction effect.
Key words: Fortunella japonica; flavone; fibrin enzyme
基金项目：国家科技支撑计划课题——台湾保鲜新技术在亚热带果蔬上的应用研究（2007-07B06）。
第一作者简介：陈源，女，1981年出生，助理研究员，研究生。从事果树天然产物研究。通信地址：350003 福建省农科院农业工程技术研究所，
E-mail：katecy@163.com。
通讯作者：潘东明，男，1956年出生，籍贯：福建永春人，职称：教授，研究方向：果树采后生理：。通信地址：350003福建农林大学研究生处，E-mail：
pdm666@126.com。
收稿日期：2011-01-21，修回日期：2011-04-01。
陈 源等：酶法辅助提取金柑皮总黄酮的工艺优化研究
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究试验于 2010年在福州进行。金柑产于福建
尤溪。
1.2 试验设计
1.2.1 单因素试验 通过预备试验，确定纤维素酶用量、
乙醇浓度、料液比、水浴温度、提取时间进行试验，重复
提取 2次，9000 r/min下离心 15 min，合并上清液，定
容，紫外分光光度法测定提取液中总黄酮浓度，计算得
率。
1.2.2 正交实验设计 根据单因素考察结果进行正交实
验设计，以总黄酮提取率为指标，选择乙醇浓度、料液
比、提取时间、酶用量、水浴温度等5个影响因素按5因
素4水平进行正交试验设计，计算总黄酮得率，并对结
果进行分析，求出最佳提取工艺。
1.3 试验方法
（1）酶提取黄酮工艺流程：金柑清洗除杂→切片→
干燥→磨成粉末→按一定料液比加溶剂→加酶处理→
离心→取滤液定容→黄酮类化合物测定。
（2）芦丁标准曲线的绘制。称取 10 mg芦丁，用
70%乙醇溶解后定容至 100 mL。之后将芦丁溶液用
70%乙醇稀释成 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、
50 μg/mL，各吸取 1 mL于试管中，加 70%乙醇 1 mL，
加入0.3 mL 5%亚硝酸钠，6 min后加入0.3 mL 10%亚
硝酸铝，6 min后再加入 2 mL 2 mol/L氢氧化钠，
10 min后于分光光度计波长 510 nm下测吸光值OD。
绘制浓度—OD标准曲线（图1）。
（3）黄酮的测定。从提取液中吸取 1 mL，加入
1 mL 70%酒精，加入 0.3 mL 5%亚硝酸钠，静置 6 min
后，加入 0.3 mL 10%亚硝酸铝，再静置 6 min后，加入
2 mL 2 mol/L氢氧化钠，放置 10 min后在 510 nm下测
吸光值。
提取率 = (C - 0.004)V
1.5M
× 100%
式中：E为提取率，V提取液体积，C吸光度，M样
品质量。
（4）加样回收试验。准确称取金柑黄酮 5份，将
100 mg芦丁定容到100 mL，制备芦丁标准品溶液。分
别加入一定量的芦丁标准品溶液，按最佳提取工艺制
备,进行总黄酮含量的测定，计算回收率。
1.4 精密仪器和药品规格
TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有
限责任公司）；BPG-9140A电热鼓风干燥箱（上海恒科
技有限公司）；Sartorius BS224S分析天平（德国赛多利
斯）；FW100高速万能粉碎机（泰斯特仪器有限公司）；
ALLEGRATM64R高速冷冻离心机（美国BECKMAN
公司）；AKWL-IV-50艾柯超纯水系统（成都康氏康宁
科技发展有限公司）。
芦丁（生化试剂，Sigma）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸
钠、氢氧化钠（试验所用试剂及药品均为分析纯），酶
（无锡酶制剂厂，1.5万U/g）
2 结果与分析
2.1 酶提取的单因素试验
分别对酶用量、水浴温度、乙醇浓度、料液比、提取
时间进行单因素试验。
2.1.1 加酶量对金柑皮总黄酮得率的影响 溶液添加不
同浓度的霉液，在 1:25的料液比、温度 50℃、70%乙醇
的条件下提取120 min，测定溶液中总黄酮含量。提取
介质中不同纤维素酶浓度对总黄酮得率的影响如图
2。
由图 2可以看出，从 45 U/mL到 75 U/mL，金柑皮
总黄酮提取率增大，当加酶量为75 U/mL时，黄酮得率
y = 0.0015x + 0.0004R2 = 0.9993
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 100 200 300
浓度/(礸/mL)
吸
光
度
/(μg/ L)
图1 总黄酮标准曲线
图2 加酶量对总黄酮得率的影响
1.2
1.25
1.3
1.35
1.4
1.45
40 60 80 100 120
酶用量(U/mL)
黄
酮
得
率
/%
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最高；另外还可看出，当加酶量大于 75 U/mL，随着加
酶量的增加，样品浓度对酶没有达到饱和，抑制酶的活
性，使金柑皮总黄酮得率反而下降。
2.1.2 水浴温度对金柑皮总黄酮提率的影响 在乙醇浓
度70%、酶用量75 U/mL、料液比1:25、提取120 min的
条件下，采用不同的温度进行提取，测定最终提取液中
黄酮含量。不同水浴温度对总黄酮得率的影响见图
3。
何卫中等的研究结果表明，乙醇体积分数较低时，
纤维素酶的活性随温度变化不明显；乙醇体积分数较
高时（如超过 40%），酶活损失比较明显[13]。但较低乙
醇体积分数与较高温度或较高乙醇体积分数与较低温
度的协同作用对酶有激活作用,这与作者的研究结果
一致。由图3可以看出，随着水浴温度的提高，金柑皮
总黄酮得率逐渐升高，在50℃时总黄酮得率最高，水浴
温度继续提高时，总黄酮的提取率开始下降。由此，
50℃酶的活性最强，作为酶辅助提取的最佳温度。
2.1.3 乙醇浓度对金柑皮黄酮得率的影响 在酶用量
75 U/mL、提取 120 min、50℃、1:25的料液比提取的条
件下采用不同浓度的乙醇溶液对金柑皮提取总黄酮，
测定提取液中总黄酮含量。结果如图4。
从图 4可以看出，金柑总黄酮得率提取量随乙醇
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
30 40 50 60 70
水浴温度/℃
黄
酮
得
率
/%
图3 温度对总黄酮提取率的影响 图4 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
0.5
1
1.5
2
2.5
60 70 80 90 100
乙醇浓度/%
黄
酮
得
率
/%
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 1:50
液料比/(g/mL)
黄
酮
得
率
/%
0.92
0.96
1
1.04
1.08
1.12
1.16
60 80 100 120 140
时间/min
黄
酮
得
率
/%
浓度的增加而提高，超过 70%开始下降。这是由于乙
醇浓度过高会降低酶的活性，也会是一些脂溶性杂质
溶出，增加溶剂的阻力，减缓提取液中提取溶剂的扩
散，降低样品和提取液之间的浓度差，使黄酮总提取率
下降。因此选择70%为最佳乙醇浓度。
2.1.4 料液比对金柑皮黄酮得率的影响 在乙醇浓度
70%、酶用量 75 U/mL、提取时间 120 min、提取温度
50℃的条件采用不同的料液比下提取金柑皮黄酮，测
定最终提取液中黄酮含量。结果见图5。
图5表明，在图中所示的范围内料液比越大，金柑
总黄酮得率越高，但在 1:35达到峰值，此时大量的有
效成分基本全部溶出，继续增加料液比，此时增加酶的
浓度加大，提取率逐渐减小，但变化不大，因此1:35为
较合适的料液比。
图5 料液比对总黄酮提取率的影响 图6 提取时间对总黄酮提取率的影响
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陈 源等：酶法辅助提取金柑皮总黄酮的工艺优化研究
2.1.5 提取时间对金柑皮黄酮得率的影响 提取时间太
短影响酶解效果，太长不利于工业化生产，因此合适的
酶解时间可使酶解彻底的同时，又能节约时间[14]。在
乙醇浓度 70%、酶用量 75 U/mL、料液比 1:35、提取温
度50℃的条件下采用不同的提取时间，测定最终提取
液中黄酮含量，结果如图 6。由于提取时间的延长到
120 min后，时间进一步延长，黄酮得率却有些下降。
因此选120 min为最佳提取时间。
2.2 黄酮类化合物提取工艺的优化
单因素试验表明，酶用量、水浴温度、乙醇浓度、料
液比、提取时间等因素对金柑黄酮类化合物的提取均
有影响，因此在单因素试验的基础上，设计了 5因素 4
水平的正交试验，以酶解后黄酮得率为考察指标，对金
柑皮总黄酮提取工艺进行研究。选用正交试验L16(45)
进一步研究它们之间的影响，因素水平表见表1，正交
试验结果见表2。
选用L16(45)正交表进行试验方案设计，正交试验
中各因素对提取结果的影响和前面的单因素试验结果
趋势相同。5种因素对提取结果影响大小依次为：乙
醇浓度>温度>料液比>酶用量>提取时间。综合上述
试验结果与分析，得出酶提取黄酮的最佳优化工艺条
件为A1B2C3D4E2，70%乙醇、酶用量 75 U/mL、料液比
水平
1
2
3
4
因素
A乙醇浓度/%
70
75
80
85
B酶用量/(U/mL)
60
75
90
105
C料液比/(g:mL)
1:25
1:30
1:35
1:40
D温度/℃
35
40
45
50
E提取时间/min
80
100
120
140
表1 正交试验因素水平表
表2 正交试验结果
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
K1
K2
K3
K4
R
因素
A乙醇浓度
1
1
1
1
1
1
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
1.86417
0.58667
1.2225
1.185
1.2775
B酶用量
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
14.15
15.05
15
14.1
0.0792
C料液比
1
2
3
4
2
1
4
3
3
4
1
2
4
3
2
1
1.13
1.2325
1.27083
1.225
0.1408
D温度
1
2
3
4
3
4
1
2
4
3
2
1
2
1
4
3
1.25417
1.09167
1.23083
1.28167
0.19
E提取时间
1
2
3
4
4
3
2
1
2
1
4
3
3
4
1
2
1.19583
1.22417
1.2175
1.22083
0.0283
黄酮得率/%
1.16
1.21
1.37
1.31
1.19
1.21
1.28
1.06
1.32
1.27
1.06
1.24
1.04
1.33
1.29
1.09
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1:35、50℃、100 min能达到最佳提取效果。
对试验数据进行方差分析，发现除提取时间、酶浓
度外，其余的因素概率均小于0.01。其中乙醇浓度和提
取温度为极显著因素，因素的显著性依次为乙醇浓度、
温度、料液比、酶用量、时间。方差分析结果见表3。
2.3 加样回收试验
加样回收率试验表明,最佳工艺的平均回收率为
103%，RSD1.49%。说明该提取方法精密度和提取率
均较高,适用于金柑皮总黄酮的提取。
3 结论
各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为乙醇
浓度>温度>料液比>酶用量>提取时间。纤维素酶提
取金柑皮黄酮的最佳工艺参数为 70%乙醇，酶用量
75 U/mL，料液比1:35，温度50℃，提取时间100 min，黄
酮得率达1.39%，平均回收率103%。单一的纤维素酶
作用好于果胶酶，水浴温度都在50℃，提取时间较少。
4 讨论
纤维素酶与醇提法相结合的提取工艺，是近年来
柑橘提取的新方法，用适当浓度的乙醇溶液作为酶反
应溶剂加快酶解速度，提高乙醇的提取效率。乙醇和
纤维素酶的相互作用使得柑橘皮总黄酮的提取率高于
变异来源
区组
乙醇浓度
酶用量
料液比
温度
时间
误差
总和
平方和
0.0047
9.8061
0.0677
0.129
0.2573
0.0059
0.23296
0.74459
自由度
2
3
3
3
3
3
30
均方
0.00235
3.2687
0.02257
0.04299
0.08576
0.00196
0.00777
F值
420.9308
2.9064
5.5363
11.04362
0.2529
显著水平
0
0.05085
0.0038
0.00005
0.85864
表3 平均值差异显著性比较
表4 回收率试验结果
次数
1
2
3
样品量/mg
10
10
10
加入芦丁对照品量/mg
1
2.5
5
回收芦丁对照品量/mg
1.05
2.88
5.65
回收率/%
104
103
101
平均回收率/%
103
RSD/%
1.49
传统的方法。苏东林等对温州蜜柑、赣南‘纽荷尔’脐
橙、湘西椪柑等品种的酶解提取相比，各因素对酶提取
效果的影响主要的因素为酶浓度>温度>时间，乙醇浓
度大都在 60%~80%之间，时间都在 100 min左右。由
于各柑橘品种果皮的结构、类黄酮含量和纤维素酶来
源的差异，主要的因素影响为温度>酶浓度>时间，同
时使料液比、提取温度、提取率有很大的差异。因此研
究利用酶辅助提取金柑黄酮类化合物的工艺，为金柑
中黄酮类化合物的开发利用提供了初步参考。作者是
将酶解技术直接作为提取方法，也可尝试将纤维素酶
与快速溶剂提取法、超声法、回流法等提取方法结合使
用以获得更高的提取率[15-16]。金柑中黄酮类化合物的
分离纯化和各种单体结构有待于进一步深入研究。
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