全 文 ：果 树 学 报 2011，28（4）: 563～567
Journal of Fruit Science
中越金柑种质资源的 ISSR分析
黄桂香，郭丽英，张树伟，何新华，周瑞阳 *，陈 虎，杨春奖
（广西大学农学院， 南宁 530004）
摘 要: 为了更好地利用和创新金柑种质资源，用 ISSR 分子标记技术分析了 25 份来自中越金柑属种质资源与金弹
变异系的亲缘关系及特异性。 从 100 条引物中筛选出 10 条多态性好、扩增清晰的引物。 结果显示，10 条引物共扩增
出 120 条带，其中 102 条具有多态性，多态性带比率为 85%。 用 UPGMA 软件进行聚类分析，25 份金柑种质资源的遗
传相似系数在 0.48～0.99，在遗传系数为 0.85 水平处将 25 份供试资源划分为 8 类，对聚类结果进行分析。 中越边境
野生山桔资源可能为金柑属的新种类或变种。
关键词: 金柑； 种质资源； ISSR； 亲缘关系； 金弹变异系
中图分类号：S666．1 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2011)04－563－05
Genetic relationship analysis of Fortunella germplasm resources from
China and Vietnam by ISSR markers
HUANG Gui -xiang， GUO Li -ying，ZHANG Shu -wei， HE Xin -hua， ZHOU Rui -yang*，CHEN Hu，
YANG Chun-jiang
（College of Agriculture， Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004 China）
Abstract: In order to make good use and innovate germplasm resources of kumquat，the genetic relation-
ships of 25 Fortunella Swingle germplasm resources from China and Vietnam and the variation accessions
of F. crassifolia Swingle were examined by ISSR markers in this study. Of the 100 ISSR primers screened，
only 10 primers gave reproducible， polymorphic DNA amplification patterns with a total of 120 amplified
bands. The percentage of polymorphic band was 85% . By banding patterns obtained from these 10
primers， each accession could be distinguished from the others. The genetic similarity ranged from 0.48 to
0.99 UPGMA relationship tree was established based on the similarity coefficients. At the coefficient level
of 0.85， the 25 germplasm resources were divided into 8 groups. The classification results were discussed
in this paper. Shanju （Fortunella Swingle） found along the border between China and Vietnam could be a
new variety or species of Fortunella Swingle.
Key words: Fortunella Swingle； Germplasm resources； ISSR； Genetic relationship； Variation of F. cras-
sifolia Swingle
金柑为芸香科 （Rutaceae） 柑橘亚科 （Auran-
tioideae）金柑属（Fortunella Swingle）植物，该属共有
4个种和 2个杂种[1]，或分为 6个种 1变种[2]。金柑一
年能多次开花多次结果。 其树姿优美，常年花、果同
生，果实形美色艳，有吉祥喜庆之寓意[3]。金柑果实营
养价值极高，风味独特，是鲜食、加工及观赏的多用
果树。
金柑原产我国，栽培历史悠久，分布范围广，然
而目前生产上栽培的金柑优良品种极少， 主要鲜食
品种只有金弹 1种，严重限制了产业的可持续发展。
为了更好地利用金柑属野生种质、 引进资源及栽培
种的变异系， 以选育出满足消费者需求的鲜食、加
工、观赏及多用型的金柑新品种，有必要对收集到的
金柑属资源特别是野生种质、 栽培种的变异系进行
亲缘关系分析。 其中，对中越边境金柑野生资源、越
南金柑资源及金弹变异系的遗传分析尚未见报道。
收稿日期： 2010－12－07 接受日期: 2011－04－18
基金项目： 广西自然科学基金项目（编号：桂科自 0991040）；科技部国际合作项目（编号：2008DFA30900）；广西研究生创新项目（编号：
2008105930901D21）
作者简介： 黄桂香，女，副教授，在读博士生，主要从事果树种质资源与遗传育种研究。 Tel: 13707818803，E-mail: hguixiang@163.com
觹 通讯作者。 Author for correspondence． E-mail: ry_zhou@tom.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2011.04.013
果 树 学 报 28 卷
表 1 供试材料名称及来源
Table 1 Name and origin of the materials
我们采用 ISSR-PCR 分析方法，对 25 份不同来
源的金柑资源进行亲缘关系及特异分子标记分析，
为金柑属种质资源的合理利用及新品种选育提供理
论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
25 份供试资源分别来自广西融安、阳朔；广东
顺德、 广西大学、 中国农业科学院柑桔研究所及越
南。 其详细信息见表 1。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA的提取和检测 参考前人[4-5]的方
法，采健康幼嫩的叶片，用改良 CTAB[6]法提取金柑
叶片基因组 DNA， 用 1%琼脂凝胶电泳检测 DNA，
用紫外分光光度计测定 DNA 浓度与纯度。 最后将
DNA稀释至 50 mg·L-1，于-20℃冰箱备用。
编号
Code
资源名称
Name & species
来源地
Origin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
融安金柑 Ronganjingan
融安滑皮金柑 Ronganhuapijingan
融安滑皮金柑珠心苗 Nucellar seedling of Ronganhuapijingan
阳朔金柑 1 Yangshuojingan1
阳朔金柑 2 Yangshuojingan2
阳朔金柑 3 Yangshuojingan3
长寿金柑 F. obovata Tanaka
长寿金柑珠心苗 Nucellar seedling of F. obovata Tanaka
金枣 F. margarita Swingle
金枣实生苗 Seedling of F. margarita Swingle
山橘 Shanju
诱变金柑 1 Youbianjingan 1
诱变金柑 2 Youbianjingan 2
四季橘 Calamondin
越南金柑 1 Yuenanjingan 1
越南金柑 2 Yuenanjingan 2
越南金柑 3 Yuenanjingan 3
越南金柑 4 Yuenanjingan 4
越南金柑 5 Yuenanjingan 5
越南金柑 6 Yuenanjingan 6
宁波罗纹 Ningboluowen
福建金豆 Fujianjindou
金豆（2002-29） Jindou(2001-29)
金豆（2002-30） Jindou（2002-30）
金豆（2002-36） Jindou（2002-36）
融安 Rongan
融安 Rongan
广西大学 Guangxi university
阳朔 Yangshuo
阳朔 Yangshuo
阳朔 Yangshuo
顺德 Shunde
广西大学 Guangxi university
顺德 Shunde
广西大学 Guangxi university
中越边境 Sino-vietnam border
广西大学 Guangxi university
广西大学 Guangxi university
广西大学 Guangxi university
越南 Vietnam
越南 Vietnam
越南 Vietnam
越南 Vietnam
越南 Vietnam
越南 Vietnam
中国农业科学院柑桔研究所 Citrus Research Institute，
CAAC(Chinese Academy of Agricultural Sciences)
中国农业科学院柑桔研究所 Citrus Research Institute， CAAC
中国农业科学院柑桔研究所 Citrus Research Institute， CAAC
中国农业科学院柑桔研究所 Citrus Research Institute， CAAC
中国农业科学院柑桔研究所 Citrus Research Institute， CAAC
1.2.2 引物筛选 本试验选用的 100 条 ISSR 引物
由上海生物工程有限公司合成， 经过反复试验筛选
出 10 条多态性较好的引物用于供试种金柑质资源
遗传多样性分析。
1.2.3 PCR 扩增 采用以下优化后的反应体系进
行 PCR 扩增 : DNA （ 50 mg·L-1）1.0 μL、10×buffer
（含 Mg2 + ） 2.0 μL、4.0 mmol·L -1 dNTP 0.5 μL、30
μmol·L-1引物 1 μL、DNA 聚合酶 （ 2.5 U·μL-1） 0.4
μL，加水至 20 μL。 PCR扩增程序为: 94 ℃预变性 4
min；94 ℃变性 50 s，复性退火温度 1 min，72 ℃延伸
2 min，循环 35 次；72 ℃ 延伸 7 min。 扩增反应结束
后，在扩增产物中加入 4 μL 溴酚蓝混匀，取 8 μL 扩
增产物在 1.8%琼脂糖凝胶中电泳， 电极缓冲液为
1×TAE，EB染色，拍照。
1.2.4 资源的聚类分析 谱带记录以电脑记录的荧
光条带为依据，有条带则多态性记为“l”，空缺时记
为 “0”， 把得到的 0，1 矩阵输入 NTsys 2.10e，用
NTsys 2.10e 软件计算遗传相似性系数， 并用 UPG-
MA程序构建聚类图。
2 结果与分析
2.1 引物筛选及 ISSR-PCR多态性分析
从 100条 ISSR引物中筛选出 10 个条带清晰多
态性好、比较稳定的引物，用其对所有供试资源进行
ISSR-PCR 扩增，共扩增出 120 个条带，其中具有多
态性的共 102 个条，多态性比率为 85%。 平均每条
引物可获得 12 个条带， 平均多态性条带为 10.2 个
（表 2），扩增产物条带介于 100～2 000 bp（图 1）。 其
中引物 U812 扩增出的多态性比例最大， 达 100%。
说明供试样品遗传多样性较丰富。
564
4 期 黄桂香等: 中越金柑种质资源的 ISSR 分析
表 2 10 条 ISSR 引物序列及扩展结果
Table 2 The sequences of 10 ISSR primers and amplified results
图 1 引物 U834 扩增金柑种质资源的 ISSR 电泳分析
M. DL 2 000 marker； 1~24. 代表的样品名称参见表 1
Fig.1 Electrophoresis pattern amplified from fortunella germplasm resources with primer U834
M. DL 2 000 marker； 1 to 24. Correspond to the order of Fortunella germplasm resources in table 1
2.2 亲缘关系分析
用 Ntedit软件计算 10 条 ISSR 引物扩增结果在
每个供试资源之间的相似系数， 结果显示: 在 25 份
供试材料中， 不同资源间遗传相似系数为 0.48~
0.99。 用 UPGMA法构建亲缘关系树状图（图 2）。 在
遗传相似系数为 0.85 水平上，25 份资源可分为 8
组:第 1组，融安金柑、阳朔金柑 1、阳朔金柑 2、阳朔
金柑 3、融安滑皮金柑及其珠心苗、诱变金柑 1、诱变
金柑 2；第 2 组，金枣及其实生后代、越南金柑 6、宁
波罗纹；第 3组，长寿金柑及其实珠心苗；第 4 组，福
建金豆；第 5 组，金豆（2002-29）、金豆（2002-30）和
金豆（2002-36）；第 6组，山橘。 第 7组，四季橘；第 8
组，越南金柑 1~5。 第 1 组中，融安滑皮金柑与阳朔
金柑 1和融安金柑的遗传相似系数大， 分别为 0.98
和 0.97，证明其为金弹的变异系，诱变金柑 1 与融安
金柑的遗传相似系数最大，为 0.95，从引物 U834 扩
增结果看，诱变金柑 1 与融安金柑、阳朔金柑比较，
多 1 条特异带（图 1 箭头处），说明已发生一定的变
异，其遗传特性有待进一步研究；第 2 组中，越南金
柑 6与金枣、宁波罗纹聚在一起，但与金枣实生苗的
遗传相似系数较大，为 0.90，其叶片及果实形态与金
枣的相似度也很高， 应为同一起源或系金枣实生变
异，金枣与宁波罗纹的亲缘关系比其他种之间近；越
南引进的金柑资源 1~5编号均聚在金柑和四季橘之
外，与四季橘亲缘关系较近，可能也是金柑与其他柑
橘的杂交后代； 中国农业科学院柑桔研究所提供的
4 份金豆资源中， 福建金豆与其他 3 种金豆资源分
开，亲缘关系较远，遗传相似系数小于 0.78；四季橘
聚在金柑属其他种与越南金柑 1~5 编号资源之间；
来自中越边境的山橘聚在金柑属的所有种与四季橘
之间， 它与金弹的遗传相似系数比四季橘与金弹的
遗传相似系数大。
3 讨 论
根据本研究结果， 在遗传系数为 0.85 处将 25
份资源划分为 8类，即阳朔金柑、融安金柑（金弹）及
其变异系，金枣、越南金柑 6和宁波罗纹，长寿金柑，
福建金豆； 金豆 （2002-29，2002-30，2002-36），山
引物
Primer
引物序列（5’-3’）
Sequences （5’-3’）
条带总数量
No. of securable bands
多态性位点
No. of polymorphic bands
多态性位点百分数
Percentage of polymorphic loci/%
U807
U808
U812
U810
U857
U841
U834
U813
U842
U855
总数 Sum
平均 Average
（AG）8 T
（AG）8 C
（GA）8 A
（GA）8 T
（AC）8 YG
（GA）8 YC
（AG）8 TG
（CT）3 T
（GA）8 YG
（AC）8 YT
12
13
13
9
12
13
12
8
10
18
120
12
10
10
13
6
10
12
10
6
8
17
102
10.2
83
77
100
67
83
92
83
75
80
94
85
85
2 000
1 000
750
500
250
100
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
565
果 树 学 报 28 卷
图 2 25 份供试金柑资源的 ISSR 聚类分析
Fig. 2 Dendrogram of the 25 Fortunella accessions by ISSR makers based on UPGMA analysis
橘，四季橘，越南金柑 1~5。 金柑野生种质、引进资源
及栽培种的变异系的亲缘关系基本明确， 原有金柑
属种间的聚类结果与前人的分类基本一致[1，7]。
融安滑皮金柑与阳朔金柑 1 遗传相似系数最
大，达 0.98，与融安金弹的遗传相似系数为 0.97，证
明其为金弹的变异系。
越南引进的金柑资源中，越南金柑 6 与金枣、宁
波罗纹聚在一起， 与金枣实生苗的遗传相似系数为
0.9， 其叶片及果实形态与金枣的相似度也很高，应
为同一起源或系金枣实生变异， 其余的 1~5编号均
聚在金柑和四季橘之外，与四季橘亲缘关系较近，可
能也是金柑与其他柑橘的杂交后代。
诱变金柑 1 和诱变金柑 2是融安金柑经秋水仙
素诱变多倍体的后代， 诱变金柑 1 与融安金柑的遗
传相似系数最大，为 0.95，从引物 U834 的扩增结果
看，诱变金柑 1 与融安金柑比较，多一条特异带（图
1 箭头处），目前 2 个单株均已经开花结果，形态和
细胞学上有明显的特异性，说明已发生一定的变异，
其遗传特性有待进一步研究。
中国农业科学院柑桔研究所提供的 4 份金豆资
源中，福建金豆与其他 3种金豆资源分开，亲缘关系
较远，遗传相似系数小于 0.78。
四季橘聚在金柑属其他种与越南金柑 1~5号资
源之间，表明它与金柑和柑橘属均有亲缘关系，支持
了前人的分类结果[1，7]。
本研究发现， 来自中越边境的山橘聚在金柑属
的所有种与四季橘之间， 它与融安金柑的遗传相似
系数比四季橘与金弹的遗传相似系数大，达 0.78。形
态上与原有金柑属中所描述的山金柑和长叶金柑有
些相似，但与山金柑比较，它不是四倍体，且三金柑
为多胚性 [2]；与长叶金柑比较，其叶片形态和果实色
泽不一致，长叶金柑没有单胚性状的描述；与金豆的
遗传相似系数较小。因此，山桔可能是金柑属的新变
种或种类。因其具有单胚性及早熟等特性，可作为金
柑的育种资源。
4 结 论
从筛选出的 10条引物中扩增出 120 个条带，其
中具多态性的共 102 个， 多态性比率为 85%。 用
Ntedit 软件计算 25 份来自中越的金柑属及金弹变
异系种质资源的遗传相似系数在 0.48~0.99，用 UP-
GMA 法构建的亲缘关系树状图表明: 在遗传相似系
数为 0.85 水平上 25 份资源可分为 8 组，其中，融安
金柑、阳朔金柑 1、阳朔金柑 2、阳朔金柑 3、融安滑
皮金柑、 诱变金柑 1、 诱变金柑 2 聚在一组， 品种
（系）间相似系数大，说明融安滑皮金柑、诱变金柑
1 融安金柑 Ronganjingan
2 融安滑皮金柑 Ronganhuapijingan
3 融安滑皮金柑珠心苗 Nucellar seedling of Ronganhuapijingan
4 阳朔金柑 1 Yangshuojingan1
5 阳朔金柑 2 Yangshuojingan2
6 阳朔金柑 3 Yangshuojingan3
12 诱变金柑 1 Youbianjingan1
13 诱变金柑 2 Youbianjingan2
9 金枣 F. margarita Swingle
10 金枣实生苗 Seedling of F. margarita Swingle
20 越南金柑 6 Yuenanjingan6
21 宁波罗纹 Ningboluowen
7 长寿金柑 F. obovata Tanaka
8 长寿金柑珠心苗 Nucellar seedling of F. obovata Tanaka
22 福建金豆 Fujianjindou
23 金豆（2002-29） Jindou(2001-29)
24 金豆（2002-30） Jindou（2002-30）
25 金豆（2002-36） Jindou（2002-36）
11 山橘 Shanju
14 四季橘 Calamondin
15 越南金柑 1 Yuenanjingan 1
16 越南金柑 2 Yuenanjingan 2
19 越南金柑 5 Yuenanjingan 5
17 越南金柑 3 Yuenanjingan 3
18 越南金柑 4 Yuenanjingan 4
0.52 0.64 0.76 0.88 1.00
Coefficient
566
4 期
《中国石榴研究进展（一）》由中国园艺学会石榴
分会主编，中国农业出版社出版。该书主要由中国园
艺学会和国内有关单位的科研人员、专家学者编著。
全书共分为四篇，分别为科研与生产动态、试验与研
究，栽培与贮藏加工，产业与文化。 分别介绍了石榴
的栽培现状、资源收集、鉴定与利用、新品种、栽培生
理及技术研究、遗传育种、栽培技术研究专题综述、
加工贮藏、标准果园建设等。 内容丰富，全面概述了
我国石榴产业的发展现状，并配有大量的彩图，适用
于石榴行业的从业人员， 为我们更好地了解我国石
榴产业的发展提供了很好的参考。每本定价 136元，
另加包装挂号邮寄费 14元，共计 150元。
邮购地址： 河南省郑州市航海东路南， 中国农
业科学院郑州果树研究所杂志社
电 话: 0371-65330982
1、诱变金柑 2均与金弹为同一遗传背景且为金弹变
异系；金枣及其实生后代、越南金柑 6、宁波罗纹等 4
份资源聚在一组，越南金柑 6与金枣相似系数大，应
为同一起源或系金枣实生变异；长寿金柑独立分开；
福建金豆与金豆 2002-29、 金豆 2002-30 和金豆
2002-36 分开， 说明与其他几个金豆资源亲缘关系
较远； 中越边境的山橘可能为金柑属的新变种或种
类； 越南金柑 1~5号资源疑为金柑与宽皮柑橘的杂
交后代。诱变金柑 1形态上有明显的变异，其遗传特
性有待进一步研究。
致谢:谨向在本研究的资源调查、收集及试验过
程中给予协助的单位领导和同行表示衷心的感谢！
由于篇幅有限，具体名单不一一列出。
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黄桂香等: 中越金柑种质资源的 ISSR 分析
《中国石榴研究进展（一）》
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