全 文 ：Research Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
53(7) :710 － 722;4 July 2013
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn /actamicrocn
基金项目:国家自然科学基金(31070004)
* 通信作者。Tel:+ 86-835-2882710;E-mail:zhangxiaopingphd@ 126． com
作者简介:江华明 (1965 －) ，男，四川蓬溪人，博士研究生，主要从事微生物分子生物学研究。E-mail:jianghm06@ 163． com
收稿日期:2012-12-16;修回日期:2013-03-11
青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根
瘤菌的遗传多样性
江华明1，2，赵珂1，刘松青1，3，刘新春4，李仁全2，彭万仁2，张波1，张小平1*
1 四川农业大学资源环境学院，成都 611130
2 四川职业技术学院建筑与环境工程系，遂宁 629000
3 四川省水产学院，成都 611730
4 四川农业大学农学院，成都 611130
摘要:【目的】分离纯化青藏高原东麓(四川甘孜藏族自治州)高山豆根瘤菌，揭示其遗传多样性。【方法】采
用纯培养法从该地区高山豆植物根瘤中分离纯化根瘤菌;通过 BOXAIR、16S rDNA-RFLP 及 PCA(Principal
Component Analysis)来分析高山豆根瘤菌的遗传多样性;通过 16S rDNA序列同源性确定菌株的系统发育地
位;通过测定菌株的耐盐性、初始 pH生长范围及生长温度范围来分析高山豆根瘤菌的抗逆性。【结果】从 8
个县 12 个采样点共分离纯化出 22 个菌株。22 个菌株在 16S rDNA PCR-RFLP 分析中聚成 4 个遗传群，在
BOX-PCR分析中则聚成 9 个遗传群。高山豆根瘤菌 16S rDNASimpson遗传多样性指数 D = 0. 872。22 个菌
株分别属于 Rhizobium(11 /22 株)、Mesorhizobium(4 /22 株)、Rhizobium-Agrobacterium(7 /22 株)3 个属。生理
性状测定试验表明，所有菌株均能在 1% NaCl 的 YMA 培养基上生长，大多数(15 /22 株)菌株能在 4% NaCl
的 YMA培养基上生长，其中，SCAU679、SCAU694、SCAU706 等 3 个菌株能在 7% NaCl 的培养基上生长，
SCAU689 能在 8%NaCl的培养基上生长;15 /22 的菌株能在 pH4-11 的培养基上生长;16 /22 的菌株能在4 －
45℃条件下生长，所有菌株能在 60℃(处理 10 min后置 28℃)条件下生长。【结论】青藏高原东麓(四川甘孜
州)高山豆根瘤菌具有丰富的遗传多样性。大多数菌株对高盐、高温、低温及过酸过碱环境均具有很强的耐
受能力。
关键词: 青藏高原东麓，高山豆，根瘤菌，遗传多样性，主成分分析(PCA) ，系统发育
中图分类号:Q938 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2013)07-0710-03
在生物地球化学循环中，固氮生物是一类能在
生物细胞内经过复杂的新陈代谢过程将 N2 转化为
NH3 的原核微生物，从而通过生物途径实现了氮元
素在生物群落和无机环境之间的循环。全球每年自
然固氮量的 90%(2. 295 × 1011 kg)是通过固氮微生
物实现的［1］。其中，根瘤菌与豆科植物的共生体系
固氮能力强、固氮量大、抗逆性強，其共生固氮作用
是生物固氮中效率最高的体系，约占生物固氮总量
的 65%［2］。因此，研究和开发利用根瘤菌与豆科植
物的共生固氮体系具有巨大的生态、经济和社会价
DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2013.07.007
江华明等:青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根瘤菌……． /微生物学报(2013)53(7)
值。
青藏高原是地球上独具特色的一个地理单元，
具有独特的地质历史和自然条件，具有丰富的生物
多样性［3］。青藏高原东麓是指青海、西藏以及四川
三省区交界的广大地域。四川甘孜藏族自治州地处
青藏高原东南缘(青藏高原向云贵高原和四川盆地
的过渡地带) ，大地貌属横断山系北段的川西高原
区，山川呈南北纵列式排列。该州气候主要属青藏
高原气候，随高差呈明显的垂直分布状态，具有气温
低、冬季长、降水少、日照足的特点。四川甘孜州是
世界上自然生态最完整、气候垂直带谱与动植物资
源垂直分布最多的地区之一，也是我国重要的天然
物种基因库。
高山豆属植物在我国约有 5 种，主要分布于喜
马拉雅山区及青藏高原。四川有 4 种，在甘孜州均
有分布。其中，高山豆 Tibetia himalaica(Baker)H．
P． Tsui (异叶米口袋)为多年生草本植物，生于海拔
3000 － 5000 m的山区。茎叶为牛羊等家畜所喜食，
是早春恢复牲畜体力的良好饲料。根系发达，保持
水土能力强。全草有清热解毒、利尿的功能［4］。由
于高山豆的生存环境和分布范围特殊，目前对高山
豆根瘤菌的资源及多样性研究尚未见报道。
本研究从采集自四川甘孜州的高山豆根瘤中分
离出根瘤菌，测定了分离株的耐盐性、初始 pH 生长
范围及生长温度范围等生理指标，并采用 BOX-
PCR、16S rDNA PCR-RFLP及 16S rDNA序列分析等
方法，研究了该区域高山豆根瘤菌的遗传多样性，丰
富了我国高寒山区豆科植物根瘤菌的多样性研究工
作，可为该区域的生态恢复与重建提供优良根瘤菌
资源。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 根瘤样本的采集:从四川甘孜州康定、道孚、
炉霍、甘孜、新龙、理塘、稻城、雅江等 8 个县 12 个采
样点采集高山豆植物根瘤及土壤样品，并记录根瘤
的形状及结瘤部位(表 1)。
1. 1. 2 分离和纯化高山豆根瘤菌:高山豆根瘤菌的
分离和纯化参照 Vincent［5］的方法。用无菌水浸泡
清洗根瘤，再用 75%酒精和 0. 1% HgCl2 分别对根
瘤表面消毒 5 min和 3 min，在无菌培养皿中磨碎根
瘤，取根瘤悬液在 YMA平板上划线，置 28℃恒温箱
中培养 3 － 5 d，挑取表面湿润、光滑、突起、有多糖产
生的单菌落，采用划线法纯化、革兰氏染色镜检，纯
菌株接种于 YMA斜面，28℃培养 3 d，4℃短期保藏，
30%甘油管中 － 80℃长期保藏。
1. 2 BOX-PCR指纹分析
总 DNA 的提取参照 Little［6］的方法。提取的
DNA保存于 － 20℃备用。
BOX-PCR 指纹分析中，引物为 BOXAIR:5-
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3。 反 应 体 系
(25 μL)为:2 × PCR Mix 12. 5 μL;BOXAIR 引物
(10 μmol /L)0. 5 μL;模板 DNA(50 ng /mL)1. 0 μL;
双蒸水 11 μL;扩增程序:95℃初始变性 4 min;95℃
变性 1 min，54℃复性 1 min，65℃延伸 8 min，循环 35
次;65℃最终延伸 11 min。4℃保存。扩增产物经
2%浓度的琼脂糖凝胶电泳(80 V，2 h)检测，凝胶
UV成像系统成像，以 JPG形式保存。
1. 3 16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析
以总 DNA 为模板，选用来源于大肠杆菌 16S
rDNA基因序列保守区域的两段引物 P1 和 P6 来扩
增 16S rDNA。正向引物 P1:5-AGAGTTTGATCC
TGGCTCAGAACGAACGCT-3。其序列对应于 E． coli
第 8 － 37 碱基位置;反向引物 P6:5-TACGGCTACC
TTGTTACGACTTCACCCC-3。其序列对应于 E． coli
第 1479 － 1506 碱基位置。反应体系(30 μL) :2 ×
PCR Mix 15 μL;Primer 1(10 μmol /L)0. 5 μL;Primer
6(10 μmol /L) 0. 5 μL;模板 DNA(50 ng /μL)
0. 5 μL;双蒸水 13. 5 μL。PCR反应程序:92℃变性
3 min;94℃变性 l min，54℃退火 1 min，72℃延伸
2 min，循环 30 次;72℃最终延伸 10 min。4℃保存。
16S rDNA 扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳
(150 V，30 min)检测，UV 凝胶成像系统成像，JPG
形式保存。扩增片段长度为 1. 5 kb 左右，将扩增产
物保存于 － 20℃备用。
16S rDNA片段选用了 4 种限制性内切酶，分
别为 HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和 TaqⅠ。酶切反应体
系(10 μL) :5 μL PCR扩增产物，5 U内切酶，10 ×
酶切缓冲液 1 μL，双蒸水补足至 10 μL。37℃水浴
保温 6 － 10 h (Taq I为 65℃恒温 12 － 14 h) ，2 %
琼脂糖凝胶(含 EB)电泳(80 V)2 － 3 h(酶切产物
上样量 8 μL) ，UV凝胶成像系统成像，JPG 形式保
存。
117
Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
表 1 高山豆根瘤菌供试菌株及参比菌株
Table 1 The Characteristics of strains isolated from Tibetia himalaica and reference strains
Strain Host Living part Nodule shape Origin Position
Elevation
(m)
SCAU667 Tibetia himalaica lateral root elipsoid
Lucheng，Kangding
(泸城，康定)
N 30°0058. 7″
E 101°5135. 3″
3610
SCAU669
SCAU670
SCAU671
SCAU672
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
main root
main root
main root
main root
elipsoid
elipsoid
elipsoid
elipsoid
Lucheng，Kangding
(泸城，康定)
N 29°5606. 0″
E 101°5734. 8″
3190
SCAU674
SCAU675
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
spherical
spherical
Xinduqiao，Kangding
(新都桥，康定)
N 30°0901. 4″
E 101°2947. 0″
3500
SCAU679
SCAU680
SCAU681
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
lateral root
ellipsoid
elipsoid
elipsoid
Bamei，Daofu
(八美，道孚)
N 30°1754. 2″
E 101°3145. 3
3730
SCAU684 Tibetia himalaica Lateral root elipsoid
Bamei，Daofu
(八美，道孚)
N 30°3232. 5″
E 101°2632. 4″
3450
SCAU685 Tibetia himalaica lateral root elipsoid
Yade，Luhuo
(雅德，炉霍)
N 31°2721. 0″
E 100°3421. 2″
3270
SCAU688
SCAU689
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
spherical
spherical
Tuoba，Gangzi
(拖坝，甘孜)
N 31°3445. 5″
E 100°0549. 2″
3440
SCAU691
SCAU694
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
elipsoid
elipsoid
Dagai，Xinlong
(大盖，新龙)
N 31°2454. 9″
E 100°1009. 7″
3280
SCAU696 Tibetia himalaica lateral root spherical
Mode，Litang
(莫德，理塘)
N 30°0953. 3″
E 100°1931. 7″
4120
SCAU700
SCAU701
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
elipsoid
elipsoid
Rubuchaka，Daocheng
(茹布查卡，稻城)
N 29°0134. 0″
E 100°1927. 1″
3750
SCAU703
SCAU704
Tibetia himalaica
Tibetia himalaica
lateral root
lateral root
spherical
spherical
Leidazan，Yajiang
(雷达站，雅江)
N 30°0935. 5″
E 100°3505. 5″
4370
SCAU706 Tibetia himalaica lateral root elipsoid
Xiongba，Litang
(雄巴，理塘)
N 29°4332. 2″
E 100°2420. 1
3640
M． austylicum
WSM2073T
Biserrula pelecinus Australia
M． huakuii
CCBAU 2609T
Astragalus sinicus
Nanjing，China
(南京)
R． sullae IS123T Hedysarum coronarium
Xinjiang，China
(新疆)
S． meliloti ATCC9930T Medicagosativa USA
M． septentrionale SDW 014T Astragalus dsurgens
Liaoning，China
(辽宁)
M． temperatum SDW018T Astragalus dsurgens
Liaoning，China
(辽宁
M． tianshanense CCBAU 3306T
M． ciceri ATCC5158T
Glycyrrhiza allidiflora
Cicer arietinum
Xinjiang，China
(新疆)Spain
M． amorphae ACCC 19665T Amorpha fruticosa
Beijing，China
(北京)
R． leguminosarum USDA2370T Pisum sativum USA
R． etli CFN42T Phaseolus vulgaris CNPBS
R． leguminosarum 127K17
Ag． tumefaciens ATCC 23308T
Ag． rubi ATCC13335T
Phaseolus sp． USA
217
江华明等:青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根瘤菌……． /微生物学报(2013)53(7)
1. 4 供试菌株 16S rDNA 序列测定及系统发育分
析
扩增全部 22 株供试菌株的 16S rDNA 片段(反
应体系和程序同 1. 3) ，扩增产物(1500 bp)经检测
后送北京华大基因有限公司测定序列。
1. 5 菌株生理特性分析
对 22 株根瘤菌分别进行耐盐性、初始 pH 生长
范围及生长温度范围的测定。
耐盐性测定:在 YMA培养基中加入 NaCl，使其
终浓度分别为 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、
8%。对每个菌株在同一浓度的测定均设 9 个重复
实验。以不含 NaCl 的 YMA 平扳为阳性对照。接
种、培养、观察和结果记录。
初始 pH生长范围测定:在倒平板前，用灭菌的
HCl和 NaOH 将 YMA 培养基的 pH 调至 4. 0、5. 0、
9. 0、10. 0、11. 0。对每个菌株在同一 pH 的测定均
设 9 个重复实验。以 pH7. 0 的 YMA 平扳为阳性对
照。接种、培养、观察和结果记录。
生长温度范围测定:将供试菌株接种到 YMA
平板上，以在 28℃生长的平板为阳性对照，分别在
4℃、10℃、37℃、45℃条件下培养，60℃则处理 10
min后于 28℃培养。对每个菌株在同一温度条件的
测定均设 9 个重复实验。接种、培养、观察和结果记
录。
1. 6 数据分析和处理
凝胶扫描成像系统摄取的凝胶图像经均一化处
理后，按有条带处以“1”表示、无条带处以“0”表示，
将其转化为“1”和“0”数字符，采用 Nei［7］的方法计
算材料间遗传相似系数(GS) ，GS = 2Nij /(Ni + Nj) ，
其中，Ni 代表第 i 个品种的扩增带纹数目，Nj 代表
第 j个品种的扩增带纹数目，Nij 代表第 i、j 个品种
间共有的带纹数目。再通过 NTSYS2. 10e 软件中的
基于非加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分
析，并转化为树状图谱;利用 NTSYS-pc(Version
2. 10e)软件进行 GS 相似性系数分析，并通过
EIGEN 程序进行主成分分析;将所测供试菌株 16S
rDNA 序列提交 GenBank 数据库，获取序列号
(Accession no． KC331056—KC331070)。采用 Blast
search 在线分析及 DNAMAN 6. 0 软件进行序列比
对，找出各序列在 NCBI 数据库中最近缘种的模式
菌株序列，再用 MEGA 5. 0 中的 Clustal X 程序进行
多序列比对，然后用 Neighbor-Joining 方法选择
Bootstrap为 1000 个重复构建系统发育学进化树。
2 结果
2. 1 供试菌株
本研究将共分离得到的 22 个根瘤菌菌株作为
供 试 菌 株，另 外，选 取 了 属 于 Rhizobium、
Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium 的参比菌
株 14 个(表 1)。
2. 2 BOX-PCR指纹分析
2. 1. 1 UPGMA 聚类分析:以各菌株总 DNA 为模
板，BOXAIR为引物，对 22 株供试高山豆根瘤菌进
行 BOX-PCR，在 2%琼脂糖凝胶电泳板上得到 BOX-
PCR指纹图谱(图 1)。
将 22 株供试高山豆根瘤菌及 15 株参比菌株电
泳图谱条带转换成“1”和“0”，采用 NTSYS 软件中
的非加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，
得到 BOX-PCR聚类树状图(图 2)。
聚类结果显示，36 个菌株在 82%相似系数水平
上分为 9 个遗传群，其余 5 个菌株则各自单独分开。
其中，22 个供试菌株分别聚在 8 个不同的遗传群
中，而 SCAU679 则单独分开。在 8 个遗传群中，除
SCAU681 与 R． sullae IS123T;SCAU703、SCAU706 与
M． amorphae ACCC 19665T聚群外，其余供试菌株均
未与参比菌株聚群。聚在一起的一般都是地理分布
很近的菌株，但来自同一地理环境同一个宿主的不
同菌株也可能聚在不同的群中，如 SCAU679、
SCAU680、SCAU681 均分离自同一个宿主，但分别聚
在群Ⅲ、群Ⅱ和群Ⅶ 1 中;SCAU669、SCAU670、
SCAU671、SCAU672 均分离自同一个宿主，但分别聚
在群Ⅰ1、群Ⅴ和群Ⅵ中。
22 个菌株 BOX-PCR 电泳条带两两间的 CS 相
似系数分布在 0. 535714 － 1. 00。其中，SCAU694、
SCAU696、SCAU700 分别与 SCAU670、SCAU671、
SCAU672，SCAU703 和 SCAU688 的相似系数最低，
均为 0. 535714，表明它们之间的亲缘关系较远。而
SCAU670 和 SCAU671，SCAU684 和 SCAU685 的相
似系数均为 1. 0，表明它们可能分别为同一个菌株。
317
Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
图 1．高山豆根瘤菌 BOX － PCR 指纹图谱
Figure 1． BOX － PCR finger prints for Rhizobial in Tibetia himalaica． M:250bp Marker． lane 1:SCAU667;lane 2 :
SCAU669;lane 3:SCAU670;lane 4:SCAU671;lane 5:SCAU672;lane 6 :SCAU674;lane 7:SCAU675;lane 8:
SCAU679;lane 9:SCAU680;lane 10:SCAU681;lane 11:SCAU684;lane 12:SCAU685;lane 13:SCAU688;lane 14:
SCAU689;lane 15:SCAU691;lane 16 SCAU694;lane 17:SCAU696;lane 18:SCAU700;lane 19:SCAU701;lane 20:
SCAU703;lane 21:SCAU704;lane 22:SCAU706．
图 2． BOX-PCR聚类分析图
Figure 2． The dendrogram based on BOX-PCR fingerprints．
2. 1. 2 主成分分析:主成分分析能从不同方向、不
同层面显示各菌株间的关系，使菌株的聚类更加直
观、更为合理［8］。应用 NTSYS-pc(Versin 2. 10e)软
件对 36 个菌株 BOX-PCR的相似系数进行主成分分
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江华明等:青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根瘤菌……． /微生物学报(2013)53(7)
析，用 EIGEN 程序建立主成分之间的三维关系图
(图 3) ，前 3 个主坐标所能解释的相关性分别为
22. 18%、12. 02%和 9. 75%。结果显示，主坐标分
析和系统聚类分析所得结果基本一致:群Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、
Ⅺ的组成在两种分析中完全一致。在 PCA 中，
SCAU667 与 SCAU684、SCAU685 聚 成 群 Ⅲ;
SCAU679、SCAU680、SCAU669 虽然在第三主成分上
有差异，但在第一、二主成分上非常相似，因此构成
群Ⅲ;SCAU689 与 SCAU688、SCAU701 聚成群Ⅻ;
SCAU672与M． tianshanense CCBAU 3306 T聚成群Ⅳ。
图 3．高山豆根瘤菌及参比菌株 BOXAIR -PCR主成分分析三维图
Figure 3． The 3-d Principal component analysis for BOX-PCRof strains isolated from Tibetia himalaica and
reference strains． I:16 SCAU694;17 SCAU696;18 SCAU700 Ⅱ: Ⅱ1:11 SCAU684;12 SCAU685;1
SCAU667 Ⅱ2:21 SCAU704;Ⅲ:8 SCAU679;9 SCAU680;2 SCAU669;Ⅳ:5 SCAU672;30 M． tianshanense
CCBAU 3306T Ⅴ: 3 SCAU670;4 SCAU671;Ⅵ:15 SCAU691Ⅶ:Ⅶ1: 10 SCAU681;37 Ag． rubi
ATCC13335T;24M． huakuii CCBAU 2609 T;Ⅶ2:26 R． sullae IS123T;31 M． ciceri;ATCC5158T;32 R．
leguminosarum USDA2370T;Ⅷ:23 M． austylicum WSM2073T;29 M． temperatum SDW 018 T;25 M． tarimense
CCBAU 83306 T;Ⅸ:20 SCAU703;35 M． amorphae ACCC 19665 T;28 M． septentrionale SDW 014 T;Ⅹ:22
SCAU706;Ⅺ:6 SCAU674;7 SCAU675;Ⅻ: 13 SCAU688;19 SCAU701;14 SCAU689;ⅩⅢ: 33 R． etli
CFN42T;34 R． leguminosarum127K17;36 Ag． tumefaciens ATCC 23308T ．
2. 2 16S rDNA PCR-RFLP聚类分析
2. 2. 1 UPGMA 聚类分析:以 P1 和 P6 为引物对
36 个菌株(22 个供试菌株和 14 个参比菌株)的 16S
rDNA进行特异性扩增，分别用 HaeIII、MspI、HinfI和
TaqI对扩增的 1. 5 kb 片段进行酶切，2%琼脂糖凝
胶(含 EB)电泳形成图谱(22 个供试菌株的 4 种限
制性内切酶酶切图谱类型的组合见图 4)。对 36 个
菌株的 16S rDNA扩增产物的酶切条带利用 UPGMA
进行聚类分析并生成树状图谱(图 4)。
聚类结果表明，在 84. 8%的相似性水平上，22
个高山豆根瘤菌菌株聚成 4 个类群，其中，类群 I 有
15 个菌株，包含 2 个亚群(I1，I2) ;类群 III 有 2 个菌
株;SCAU704 则单独分开;类群 V 包括 2 个亚群:
V1 有 3 个菌株，V2 仅有 SCAU703。聚在同一个
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Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
图 4．高山豆根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP聚类及供试菌株酶切图谱类型的组合
Figure 4． The dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP (A)and the finger prints digested by HaeIII、HinfI、MspI and TaqI(B)．
(亚)群的菌株生长环境的海拔大多相近(500 m 以
内) ，但也有高差近 1000 m 的类型，如 SCAU685
(3270 m)与 SCAU696(4120 m) ，土壤环境也差异较
大(表 2)。
将采用 UPGMA 法进行聚类分析的结果转换为
协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关
性进行 Mantel 检验。结果表明，2 种矩阵显著相关，
相关系数 r = 0. 918，P = 0. 005，说明聚类结果能较
准确地反映菌株之间的遗传关系。
22 个供试菌株 4 种酶酶切后共形成 12 种基因
型(图 4) ，通过 Simpson指数公式 D =1 － ΣPi2(Pi为
l6S rDNA某基因型个体数占总个体数的比例，即第
i个等位基因变异出现的频率)计算出高山豆根瘤
菌遗传多样性指数 D =0. 872，表明该地区高山豆根
瘤菌具有丰富的遗传多样性。
2. 2. 2 主成分分析:应用 NTSYS-pc(Versin 2. 10e)
软件对 36 个菌株 16S rDNA-PCR 的相似系数进行
主成分分析，用 EIGEN 程序作主成分之间的三维关
系图(图 5) ，前 3 个主成分所能解释的相关性分别
为 40. 2%、14. 08%和 9. 95%。22 个供试菌株的主
成分分析和 16S rDNA PCR-RFLP 聚类分析结果基
本上一致:类群Ⅰ11、Ⅰ12及 V1 在主成分分析和聚类
分析结果中完全一致，共 16 个菌株。但在 PCA 中，
SCAU703 和 SCAU669、SCAU680 聚 成 群 Ⅲ;
SCAU689、SCAU706 和 SCAU704 聚成群 IV。供试
菌株在两种分析结果中均未与参比菌株聚在一起，
表明 22 个供试菌株与 14 个参比菌株有较大的遗传
差异性。
2. 3 高山豆根瘤菌 16S rDNA 序列测定和系统发
育分析
将 22 个菌株的 16S rDNA 扩增产物送北京华大
基因科技股份有限公司进行测序。根据 BOXAIR、
16S rDNA-RFLP 及 PCA 的综合分析，选择其中 15
个代表菌株的 16S rDNA序列与从 GenBank(NCBI)
中获得的参比菌株(表 1)的序列进行多重序列比
对，用 SeqPup (0. 5version)软件进行录入，数据经编
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江华明等:青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根瘤菌……． /微生物学报(2013)53(7)
图 5．高山豆根瘤菌及参比菌株 16S rDNA-PCR主成分分析三维图
Figure 5． The 3-d PCA for 16S rDNA-PCR of strains isolated from Tibetia himalaica and reference strains．
辑后用 Clustal X和 Treeconw 软件包分析，构建出以
16S rDNA 序列为基础的系统发育树状图(图 6) ，并
使用 DNAMAN 计算各测试菌株间 16S rDNA 序列
的相似性值［9 － 10］。15 个代表菌株在系统发育树状
图 中 分 成 3 个 遗 传 群:SCAU670、SCAU671、
SCAU672 与 Mesorhizobium australicum WSM2073T聚
群;SCAU689 与 Rhizobium etliCFN 42T 聚 群;
SCAU669、SCAU704、SCAU706 与 Rhizobium sp． G2-
7 聚群;其余 8 个菌株与 Rhizobium-Agrobacterium 聚
群。这与供试菌株 16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果
基本一致。
2. 4 高山豆根瘤菌抗逆性分析
对 22 个菌株分别进行耐盐性、初始 pH 生长范
围及生长温度的测定，并对其宿主植株根际土壤的
酸碱度和含水量进行检测，结果见表 2。
16 /22 的菌株既能在 4℃又能在 45℃的恒温条
件下生长，2 /22 的菌株能在 10 － 37℃的恒温条件下
生长，4 /22 的菌株只能在 10 － 28℃的恒温条件下生
长，所有菌株能在 60℃(处理 10 min 后置 28℃)条
件下生长。表明供试根瘤菌对温度的适应范围较
宽，对温度的耐受性表现出较大的多样性。15 /22
的菌株能在 pH4 － 11 的培养基上生长。所有菌株
均能在 1% NaCl 的 YMA 培养基上生长，大多数
(15 /22)菌株能在 4% NaCl 的 YMA 培养基上生长，
其中，SCAU679、SCAU694、SCAU706 等 3 个菌株能
在 7% NaCl 的培养基上生长，SCAU689 能在 8%
NaCl的培养基上生长。
3 讨论
16S rDNA-RFLP 分析是一种简便快速的方法，
其限制性酶切图谱类型具有种甚至菌株的特异性，
目前在根瘤菌种内遗传多样性和种间系统发育关系
研究中广泛应用［11］。
BOX-PCR则利用了根瘤菌基因组中存在的重
复序列来反映菌株间的遗传差异。BOX-PCR 指纹
图谱对基因组进行分析，产生了大量遗传类型，具有
菌株的特异性［12］。22 个高山豆根瘤菌菌株在 16S
rDNA PCR-RFLP分析中聚成 4 个类群，在 BOX-PCR
分析中则聚成 9 个类群，很多在 16S rDNA PCR-
RFLP中具有相同遗传类型的菌株也有较大差异，
因此，和 16S rDNA PCR-RFLP 结果相比较，BOX-
PCR指纹图谱分析揭示的遗传信息更为丰富［13］。
采用两种方法对 22 个高山豆根瘤菌菌株和 14 个参
717
Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
图 6．供试菌株 16S rDNA 系统发育树状图
Figure 6． Phylogenetic tree analysis of 16S rDNA of rhizobial bacteria． The tree was constructed by neighbor-joining(NJ)using
the Kimura2-parameter model available in the MEGA4. 0s of tware，based on the sequences of actinomycetes partial 16S rDNA
gene and the reference strains． The scale bar corresponds to 0. 01 substitutions per nucleotide position． Number in parentheses
represent the sequence accession numbers in GenBank．
比菌株进行聚类结果较为一致，均显示:除少数供试
菌株与参比菌株聚在一起外，其它供试菌株都独自
成群，表明大多数供试菌株和参比菌株间有较大的
遗传差异，高山豆根瘤菌具有丰富的遗传多样性。
是否预示着有潜在的新种，尚需进行功能基因的分
析。22 个高山豆根瘤菌菌株分属 Mesorhizobium、
Rhizobium，分布在海拔 3190 － 4370 m的高差范围内
(表 1) ，植株小生境和土壤环境也有较大差异，这表
明处于不同环境的同一种宿主植物，可以与不同遗
传性状、不同种甚至不同属的根瘤菌建立共生关系。
这与 陈 强 等［14］ 的 研 究 结 果 一 致。 SCAU679、
SCAU680、SCAU681 等 3 个 菌 株 和 SCAU669、
SCAU670、SCAU671、SCAU672 等 4 个菌株(分属
Rhizobium、Mesorhizobium)均分别来自同一地理环境
中的同一个宿主，但在 2 种聚类分析结果中均聚在
不同的群中，因此，从同一环境同株宿主植物分离的
菌株可分别聚在不同的遗传群。 SCAU694 和
SCAU696 在两种聚类分析中均聚在同一个遗传群，
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江华明等:青藏高原东麓高山豆［Tibetia himalaica(Baker)H． P． Tsui］根瘤菌……． /微生物学报(2013)53(7)
但 SCAU694 与生长在海拔 3280 m的高山豆植株共
生，而 SCAU696 与生长在海拔 4120 m 的高山豆植
株共生。上述结果表明，根瘤菌的分类聚群与宿主
之间没有明显的对应关系15 － 16］。进一步表明根瘤
菌与豆科植物的共生关系是菌株、植物和环境相互
作用的结果［2］。
表 2．高山豆根瘤菌抗逆性状测定
Table 2． Phenotypic characteristics of isolates of Tibetia himalaica
Strains Max［NaCl］/% pH range T /℃ pH of soil Soil moisture /%
SCAU667 2 4 － 11 4 － 45 6. 31 38. 64
SCAU669 2 4 － 11 4 － 45 4 99
SCAU670
SCAU671
SCAU672
1 5 － 8 10 － 28 4 99
SCAU674 4 5 － 8 10 － 37 6. 10 28. 60
SCAU675 3 5 － 8 10 － 37 6. 10 28. 60
SCAU679 7D 4 － 11 4 － 45 6. 13 44. 84
SCAU680 4 4 － 11 4 － 45 6. 13 44. 84
SCAU681 4 4 － 11 4 － 45 6. 13 44. 84
SCAU684 4 4 － 11 4 － 45 6. 36 30. 47
SCAU685 4 4 － 11 4 － 45 6. 93 21. 49
SCAU688 6D 4 － 11 4 － 45 7. 07 30. 49
SCAU689 8 4D － 9 4 － 45 7. 07 30. 49
SCAU691 5 4 － 11 4 － 45 6. 21 13. 72
SCAU694 7D 4 － 11 4 － 45 6. 21 13. 72
SCAU696 5 5 － 11 4 － 45 5. 98 49. 72
SCAU700 5 4 － 11 4 － 45 7. 03 41. 20
SCAU701 4 4 － 11 4 － 45 7. 03 41. 20
SCAU703 3 5 － 8 10 － 28 5. 68 27. 19
SCAU704 5 4 － 11 4 － 45 5. 68 27. 19
SCAU706 7D 4 － 11 4 － 45 6. 21 13. 72
D:Delayed growth and small colonies;4℃:cultured for 30d．
16S rDNA序列分析是能较精确地揭示根瘤菌
的系统进化关系的一个重要手段［17］。16S rDNA 序
列比对结果表明，22 个高山豆根瘤菌株分别属于
Rhizobium(11 /22 株)、Mesorhizobium (4 /22 株)、
Rhizobium-Agrobacterium(7 /22 株)3 个属。在系统
发育树状图中，属 Rhizobium的 SCAU675、SCAU679、
SCAU685、SCAU681、SCAU688、SCAU701 也 与
Agrobacterium 聚在一起，表明根瘤菌属与土壤杆菌
属在种的系统发育上互有交叉，这与 Kwon 等的研
究结果相一致［18］。
一般认为，根瘤菌的最适生长温度为 25 －
30℃，只有少数苜蓿根瘤菌菌株在 42. 5℃下生长，
极少数根瘤菌 4℃条件下生长［19］，根瘤菌在 60℃条
件下处理 5 min即全部被杀死［20］。
对高山豆供试菌株生长温度测定结果显示，16 /
22 株菌(属 Rhizobium)既能在 4 － 45℃的恒温条件
下生长，所有菌株能在 60℃ (处理 10 min 后置
28℃)条件下生长。表明高山豆供试菌株耐低温和
高温的能力普遍都很强。另外，4 /22 株菌(属
Mesorhizobium)能在 10 － 28℃的恒温条件下生长，2 /
22 株菌(属 Rhizobium)能在 10 － 37℃的条件下生
长。表明高山豆根瘤菌适应高寒环境的能力是宿主
植物、无机环境因子对菌株长期自然选择的结果，在
相同环境条件下根瘤菌适应能力的高低是由其遗传
差异性决定的。
根瘤菌生长的最适 pH 为 6 － 7。22 个高山豆
根瘤菌菌株的宿主植物生长的土壤 pH 在 4 － 7. 07
之间，均属酸性、中性偏酸环境，而所有菌株均能在
pH4 或 5 的培养基上生长，其中，15 /22 株菌能在
pH4 － 11 的培养基上生长，这一方面表明了高山豆
根瘤菌与酸性土壤条件的相关性。另一方面，又表
现出高山豆根瘤菌大多具有既耐酸又耐碱的能力。
这表明植物内生菌耐酸碱能力不仅与无机环境有
关，还可能与宿主植物的生理活动有关。
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Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
SCAU669、SCAU670、SCAU671、SCAU672 均分
离自同一个植株，该植株生长的土壤 pH = 4，但
SCAU669(属 Rhizobium)能耐受 pH4-11 的生长环
境，而 SCAU670、 SCAU671、 SCAU672 (均 属
Mesorhizobium)只能在 pH5 － 8 的培养基上生长，表
明同一宿主不同菌株的耐酸碱能力也有明显差异，
这种差异性可能与根瘤菌产酸或产碱的生理特性所
决定，分泌酸的根瘤菌对偏碱的条件耐受性较
强［21］。
在影响微生物生长的胁迫因素中，盐分被认为
是最具危害性的非生物类胁迫因素之一［22］。高山
豆根瘤菌所有菌株均能在 1% NaCl 的 YMA 培养基
上生长，大多数(15 /22)菌株能在 4% NaCl 的 YMA
培养基上生长，其中，SCAU679、SCAU694、SCAU706
等 3 个菌株能在 7% NaCl 的培养基上生长，
SCAU689 能在 8% NaCl 的培养基上生长。表明与
同一宿主共生的根瘤菌在不同环境中的耐盐能力具
有菌株的差异性。另外，耐盐性较弱的 SCAU669
(2%)、SCAU670(1%)、SCAU671(1%)、SCAU672
(1%)共生植株生长土壤的含水量为 99%，而耐盐
性较强的 SCAU679、SCAU694、SCAU706、SCAU689
共生植株生长土壤的含水量分别为 44. 84%、
13. 72%、13. 72%、30. 49%，这在一定程度上表明根
瘤菌的耐盐性与宿主植物生长土壤的含水量有关，
土壤的含水量越低(越干旱) ，菌株的耐盐能力越
强。
大部分根瘤菌对高盐、过高过低 pH 和高温低
温等因素都比较敏感，这些因素会影响根瘤菌的固
氮能力和豆科植物产量的提高［23］，而生长在高寒地
区的根瘤菌在长期的自然选择过程中，形成了与自
然环境条件相适应的耐高盐、耐过酸过碱和耐高温
低温的类型，因此，研究高寒地区豆科植物根瘤菌的
遗传多样性和抗逆性，能为选育具有较强抗性基因
的菌种提供资源，为进一步在可持续发展农业中应
用这些根瘤菌提高豆科植物的产量和储藏量奠定基
础。
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127
Huaming Jiang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2013)53(7)
Genetic diversity of rhizobial bacteria nodulating Tibetia
Himalaica in eastern Qinghai-Tibet plateau
Huaming Jiang1，2， Ke Zhao1， Songqing Liu1，3， Xinchun Liu4， Renquan Li2，
Wanren Peng2，Bo Zhang1，Xiaoping Zhang1*
1Department of Microbiology，College of Resource and Environmental Sciences，Sichuan Agricultural University，Chengdu
611130，China
2Sichuan Vocational and Technical college ，Suining 629000，China
3Sichuan School of Fisheries，Chengdu 611730，China
4 Agronomy College，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China
Abstract:［Objective］Genetic diversity of the rhizobial bacteria nodulating Tibetia himalaica in the eastern part of
Qinghai-Tibet Plateau (Ganzi State，Sichuan)were evaluated． ［Methods］The pure culture method was used for isolating
the rhiobial strains from the nodules． BOXAIR，16S rDNA sequences，16S rDNA PCR-RFLP and Principal Component
Analysis (PCA)were used to determine the genetic diversity and phylogenetic relationships． The growth in different salt
contents，pH and temperatures were tested．［Results］In total 22 strains were isolated from 12 samples in 8 counties． The
strains tested were classified into 4 clusters in 16S rDNA PCR-RFLP，and 8 clusters were formed in BOXAIR． The 16S
rDNA Simpson genetic diversity index was D = 0. 872． The strains tested were closely related to Rhizobium (11 /22
strains) ，Mesorhizobium (4 /22 strains)and Rhizobium-Agrobacterium (7 /22 strains)． All strains could regularly grow in
YMA medium amended with 1 % NaCl，and 15 /22 strains could grow in 4 % NaCl． SCAU679，SCAU694and SCAU706
could adapt to 7 % NaCl，while SCAU689 could tolerant 8 % NaCl． Among the strains tested，15 strains could grow in
the pH range from 4. 0 to 11;16 isolates grew well from 4 to 45 ℃，and all of 22 strains could grow at 28 ℃ after
treatment at 60℃ for 10 min． ［Conclusion］This study revealed the high genetic diversity of the rhizobia isolated from
Tibetia himalaica in the eastern part of Qinghai-Tibet Plateau． The strains tested were adapted to high salt，different range
of temperatures and pH．
Keywords:Qinghai-Tibet plateau，Tibetia himalaica，rhizobial，genetic diversity，PCA (Principal component analysis) ，
phylogeny
( 本文责编: 张晓丽)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31070004)
* Corresponding author． Tel:+ 86-835-2882710;E-mail:zhangxiaopingphd@ 126． com
Received :16 December 2012 /Revised:11 March 2013
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