全 文 ：第 23 卷　第 6期
2001 年 11 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.23 , No.6
Nov., 2001
2001-04-15收稿
http: www.chinainfo.gov.cn periodical bjlydxxb
＊浙江省自然科学基金资助项目(399277)
＊＊第一作者:刘鹏 ,男 , 1965年生 ,博士 ,教授.主要研究方向:植物营养学 、植物生态学 、植物区系和植物地理.电话:0579-2282099 , Email:
Pliu99@263.net;Pliu2099@yahoo.com.net 地址:321004浙江省金华市浙江师范大学生命与环境科学学院
七子花愈伤组织诱导初探＊
刘　鹏＊＊　徐根娣　张　杰
(浙江师范大学生命与环境科学学院)
摘要　对七子花愈伤组织的培养途径作了初步的探索 , 研究了以七子花的越冬芽及嫩叶诱导的愈伤组织 、无菌短
枝扦插和叶柄培养 3条组织培养的途径来进行的七子花种质资源保护.结果表明:作为外植体 , 栽培的七子花叶片
较野生的七子花越冬芽好;以 MS+2 , 4-D2+ZT2 培养基最利于幼叶的愈伤组织诱导;短枝无菌扦插培养的存活率
高于叶柄培养.比较和分析了各条途径的优点及存在的问题 ,并对七子花的组织培养作了新的展望.
关键词　七子花 , 组织培养 , 愈伤组织 , 种质资源保护
中图分类号　S685.99
Liu Peng;Xu Gendi;Zhang Jie.Preliminary studies on callus inducement of Heptacodium miconioides
Rehd.Journal of Beijing Forestry University(2001)23(6)63 ～ 65[ Ch ,5 ref.] College of Life and Environment
Science , Zhejiang Normal Univ., 321004 ,P.R.China.
The avenues of the callus tissue culture of Heptacodium miconioides Rehd.were preliminarily explored in
this paper.Three relevant ways which could be used in the protection of the germplasm resource of Heptacodi-
um miconioides Rehd.were studied (inducing callus with overwintering buds and tender leaves , bacteria-free
brachyblast cutting and leafstalk culture).The result showed that tender leaves of cultured Heptacodium mico-
nioides were better than overwintering buds of wild Heptacodium miconioides as explants of callus;MS+2 ,4-D2
+ZT2 culture medium was the most beneficial medium to callus inducement of tender leaves;survival rate of
bacteria-free brachyblast cutting culture was higher than that of leafstalk culture.The advantages and disadvan-
tages of each way were analyzed.This study showed the great potentiality of the tissue culture of Heptacodium
miconioides Rehd.
Key words　Heptacodium miconioides Rehd., tissue culture , callus , protection of germ plasm resource
　　七子花(Heptacodium miconioides Rehd.)为七子
花属(Heptacodium)的落叶灌木或小乔木 ,属忍冬科
(Caprifoliaceae)的单种属植物 ,是我国第 1批公布的
二级珍稀濒危保护植物之一[ 1] ,也是中国生物多样
性保护行动计划中优先保护的物种[ 2] .由于七子花
植株数目极少 ,分布范围狭小 ,自然繁殖率低 ,加之
其生境不断恶化 ,种群不断变小且物种连续分布区
域有间断的趋势 ,其濒危程度日益加重.因此 ,如何
采取适当的保护措施 ,从而将七子花的种质资源有
效地保存下来 ,已成为一个亟待解决的问题.近几年
来 ,组织培养已越来越广泛地被应用于植物的种质
资源保护 ,但七子花的组织培养在国内外至今未有
报道.正是基于上述的事实与考虑 ,我们对七子花的
组织培养途径进行了初步的探索.
1　材料与方法
于2000年3 月 2日分别采集金华北山野生七
子花(海拔 600 m)和栽植于浙江师范大学植物园内
的七子花(海拔 80 m),并选取不同的部位进行培养
比较.愈伤组织的诱导材料分别为北山野生七子花
刚萌动的越冬芽和植物园栽培七子花刚展开的幼
叶[ 3] ;快速繁殖则选用植物园栽培的七子花嫩茎(长
DOI :10.13332/j.1000-1522.2001.06.015
8 ～ 10 cm)及幼叶上的叶柄.将采来的材料在自来水
下反复地冲洗 0.5 ～ 1 h ,无菌条件下用 70%的乙醇
表面灭菌 30 ～ 40 s ,用无菌水涮洗 3遍 ,再用 0.1%
的升汞(HgCl2)溶液浸泡灭菌 6 min ,无菌水涮洗 8
遍.然后 ,将越冬芽基部切去 ,剥去外部数层鳞片;幼
叶选用不带叶柄的上半段 ,切成 0.5 cm2 左右的小
块 ,分别接种于愈伤组织诱导培养基上.将嫩茎基部
的一小段及其上叶片和顶芽除去 ,并切成长 0.5 cm
左右的小段 ,每一小段均带有两个对生的腋芽 ,垂直
接种于茎段的培养基上.
基本培养基为MS ,附加不同种类和不同浓度配
比的激素:6-苄基腺嘌呤(6-BA)、玉米素(ZT)、2 ,4-
二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸
(NAA);蔗糖 3%,琼脂 0.65%,pH 值5.7 ～ 5.8.愈伤
组织诱导采用暗培养 ,温度为 27 ℃;快速繁殖则在
光照培养箱内进行 , 温度为 25 ℃, 光照强度为
2 000 1x ,光照时间为每天12 h.
2　结果与分析
2.1　不同生境外植体的比较
试验采用野生七子花刚萌动的饱满的越冬芽和
栽培的七子花刚展开的幼叶作为诱导愈伤组织发生
的外植体.两种外植体在相同的条件下培养后 ,越冬
芽较幼叶的存活率低 49%,但越冬芽从接种到萌发
愈伤组织所需的时间较短 ,接种后平均 7 d 开始长
愈伤组织 ,且愈伤组织的品质好 ,生长速度快 ,整个
外植体在 9 ～ 12 d 内就形成为一整团的愈伤组织.
而幼叶在接种后平均 12 d 才有少量的愈伤组织出
现 ,且生长缓慢 ,有些甚至在后期培养中不再增殖或
增殖率极低.这说明越冬芽通过休眠期后 ,芽内积累
了丰富的营养物质 ,在适宜的条件下能够很快地萌
动生长;而春季嫩枝条上的幼叶 ,由于本身较弱 ,积
累的营养物质较少 ,则生长迟缓.但越冬芽的污染率
远远地高于幼叶 ,分别为 86.5%和 32.4%(见表 1),
究其原因 ,或与野生条件下携带各种菌类的可能性
较大以及越冬芽外包被有多层具纤毛的鳞片 ,灭菌
难以深入其内部有关.因此 ,在灭菌技术尚未突破的
前提下 ,仅愈伤组织诱导这一环节 ,仍考虑以栽培的
七子花幼叶作为外植体较好.
表 1　七子花组培中不同外植体的存活率
TABLE 1　Survival rate of different explants of Heptacodium
miconioides Rehd.in tissue culture
外植体 接种数 污染数 污染率 % 存活数 存活率 %
越冬芽 174 151 86.8 23 11.2
幼叶 174 56 32.2 118 67.8
2.2　外源激素对幼叶愈伤组织诱导的影响
通过前期工作的初步筛选后 ,我们以 MS 为基
本培养基 ,附加不同浓度配比的 2 , 4-D和 ZT ,以栽
培七子花幼叶为外植体 ,测定不同激素组合对愈伤
组织诱导的协同作用.结果发现(见表 2),接种 12 d
后 ,除部分幼叶外植体因霉菌污染或 Hg+残留导致
死亡外 ,其余大多均有不同程度的愈伤组织发生.从
表 2可知 ,幼叶外植体在各培养基中培养 12 d后愈
伤组织发生均达 80%以上 ,其中培养基②与④的愈
伤组织诱导率明显高于①与③,且愈伤组织生长快 、
品质好.这说明 ,低浓度的 ZT 能有效地促进愈伤组
织的分化与生长 ,而高浓度的 ZT 则会抑制愈伤组
织的生长.从培养基②和④的比较分析可发现 ,虽然
培养基④中愈伤组织生长更为迅速 ,但其增殖速度
过快 ,表面易干枯而成为白色絮状 ,所以其愈伤组织
品质反而比培养基②中差.综合考虑 ,培养基②的诱
导效果更好 ,而培养基③的效果较差.
表 2　ZT 与 2 , 4-D不同浓度配比对愈伤组织诱导的影响
TABLE 2　Effects of different level of ZT and 2 , 4-D on callus inducement
编号 培养基(激素浓度单位:mg·L-1) 存活数 愈伤组织发生率 % 愈伤组织特点
① MS+2 , 4-D1+ZT2 39 84.6 生长较慢 ,黄绿色 、半透明颗粒状
② MS+2 , 4-D2+ZT1 33 100.0 生长较快 ,多为黄绿色 、半透明颗粒状 ,鲜有白色
③ MS+2 , 4-D2+ZT2 20 80.0 生长极慢 ,白色 、半透明颗粒状
④ MS+2 , 4-D1+ZT1 16 100.0 生长迅速 ,白色絮状与黄绿色半透明颗粒状参半
2.3　短枝无菌扦插与叶柄培养的比较
短枝无菌扦插(茎段培养)以 MS 为基本培养
基 ,附加 6-BA 0.25+ZT 0.25+IAA 0.25;叶柄培养
同样采用 MS 为基本培养基 ,并附加 6-BA 0.5+ZT
0.2+NAA 0.05.接种 20 d 后 ,统计未污染外植体的
存活率及生长状况(见表 3).
试验结果表明 ,七子花的茎段及叶柄在前期均
具有较强的分化增殖能力 ,所以 ,这两条途径都有可
能成为获得七子花试管苗的有效手段.但是 ,培养了
约 30 d后 ,两种外植体均出现了生长停滞的现象 ,
处于一种半休眠状态 ,并发生一定程度的扭曲与褐
变.这说明 ,七子花的生长对于营养成分的要求必然
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有其特殊的方面 ,尚需要大量的前期工作不断地进 行探索.
表 3　短枝无菌扦插与叶柄培养的比较
TABLE 3　Comparison between bacteria-free brachyblast cutting culture and leafstalk culture
培养基(激素浓度单位:mg·L-1) 外植体 接种数 存活率 % 生长状况
MS+6-BA 0.25+ZT 0.25+IAA 0.25 叶柄 30 46.7 接种后 11 d ,叶柄基部开始出现少量愈伤组织 ,随后逐渐膨大 ,呈绿色泡状突起
MS+6-BA 0.5+ZT 0.2+NAA 0.05 茎段 30 68.8 接种后 9 d ,腋芽开始萌动;10 d ,基部出现少量淡黄色愈伤 ,并迅速增大 ,有根分化迹象
3　讨　　论
(1)七子花的幼叶背面及嫩茎表面具纤毛 ,灭菌
时极易在纤毛和溶液之间形成微小气泡而致使灭菌
失败 ,引起污染.因此 ,在用 HgCl2 溶液灭菌前需先
将外植体在 70%的乙醇中浸泡 30 s左右 ,同时用镊
子轻轻摇动外植体 ,以赶走附在其表面的小气泡[ 4] .
但是 70%的乙醇对植物的细胞具有很强的穿透性
和杀伤力 ,故灭菌时间不宜过长 ,应控制在 60 s以
内.
(2)0.1%HgCl2 在 10 min内可有效地杀死附着
在外植体表面的细菌和芽孢 ,是一种极强的杀菌剂 ,
Hg
+的残留对外植体的毒害作用较大[ 5] ,因此 ,必须
用无菌水彻底涮洗灭菌后的外植体 ,以把 Hg+的残
留量降低到最小限度.经试验 , 对幼叶 、嫩茎用
0.1%的HgCl2灭菌 6 min ,然后用无菌水涮洗 8遍 ,
已能取得令人较为满意的效果.而对于越冬芽 ,则可
先剥除部分外被鳞片 ,并延长灭菌时间至 10 min进
行处理.
(3)培养过程中不时出现一定程度褐变现象 ,主
要是由于外植体中多酚化合物氧化生成醌类物质所
致.因此 ,可采取遮光处理(在暗培养诱导愈伤组织
时极少发现有褐变现象)或在培养基中加入少量活
性炭(AC)吸附醌类物质.但必须注意 ,AC除能吸附
培养基中有害物质外 ,也能吸附一定量的生长调节
物质和其它培养基成分 ,如 Fe-EDTA 、V-B6 、烟酸和
叶酸等.为了减少七子花发生褐变和生长停滞还可
通过缩短七子花的继代时间 ,可考虑将继代时间从
目前的 30 d缩短为 15 d.
综合我们的试验结果 ,采用组织培养的方法由
于其占地面积小 ,增殖速度快且培养条件易控制等
优点 ,在七子花的种质资源保护工作中将具有很大
的潜力.
参 考 文 献
1　国家环境保护局 ,中国科学院植物研究所.中国珍稀濒危保护
植物名录:第 1册.北京:科学出版社 , 1987
2 　《中国生物多样性保护行动计划》总报告编写组.中国生物多样
性保护行动计划.北京:中国环境科学出版社 , 1994.75～ 80
3 　Johnson B B.In Vitro propagation of f rom leaf explants.Hort Science ,
1978 , 13:149～ 150
4 　徐根娣 ,刘鹏 ,厉萍.七子花种质资源保护方法探索.浙江师大
学报(自然科学版), 1998, 21(1):71～ 76
5 　朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌.植物生理学通讯 ,
1996 , 32(6):444～ 446
65第 6期 刘　鹏等:七子花愈伤组织诱导初探