全 文 ：一种植物表达载体的构建及其
在金柑上的瞬时表达
张岚岚,刘小花,陈昆松,徐昌杰 *
(浙江大学华家池校区园艺系/农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室,杭州 310029)
摘 要:以植物表达载体pCambia1301的带内含子的 GUS(iGUS)基因替换植物表达载体 pBI121中的 GUS基因,构
建了以pBI121为基础载体并含有iGUS的植物表达载体 pLZ13。农杆菌染色表明,pCamiba1301和 pLZ13两载体中
的 iGUS基因均不会导致 GUS染色反应。以金柑不同组织为材料,通过农杆菌介导开展瞬时表达研究,结果表明,
pLZ13和pCambia1301两载体的iGUS在CaMV35S启动子调控下的表达没有差异,证明构建的 pLZ13是一种同时
适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体。
关键词:金柑;iGUS;瞬时表达;启动子;转基因;植物表达载体
中图分类号:S666.9 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)03-431-04
Constructionofaplantexpressionvectorandtransientgeneexpressionin
Kumquat(Fortunelacrassifolia)
ZHANGLan-lan,LIUXiao-hua,CHENKun-song,XUChang-jie*
(DepartmentofHorticulture,TheMinistryofAgriculturesKeyLaboratoryofHorticulturalPlantGrowth,Development&Biotechnology,
ZhejiangUniversity,Hangzhou,Zhejiang310029China)
Abstract:Aplantexpressionvector,pLZ13,wasconstructedbyreplacingtheGUSgeneinpBI121withtheintron-GUS
(iGUS)genefrompCambia1301.GUSstainingofAgrobacteriumcelscontainingpCambia1301orpLZ13indicatedthatGUS
stainingwaspreventedinbothcases.Atransientexpressionstudywascariedoutwithkumquattissuesassamples,andno
diferencewasobservedfortheGUSexpressionpaternsdrivenbytheCaMV35Spromotersfromthenewlyconstructedvector
pLZ13andpCambia1301.ThevectorpLZ13wasaplantexpressionvector,bothsuitablefortransientgeneexpressionand
transgenicresearch.
Keywords:Kumquat(Fortunelacrassifolia);iGUS;Transientexpression;Promoter;Transgenic;Plantexpressionvector
果 树 学 报 2008,25(2):431～434
JournalofFruitScience
基因工程技术是植物遗传改良的重要手段之
一,植物组织或发育阶段特异启动子的筛选和鉴定
是植物基因工程研究的重要内容。在启动子下游融
合一个报告基因,依据报告基因在不同时空或者处
理后的表达可研究启动子的功能。在这些研究中,稳
定遗传转化(转基因)和瞬时表达手段常被使用。
由于瞬时表达手段快速且简单,且不受遗传转
化难易的影响,广泛应用于特异启动子的初步筛选
和鉴定,特别是果实特异启动子的研究。内含子作为
真核与原核生物功能基因的重要差异,在真核生物
mRNA成熟过程中可被精确地切除,而在原核细胞
中则不会,故带内含子的GUS基因(iGUS)更适于瞬
时表达研究。
pBI121和 pCambia1301是最常用的植物表达
载体之一,不少转基因研究所用的表达载体以其为
骨架改造而成。pBI121含有GUS基因,不适于瞬时
表达研究;而pCambia1301因为采用潮霉素筛选体
系而在柑橘转基因研究中极少应用。转基因和瞬时
表达手段是鉴定启动子特性的2种有效手段,结合
使用最有说服力。基于pBI121和pCambia1301的植
物表达载体的各自优缺点,对于每个待研究的启动
子,需要分别构建基于pBI121和pCambia1301的植
收稿日期:2007-11-20 接受日期:2008-01-16
基金项目:国家自然科学基金(30370989、30100125);浙江省自然科学基金(301291)
作者简介:张岚岚,女,在读博士生。Tel:13185065965,E-mail:zlanapple@yahoo.com.cn
<通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:13216172048,E-mail:chjxu@zju.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.03.031
果 树 学 报 25卷
物表达载体,这不但增大了工作量,且由于应用了不
同载体不利于结果的相互印证。另外,pCambia1301
载体的启动子两侧缺乏常用内切酶位点,对更换启
动子带来很大不便。因此,作者旨在从载体pCam-
bia1301中酶切获得iGUS基因,然后替换pBI121中
的GUS基因,获得一个既适于转基因也可用于瞬时
表达研究的植物表达载体并进行表达验证。
1 材料和方法
1.1 材料
以金柑(FortunelacrassifoliaSwingle)组培苗的
根、茎、叶,金柑成年树的花瓣、子房、果实为实验试
材。根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株
GV3101,植物表达载体 pBI121和 pCmabia1301质
粒均为本实验室保存。试验所用的限制性内切酶
BstEI,NcoI,NotI,SacI,XbaI购自上海生工生物
工程技术服务有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及接头的制备 根据 pBI121表达
载体序列设计特异引物 35SUP1:5’-CAAATGC-
CATCATTGCGATA-3’,根据GUS基因序列设计特
异引物 GUSUP1:5’-TTTTCGCGATCCAGACTGAA-
3’,GUSUP2:5’-CTCATTACGGCAAAGTGTGGGTC
-3’,GUSDP1:5’-TTTTCGCGATCCAGACTGAA-3’,
GUSDP2:5’-ACCACGATGCCATGTTCATCTGC-3’,
GUSUP3:5’-GTTGGCGGTAACAAGAAAGGGAT-3’,
用于表达载体的PCR及测序验证。
根据酶切识别位点设计接头引物,BstEI-SacI-
UP:5’-GTGACCAGTCAGTCGAGCT-3’,BstEI-
SacI-DP:5’-CGACTGACTG-3’;XbaI-BamHI-
NcoI-UP:5’-CTAGAGGATCCC-3’,XbaI-BamHI-
NcoI-DP:5’-CATGGGGATCCT-3’。形成的接头为:
BstEI-SacI接头:
5’GTGACCAGTCAGTCGAGCT 3’;
3’ GTCAGTCAGC 5’;
XbaI-BamHI-NcoI接头:
5’CTAGAGGATCCC 3’;
3’ TCCTAGGGGTAC 5’。
接头由分别合成的2条引物组成,将上下游引
物(各 50μmol/L)等体积混合,在 PCR仪中运行
95℃,5min→ 65℃,10min→ 37℃,10min热循
环,产物冷却至室温后使用或于-18℃冻藏。
1.2.2 含 iGUS瞬时表达载体的构建 含 iGUS瞬
时表达载体的构建流程如图1所示。为引入SacI酶
切位点,本研究应用 pUCm-T载体作为辅助中间载
体。DNA的酶切、回收、连接、转化和重组质粒鉴定
参考Sambrook等[1]。
1.2.3 瞬时表达载体序列测定 以特异引物GUSDP1
和GUSUP3为测序引物,将pLZ13载体 PCR及酶切
验证阳性的重组质粒委托上海生工生物工程技术服
务有限公司测定鉴定。DNA序列分析采用Chromas
软件包进行。
1.2.4 表达载体转化根癌农杆菌 参照An[2]的方法
将构建的植物表达载体pLZ13导入根癌农杆菌
GV3101中。
1.2.5 含表达载体的农杆菌 GUS染色 取含有不
同 表 达 载 体 (pLZ13,pCambia1301,pBI121)的
GV3101农杆菌划单菌落,活化培养后取菌液10μL
加5μLGUS染色液 (3mgX-gluc溶于150μL二甲
替甲酰胺),37℃保温6h。观察其颜色变化,并拍
照。
1.2.6 根癌农杆菌介导的瞬时表达 瞬时表达操作
流程参考Spolaore等[3],略有改动。将含植物表达载
体的农杆菌 GV3101培养离心后沉淀用 MS液体培
养基悬浮;取金柑的根、茎、叶片、花瓣、子房、果实,
表面用75%乙醇漂洗;外植体用无菌解剖刀切割成
适宜大小,浸泡于含有农杆菌的MS液体培养基中,
真空抽滤10min;用滤纸吸干残留在外植体表面的
农杆菌,置于湿润无菌滤纸上24℃放置2d(16h光
周期),然后进行GUS组织染色。
1.2.7 GUS组织染色 参照 Jeferson等[4]用 X-gluc
进行组织化学染色。染色液组成:3mgX-gluc溶于
150μL二甲替甲酰胺;缓冲液组成:5mmol/L
K3Fe(CN)6,5mmol/LK4Fe(CN)6,0.1mol/L磷酸缓
冲液,1%TritonX-100;脱色液组成:50%乙醇 +
10%甲醛 +5%冰醋酸。取经农杆菌侵染后的外植
体,用缓冲液浸泡过夜后,加染色液染色,37℃温育
6～10h;吸干染色液,用脱色液脱色。观察组织颜色
变化,并拍照。
2 结果与分析
2.1 瞬时表达载体的鉴定
新 构 建 的 表 达 载 体 pLZ13经 GUSUP2+
GUSDP2,GUSUP1+GUSDP2,GUSDP1+35SUP1这 3
对引物PCR及XbaI+SacI双酶切鉴定,目的条带长
度与预期相符(图2)。为进一步检验经酶切连接后,
iGUS基因片段与pBI121载体大片段是否得到正确
连接,分别以 GUSDP1和 GUSUP3为引物进行测
432
3期 张岚岚等:一种植物表达载体的构建及其在金柑上的瞬时表达
序,发现接头处及目的片段序列完全与预期结果相
符(结果未列出)。
2.2 含不同表达载体的农杆菌GUS染色结果
含不同表达载体的农杆菌菌液经 GUS组
织 化 学染色。不含表达载体以及含有 pLZ13或
pCamibia1301(均携带iGUS基因)的农杆菌GV3101
染色结果均显示无色,而包含 pBI121(携带无内含
子的GUS基因)的农杆菌被染成蓝色(图版-a～d)。
2.3 农杆菌介导的瞬时表达GUS染色结果
分别以含有 pLZ13及 pCambia1301表达载体
的农杆菌转化金柑不同组织器官做瞬时表达研究
(图版-A1～F2)。2个载体中的具内含子GUS基因在
组成型CaMV35S启动子调控下,在金柑各个组织
中均表达。其中根、花瓣、果实组织有明显蓝色斑块
或斑点,茎段在横切面上蓝色较为明显。叶片和子房
中蓝色斑点较少且较淡。表明pLZ13载体中的iGUS
基因与 pCambia1301中的该基因功能相同,因而
pLZ13适于瞬时表达研究。
ligated
ligated
图1 pLZ13载体构建流程示意图
35S:CaMV35S启动子;NOS:NOS终止子;iGUS:含有内含子的GUS基因;GUS:不含内含子的GUS基因
Fig.1FlowchartforconstructionofpLZ13vector
35S:CaMV35Spromoter;NOS:NOSterminator;iGUS:intron-containingGUS;GUS:intronlessGUS
433
3 讨 论
启动子作为转录水平上一种重要的调控元件,
在基因表达调控中起着重要作用。近年来,研究特异
启动子功能及其调控因素已成为基因工程技术的重
要内容。不含内含子的GUS基因在农杆菌中可以正
常表达,因此,在瞬时表达研究中可造成严重干扰,
影响表达强度的准确检测。如GUS染色结果表明,
pBI121载体中不含内含子的 GUS基因在农杆菌中
可以得到表达。因此,若将pBI121载体用于瞬时表
达,将难以区分染色结果是由于农杆菌污染造成还
是GUS基因在植物组织中的瞬时表达所致。同时,
在稳定表达的转基因研究中,在初期检测时由于存
在农杆菌污染也使检测受到干扰。
为避免这一干扰,采用 iGUS基因作为瞬时表
达载体的报告基因已逐渐成为趋势[3,5-10]。由于原核
细胞在基因转录过程中没有剪接内含子的能力,因
而含有内含子的基因只能在真核细胞中进行表达而
不能在原核细胞中表达。对pCambia1301和pLZ13
(均含有iGUS基因)转化的农杆菌进行GUS染色所
得的结果也证实这一策略的可行性(图3)。
pBI121和 pCambia1301是最常用的 2种植物
表达载体之一,但前者不适于瞬时表达(GUS基因
在农杆菌中可表达)而后者不适于柑橘转基因(采用
潮霉素筛选,柑橘上此筛选体系尚不成熟)。因此,本
研究用pCambia1301中的iGUS基因替代pBI121中
的GUS基因,获得了一个兼具pCambia1301含农杆
菌中不表达的iGUS以及pBI121具有常用酶切位点
及卡那抗性基因优点的植物表达载体pLZ13。该载
体是一种既适于瞬时表达也可用于转基因研究的植
物表达载体。在后续研究中,我们分离了番茄果实特
异启动子2A11,并用其代替了pLZ13表达载体中的
CaMV35S启动子,应用本文建立的瞬时表达体系和
先前建立的转基因体系[11]对 2A11启动子在金柑中
的表达特性进行了探讨。(本文图版见封3)
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