全 文 ：文章编号: 1008- 3464 ( 2007) 04- 0273- 04
金柑 LEAFY同源基因克隆与全序列分析①
何新华 1, 2 , 郭永泽 1 , 张利 1 , 李杨瑞 2
( 1　广西大学 农学院 , 广西 南宁 530005;
2　广西农业科学院 作物遗传改良与生物技术重点实验室 , 广西 南宁 530007)
摘要: 通过 PCR扩增 , 从融安金柑基因组 DNA中克隆出一条 2 361 bp的 DNA片段 , 该 DN A克隆含有
1个 2 081 bp的 L EAFY同源基因全长序列 (FcLFY )。金柑 L EAFY同源基因包含 2个内含子和 3个外显子 ,
编码 398个氨基酸。比对结果表明 , 金柑 LE AFY同源基因与甜橙、枳的 L EAFY同源基因的核苷酸和氨基酸
序列的同源性均为 98%。 该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。
关键词: 金柑 ; LEAFY ; 克隆
中图分类号: S666; Q781　　　文献标识码: A
Cloning and sequence analysis of LEAFY homologous gene
from kumquat (Fortunella crass ifolia Swingle)
HE Xin-hua
1, 2
, GUO Yong-ze
1
, ZHANG Li , LI Yang-rui
2
( 1　 Colleg e of Ag riculture , Guangxi Univ ersity, Nanning 530005, China;
2　 Guangx i Crop Gene tic Improvement and Bio techno lo g y Key Lab, Guangx i Academy
of Ag ricultural Sciences, Nanning 530007, China)
Abstract: A 2 361 bp DN A fragment w as isolated and cloned by polymerase chain reaction
( PCR) f rom kumquat (Fortunella crassi folia Swing le) . The DN A clone contained a complete sequence
o f 2 081 bp LEAFY homolo gous gene ( FcLFY ) which included 2 introns and 3 exons and encoded 398
amino acids. The alignments of nucleo tide and amino acid sequences of thei r L EAFY homolo gous
genes betw een kuamqua t wi th sw eet o range and Poncirus trifol iata were al l 98% . The resea rch laid a
sound founda tion fo r studying the regulation and contro l in f low ering mechanism in kumquat a t the
molecular level in the future.
Key words: Fortunella crassifolia; LEAFY ; cloning
LEAFY (简写为 LFY )同源基因是控制花分生组织形成的基因之一 , 处于成花调控网络的关键位
置 , 为转入生殖发育的中心调节剂 , 不仅调控开花时间和花转变 , 而且在花序和花的发育中也起重要
作用 [ 1]。L FY的超量表达能使花期提前。 Pena等 [2 ]将拟南芥 LFY基因转入柑橘 , 得到的转基因柑橘可
在当年开花 , 其果实正常 , 其种子当年播种 , 翌年春天即开花结果。类似的结果在欧洲山杨、 水稻等
植物中均有报道 [3, 4 ]。研究果树 LFY同源基因对于了解果树童期的分子调控机理具有十分重要的意义。
目前已从甜橙、 枳、苹果等 20多种植物中克隆出 LFY全长基因。融安金柑是广西名特柑橘类果品 , 具
第 26卷 第 4期
Vol. 26, No. 4
广 西 农 业 生 物 科 学
Journal o f Guangx i Ag ric. and Bio l. Science
2007年 12月　
Dec. , 2007　
① 收稿日期: 2006- 10- 16; 　　　修回日期: 2006- 11- 28。
基金项目: 国家自然科学基金 ( 30560007) ; 广西自然科学基金 (桂科自 0542022) ; 广西科学基金应用基础研究专
项 (桂科基 0731040)。
作者简介: 何新华 ( 1966- ) , 男 , 广西大学教授 , 博士 , 博士生导师 ; E-mail: honest66222@ 163. com。
有一年多次开花、 多次结果的特性。为了探讨其开花的分子机理 , 本研究克隆了融安金柑的 LFY全长
基因 ( GenBank登录号为 DQ497003)。
1　材料与方法
1. 1　材料
融安金柑 ( Fortunellacrassifolia cv . Rongan)叶片采自广西大学农学院教学科研基地的果树标
本园 ;大肠杆菌 TG 1菌株和质粒 pUC1 8由广西农业科学院作物遗传改良与生物技术重点实验
室保存 ; pMD 1 8 - T载体 、 dN TP、 Taq plus DN A聚合酶 、限制性内切酶 、 GeneRulerTM 100 bp
DN A ladder plus均购自 TaKaRa公司 , X-Gal、 IPT G、 氨苄青霉素 ( Amp) 购自上海生物工程公司 ,
凝胶回收试剂盒购自 Bioer公司 , 其他试剂均为国产分析纯试剂 ; 根据 GenBank上已知的甜橙和枳的
LFY 全长基因设计 1对引物 , 上游引物为 5′-GAAGGCAATGGACCCGGAAGC-3′,下游引物为
5′-ACTCCGCCCAAATCCA TCCTT-3′,引物委托捷瑞生物工程 (上海 ) 有限公司合成。
1. 2　方法
用改良 CTAB法 [5 ]提取融安金柑基因组 DNA作为模板 ,以 5′-GAAGGCAATGGACCCGGAAGC-
3′和 5′-ACTCCGCCCAAATCCATCCT T-3′为引物 , 在 Thermocycler PCR仪中进行扩增 ; 采用 20μL
反应体系: 10 mmo l /L Tris-HCl ( pH 8. 3) , 50 mmo l /L KCl, 1. 5 mmo l /L M gCl2 , 0. 2 mmol /L mixed
dN TP, 上游、 下游引物各 0. 25μmol /L , 1 U rTaq DNA聚合酶 ( TaKaRa Bio techno log y, Japan ) , 模
板 DNA约 60 ng; 扩增参数为: 94°C预变性 5 min; 94°C变性 1 min, 52°C退火 1 min, 72°C延伸 2 min,
35个循环 ; 72°C延伸 10 min。 PCR产物在 1%的琼脂糖凝胶上电泳 , 用 Bio spin Gel Ex traction Ki t从
凝胶上回收、纯化目的条带。将回收产物连接到 pMD18-T载体上 ,连接产物转化大肠杆菌 TG1菌株感
受态细胞 , 通过蓝白斑筛选、 PCR验证、 质粒长度对比和酶切鉴定获得重组质粒 , 委托捷瑞生物工程
(上海 ) 有限公司测序。 对测序得到的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别用 GenBank Blast和
Clustal W ( 1. 83)进行相似性搜索和同源性分析 , 用 Dnasis 2. 5分析内含子和外显子的剪切位点 , 用
Dnaman 4. 0分析融安金柑 L FY同源基因与 GenBank上已知的其他果树 LFY同源基因全长序列的关
系 , 构建系统树。
2　结果与分析
以融安金柑基因组 DNA为模板 ,扩增出
图 1　金柑 LFY同源基因克隆凝胶电泳图
Fig. 1　 Gel electrophoresis map of LFY
homologous gene cloned fromF . crassif ol ia cv. Rongan
　　　 1～ 4. pMD18-FcLFY酶切产物、重组质粒 pMD18-FcLFY、
PCR产物、 PUC18; M . GeneRule rTM 100 bp DNA ladder plus
1～ 4. pM D18-FcLFY digested by EcoRⅠ and HindⅢ ,
pM D18-FcLFY , PCR product, PUC18; M . GeneRulerTM 100 bp
DNA ladder plus
一条约 2 300 bp的 DNA片段。 将该片段纯化
后 , 连接至 pMD-18T载体 , 转化大肠杆菌
T G1菌株 ,通过 PCR和双酶切 ( EcoRⅠ 和
HindⅢ鉴定 ,获得重组质粒 , 并命名 pMD18-
FcLFY (图 1)。测序结果表明 , 该条带的长度
为 2 361 bp。
　　通过 GenBank Blastn和 Clustal W ( 1. 83)
序列同源性分析 , 发现该序列与 GenBank中同
科 (芸 香 科 ) 的 甜 橙 ( AY338976 )、 枳
( AY970823、 AY970824)的 LEY全长基因的核
苷酸序列的同源性均为98% ,认为该 DNA片段
为金柑LFY同源基因 (FcLFY )。进一步的结构
分析发现 , 该 DNA片段包含有金柑 LFY基因
全长序列为 2 081 bp,有 2个内含子和 3个外显
子 , 编 码 398个 氨 基 酸。 通 过 Blastp 和
274 广 西 农 业 生 物 科 学 第 26卷　
Clustal W ( 1. 83)比对分析表明 , 该基因推测的氨基酸序列与甜橙、 枳 LFY全长基因的氨基酸序列的
同源性也均为 98% , 该基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列如图 2。
融安金柑 LFY同源基因与 GenBank上已知的其他果树 LFY同源基因的全长核苷酸序列的关系见
图 3。从图 3可以看出 , 金柑 LFY同源基因与甜橙和枳中 LFY同源基因的关系比较近 ,聚类在一起 , 它
们同属柑橘类植物 , 与常规植物分类一致。
图 2　金柑 LEAFY基因 (FcLFY ) 的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 2　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of
LEAFY (FcLFY ) fromFortunella crassif olia cv. Rongan
图中的小写字母为内含子 , FcLFY基因的起始密码子和终止密码子为黑体阴影部分
Intr on sequences a re giv en in the small letter s. The black letter s and shadow par ts ar e th e sta rt codon and
termination codon of FcLFY
275第 4期 何新华等: 金柑 LEAFY同源基因克隆与全序列分析
图 3　 8种果树 LFY同源基因全长核苷酸序列的系统树
Fig. 3　 Phylogenet ic relationship of LFY homologous genes among
eight k inds of f ruit trees
AFL 1和 AFL2 (苹果 DQ535885和 DQ535886) , EjLFY (枇杷 AY551183) , GinLFY、 GinN DLY和 N dly (银杏
AF108228、 AF105111和 AY656676) , VvLFY、 VvLFY 1和 VvrLFY (葡萄 AF450278、 AF378126和 AY126446) , P FY
(番木瓜 DQ054794) , CtrsLFY 1和 CtrsLFY2 (枳 AY970823和 AY970824) , CsLFY (甜橙 AY338976) , FcLFY (金柑
DQ497003)
AFL 1 and AFL 2 from Malus× domestica ( DQ535885 and DQ535886 ) ; EjLFY f rom Eriobotrya japonica
( AY551183) ; GinLFY , GinN DLY and N dly from Ginkgo biloba ( AF108228, AF105111 and AY656676) ; VvLFY ,
VvLFY 1 and VvrLFY f rom Vitis vinifera ( AF450278, AF378126 and AY126446 ) ; P FY from Carica papaya
( DQ054794) ; CtrsLFY 1 and CtrsLFY2 from Poncirus trif oliata ( AY970823 and AY970824 ); CsLFY from Citrus
sinensis ( AY338976); FcLFY fr om Fortunella crassifolia ( DQ497003)
3　讨论
金柑、 甜橙和枳是芸香科中不同属的植物 , 虽然它们的 LFY基因的核苷酸长度有细微的差异 , 分
别为 2 081 bp (金柑 )、 2 081 bp (甜橙 )、 2 083 bp (枳 1)、 2 084 bp (枳 2) , 但核苷酸长度的差异仅
是内含子的长度不同 , 它们的 3个外显子的长度完全相同 , 均编码 398个氨基酸 , 其 LFY同源基因的
核苷酸和氨基酸序列的同源性均高达 98% , 系统树结果也显示它们聚类在一起 ,说明 LFY基因序列在
同科不同属植物中相当保守。 LFY基因的这一特性可用于研究植物的进化过程。植物开花是一个复杂
的过程 , 受多基因和多种因素的控制。虽然金柑、 甜橙和枳的 LFY基因同源性高 , 但它们的开花特性
却不同。金柑在一年中具有多次开花、多次结果的特性 , LFY基因在金柑开花调控中究竟起何作用 ,目
前尚不清楚 , 有待进一步研究。
参考文献:
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(责任编辑　裴润梅 )
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