全 文 ：书第 35 卷 第 3 期
2016 年 5 月
华 中 农 业 大 学 学 报
Journal of Huazhong Agricultural University
Vol． 35 No． 3
May 2016，1 ～ 5
收稿日期:2015-05-25
基金项目:重庆市基本科研业务费专项(2013cstc-jbkg-00534) ;国家现代柑橘产业技术体系(SAＲS-27)
杨海健，助理研究员． 研究方向:果树栽培与育种． E-mail:yanghaijian126@ 126． com
通信作者:谭 平，副研究员． 研究方向:果树区域经济及技术推广． E-mail:tanp_168@ 163． com
锦橙系列品种资源的遗传鉴定
杨海健1 张云贵1 但 芳2 韩国辉1 周心智1 洪 林1 谭 平1
1．重庆市农业科学院果树研究所 /长江中游柑橘综合试验站，重庆 401329;
2．国家农业信息化工程技术研究中心 /北京农业信息技术研究中心，北京 100097
摘要 采用 SＲAP分子标记技术对重庆地区的 16 份锦橙(Citrus sinensis Osbeck)资源进行遗传鉴定，结果显
示:锦橙资源间的亲缘关系非常接近。在 16 份锦橙的 PCＲ扩增中，80 对 SＲAP 引物中只有 30 对引物扩增出了
差异带，多态性引物比例为 37． 5%，共扩增出 56 份特征带，平均每对引物扩增出 1． 87 条差异带。聚类结果显
示，八楞锦橙和长叶橙与其他锦橙类型遗传距离较远，而遗传关系最近的是 BDQ222 与 BDM221、S26。SＲAP 的
鉴定结果显示，此标记在鉴定锦橙这种亲缘关系非常近的芽变类型上具有较高的可应用性。进一步对部分差异
片段测序分析，推测这些差异片段有可能与锦橙的变异性状相关。
关键词 锦橙;品种资源;芽变;SＲAP;遗传鉴定
中图分类号 S 666． 4 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2016)03-0001-05
锦橙原产重庆，在当地种植广泛，是可鲜食、也
可加工的优良甜橙品种资源［1］。三峡库区是我国
柑橘优势区域发展规划中最主要的橙汁加工原料生
产基地［2］，而锦橙作为甜橙良种在三峡库区的鲜食
生产和果汁加工中都占有重要地位，目前三峡库区
柑橘加工所采用的中熟品种 90%以上为锦橙［3］。
锦橙在我国具有悠久的栽培历史，并在种植过程中
不断产生自然芽变。目前我国主栽的众多锦橙资源
均具有芽变背景，有熟期、叶形、果形等多种变异类
型。这些变异类型在植物学特征上有相似的一面，
也有在品质及生物学特性方面的不同之处，使用分
子标记对变异类型进行遗传鉴定，建立特征标记库
有利于今后的保存、推广和苗木繁育。
SＲAP分子标记自 2001 年被 Li 等［4］开发以来
得到了广泛应用，此标记在基因连锁图中是均匀分
布的，这一点与 AFLP 标记没有区别。此种标记已
经广泛应用于蔬菜、果树、花卉等物种上并成功扩
增［5-7］。韩慧君［8］在利用 SＲAP分析红橘优系时，认
为 SＲAP标记操作简单、并在稳定性和多态性方面
表现较好。本研究以重庆的 16 份锦橙资源为试验
材料，利用 SＲAP分子标记对其进行遗传鉴定，记录
特征标记，克隆差异片段，旨在为锦橙资源的保存、
利用和基因重要变异信息发掘提供依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
于 2014 年在重庆地区采集锦橙类型共计 16 份
样品，见表 1。
表 1 16 份试验材料
Table 1 16 samples for experiments
编号 No． 名称 Name 编号 No． 名称 Name
1 大叶大果
Daye daguo
9 蓬安
100
Pengan 100
2 铜水
72-1
Tongshui 72-1
10 梨橙
2 号
Licheng-2
3 BDQ222 11 红
6-6
Ｒed 6-6
4 北碚
447
Beibei 447
12 长叶橙
Changye Cheng
5 BDM221 13 八楞 Baleng
6 S26 14 甜橙
863
Sweet orange 863
7 渝津橙
Yujin Cheng
15 BBS227
8 BSG223 16 涪陵晚熟
Fuling late-maturing
1． 2 DNA提取和凝胶电泳
采集样品嫩叶，用蒸馏水清洗后利用 CTAB 法
提取 DNA 备用。采用 SＲAP 分子标记技术进行
DOI:10.13300/j.cnki.hnlkxb.2016.03.001
华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
PCＲ扩增、6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，最终获
得标记图谱。
SＲAP引物来自文献［9］，由上海生工合成。采
用 Applied Bio systems PCＲ 仪进行 DNA 扩增，扩增
体系参照李巧燕等［10］的方法。电泳设备采用北京
六一电泳槽，电泳功率 80 W，电压 2 000 V。
1． 3 多样性及聚类分析
根据扩增图谱中差异条带的有无来构建数据矩
阵(模糊条带不计算在内) ，再利用 NTSYS-pc2． 1 软
件计算相似系数，利用 UPGMA 法聚类分析，构建亲
缘关系树状图。
1． 4 特异片段的回收、测序
采用康为世纪快速琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂
盒 (version 05152012 Cat． No． CW2302)进行回收，
送上海生工测序。
2 结果与分析
2． 1 引物筛选
经过筛选，最终得到能获得较清晰谱带的引物
共 80 对，表 2 所示为正反向引物序列。
表 2 SＲAP引物序列表
Table 2 Primer sequences for SＲAP analysis
编号 No． 正向引物(5 － 3)Forward primer 编号 No． 反向引物(5 － 3)Ｒeverse primer
1 me1f:TGAGTCCAAACCGG-ATA 10 em1r:GACTGCGTACGAATT-AAT
2 me2f:TGAGTCCAAACCGG-AGC 11 em2r:GACTGCGTACGAATT-TGC
3 me3f:TGAGTCCAAACCGG-AAT 12 em3r:GACTGCGTACGAATT-GAC
4 me4f:TGAGTCCAAACCGG-ACC 13 em4r:GACTGCGTACGAATT-TGA
5 me5f:TGAGTCCAAACCGG-AAG 14 em5r:GACTGCGTACGAATT-AAC
6 ME7F:TGAGTCCAAACCGG-TCC 15 em6r:GACTGCGTACGAATT-GCA
7 ME8F:TGAGTCCAAACCGG-TGC 16 em7r:GACTGCGTACGAATT-CAA
8 ME9F:TGAGTCCAAACCGG-ATG 17 Em7r:GACTGCGTACGAATT-ATG
9 ME10F:TGAGTCCAAACCGG-CTT 18 Em8r:GACTGCGTACGAATT-CTG
19 Em9r:AGGCGGTTGTCAATT-GAC
20 Em10r:TGTGGTCCGCAAATT-TAG
2． 2 扩增结果
80 对 SＲAP引物中仅有 30 对扩增出了差异，共
56 条差异带，平均每对多态性引物扩出 1． 87 条差
异带。在 16 份不同的锦橙材料中，能够扩增出 2 条
以上差异带的引物共 10 对，分别为:me1f-em5r 、
me1f-Em7r、me5f-em1r、ME7F-em1r、ME7F-Em7r、
ME7F-Em9r、ME8F-Em9r、ME9F-em1r、ME9F-em4r、
ME9F-Em9r 。3 条以上差异带的只有 4 对，分别为:
me1f-Em9r、ME7F-Em9r、ME8F-Em9r、ME9F-Em9r。
图 1 引物 me1f /Em9r(左)和 me2f /em6r(右)的 SＲAP电泳图
Fig． 1 SＲAP marker of primers me1f /Em9r(Left)and me2f /em6r(Ｒight)
2
第 3 期 杨海健 等:锦橙系列品种资源的遗传鉴定
2． 3 亲缘关系分析
利用 80 对 SＲAP引物共获得了 16 份锦橙样品
的 30 个差异图谱。采用聚类软件得到聚类图
(图 2) ，如图所示，在遗传相似系数为 0． 867 时(图
2 中竖线处) ，可以将 16 份锦橙分成 7 类，其中 3、4、
5、6、9、10、11、14、15、16 号聚为一类，其余 6 份锦橙
各自单独归为一类。八楞锦橙与其他锦橙遗传距离
最远，其次是长叶橙。获得的遗传相似度显示，16
份锦橙之间的遗传相似系数在 0． 613 ～ 0． 984 之间。
其中，相似系数最小值分别产生在八楞锦橙与长叶
橙、八楞锦橙与 BSG223 之间，最大值则出现在
BDQ222 与 BDM221、BDQ222 与 S26 之间。
图 2 16 份锦橙材料的亲缘关系树状图
Fig． 2 UPGMA dendrogram for 16 Jincheng resources
表 3 克隆片段信息
Table 3 Information of cloned fragments
片段来源
Fragment source
引物
Primer
片段序列长度 /bp
Fragment
length
比对基因长度 /bp
Corresponding
gene length
相似度 /%
Similarity
基因信息
Genetic information
BSG223
BSG223
ME8F /
Em8r
179 3 908 99 与植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的合成相关
Leucine-rich repeat receptor-like protein kinase
BSG223
BSG223
ME9F /
Em9r
63 8 525 92 β-半乳糖苷酶合成基因 Putative beta-galactosidase
八楞
Baleng
ME10F /
em4r
159 15 242 100 与多核糖核苷酸核苷酸基转移酶合成相关
Polyri-
bonucleotide nucleotidyltransferase
八楞
Baleng
ME9F /
em2r
191 1 173 95 未经鉴定的基因
Putative uncharacterized protein
(Fragment)
渝津橙
Yujin Cheng
ME8F /
Em9r
134 8 781 98 与肌醇单磷酸酶
3 合成相关 Inositol monophos-
phatase 3
渝津橙
Yujin Cheng
ME8F /
Em9r
166 25 262 96 叶绿体中依赖铁氧还蛋白的谷氨酸合成酶基因
Ferredoxin-dependent glutamate synthase
长叶橙
Changye Cheng
ME9F /
em2r
147 3 307 98 与细胞壁结构成分相关
Structural constituent of
cell wall
北碚 447
Beibei 447
ME9F /
em2r
147 3 307 98 与细胞壁结构成分相关
Structural constituent of
cell wall
涪陵晚熟
Fuling late-maturing
ME8F /
Em8r
165 3 908 99 与植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的合成相关
Leucine-rich repeat receptor-like protein kinase
2． 4 差异片段的测序、比对
将差异明显的特异带进行回收测序，共获得 24
条序列，克隆得到的差异片段长度为 22 ～ 255 bp。
在华中农业大学甜橙基因组数据库中进行比对后发
3
华 中 农 业 大 学 学 报 第 35 卷
现，匹配程度在 95%以上的有 9 条(表 3)。
3 讨 论
本研究在 16 份锦橙的 PCＲ扩增中，80 对 SＲAP
引物中只有 30 对引物扩增出了差异带，多态性引物
比例为 37． 5%，且大部分引物只能扩增出1 条差异
带(图 1 右) ，扩增出 3 条以上差异(图 1 左)的引物
仅 4 对。可见，锦橙不同品种资源之间的亲缘关系
非常接近，不易区分。主要原因可能是由于锦橙的
不同类型均来源于个别或少数基因发生突变而产生
的自然芽变。亲缘关系分析显示，八楞、长叶橙与其
余锦橙关系较远，推测八楞和长叶橙是锦橙在自然
生长过程中通过多次变异产生。另外，部分学者对
将长叶橙归为锦橙类持不同观点，而本研究结果似
乎也佐证了这一观点，究竟是否为锦橙芽变还有待
进一步研究。BDQ222 与 BDM221、BDQ222 与 S26
两两关系最近，推测 BDQ222、BDM221 和 S26 是由
其中某一个变异产生。说明锦橙是极易产生芽变的
柑橘类型。
芽变是果树新种质产生的一个重要来源，在果
树保持遗传多样性和培育新品种上具有重要意
义［11］。但芽变往往是极少数功能基因发生变异，因
此，很多标记不易区分。SＲAP 标记既具有像 SSＲ
标记一样简便的操作和高重复性，也具有类似 AFLP
一样的高产率、集两者之长的特性使得此标记自出
现以来一直得到广泛的关注和应用。本研究中所有
锦橙类型均能通过 30 对 SＲAP 特异性引物做出正
确区分，显示了 SＲAP 标记在鉴定锦橙这类亲缘关
系非常接近的芽变类型上具有较高的可应用性，这
一点与阳志慧［12］在利用 SＲAP 分析纽荷尔脐橙变
异株系时获得的结论一致。因此，此技术可在植物
资源保存中鉴定重复资源和芽变资源、提高资源保
存效率方面发挥重要作用。
本研究测序结果中，9 条匹配程度在 95%以上
的序列分布在 6 份锦橙品种中。BSG223 和涪陵晚
熟在同一引物下(ME8F /Em8r)分别克隆到 179 bp
和 165 bp的片段，且这 2 条序列均以 99%的相似性
共同比对到一个长为 3 908 bp 的基因的不同区段
上。此基因与植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的
合成相关，具有与植物生长发育、激素信号转导和植
物抗病防御等相关的基因功能［13］。此外，其他测序
片段比对上的基因还有:肌醇单磷酸酶 3 合成相关
基因、多核糖核苷酸核苷酸基转移酶合成相关基因、
细胞壁结构成分相关基因、叶绿体中依赖铁氧还蛋
白的谷氨酸合成酶基因等，还包括一个未经鉴定的
甜橙功能基因。可见，通过分子标记不仅能标记出
芽变材料的差异位点，还能在基因库中比对上已知
基因。从比对上的基因类型上看，发生在锦橙上的
变异表现为多样性，这点从锦橙不同的形态和农艺
性状上也能得到充分体现。对差异片段回收测序，
并在基因库中比对匹配的基因序列，可通过查看基
因功能获知该基因的相关信息，如果再通过后期克
隆基因全长和利用转基因技术将目的基因导入植物
受体观察验证，将能进一步发掘、获知该基因的某些
未知功能，本研究做了差异片段的回收、测序及比
对，初步获得了某些片段信息。锦橙芽变类型中，有
的呈现叶形变异、有的表现为果形变异，还有的是
熟期变异，这些经过测序的特异序列和未经测序
的差异片段有可能包含了揭示锦橙品种资源之间
性状差异的重要信息，因此，仍具有进一步研究的
价值。
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(1) :7-12．
Genetic identification of Jincheng sweet oranges with SＲAP markers
YANG Haijian1 ZHANG Yungui1 DAN Fang2 HAN Guohui1
ZHOU Xinzhi1 HONG Lin1 TAN Ping1
1． Institute of Fruit Ｒesearch，Chongqing Academy of Agricultural Sciences /
Citrus Experiment Station of the Middle Ｒeaches of Yangtze Ｒiver，Chongqing 401329，China;
2． National Engineering Ｒesearch Center for Information Technology in Agriculture /
Beijing Ｒesearch Center for Information Technology in Agriculture，Beijing 100097，China
Abstract 80 pairs of SＲAP primer were used to analyze the genetic relationship among 16 Jincheng(Citrus
sinensis Osbeck)germplasms from Chongqing area． The results showed that the genetic relationship between dif-
ferent Jincheng species was very close． In the PCＲ amplification，only 30 pairs of primers (37． 5%)were poly-
morphic． 56 polymorphic bands were obtained，with an average of 1． 87 band each pair of primers． Ｒesults of clus-
ter analysis showed that the genetic relationship between Baleng Cheng and Changye Cheng was more far than
that between other types． The closest relationship was between BDQ222 and BDM221，and between BDQ222 and
S26． SＲAP markers have a high applicability in identifying plant types with close genetic relationship． By sequen-
cing and analyzing polymorphic fragments，we speculate that some polymorphic fragments may be associated with
variation of some traits of Jincheng． It will provide basis for future exploring Jincheng germplasm．
Keywords Jincheng(Citrus sinensis Osbeck) ;germplasm;bud variation;SＲAP;genetic identification
(责任编辑:张志钰)
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