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i~6Ade和Hi~6Ade对芸扁豆和棉豆愈伤组织细胞分裂素氧化酶的影响



全 文 :第8 2卷 第 2期
9 18 9年
中山大学学报 (自然科学版)
C AT AS CI EN T I R U AM N T AU R L I U AM
U N I V ER S I T T I AS S U N Y AT S EN I
V o l
.
28 凡. 2
198 9
i
6
Aed 和H i 6Ad e对芸扁豆和棉豆愈伤
组织细胞分裂素氧化酶的影响`
黄 学 林
(生物学系)
摘 要
异戈烯荃腺镖吟 (i “ d Ae) 和异戊烷基腺嘿吟 (H i “ d Ae) 均可诱导棉豆和芸扁豆愈伤组织
中 细胞分裂素氧化酶 (CK O) 的活性 , 但有差异 . 对芸扁豆愈伤组织带饱和侧链的 H i “ A d e
对 C K O 的诱导效应比带非饱和侧链的 i“ A d e强 2 一 3 倍 , 而刘一棉豆愈伤组织这两个化合 物
的诱导效应却很相似 . 表明这两个化合物在促进愈伤组织生民中所显示的结构一活性差异性
与其诱导 C K O 活性差异有着一定的联系 .
关键词 棉豆 , 芸扁豆 , 愈伤组织 , 细胞分裂 素氧化酶 , 异少戈烯基腺噪岭 , 异戊烷 基 腺 喋 吟
C h a t f i e l d和 A r m s t r o n g ( 1 9 8 6 )研究 了芸扁豆愈伤组织 t户细胞分裂素氧化酶 ( C K O )
的一些特性 , 发现外源的细胞分裂素如 H i “ A de 和 i 6 A de 等 可以 诱 一导该愈伤组织的细胞
分裂素氧化酶 , 但棉豆愈伤组织中该酶的研究尚未见报导 。 为 了探明芸扁豆和棉豆愈伤
组织的生长对细胞分裂素反应的差异是否 与其体内的 C K O 诱导性差异有关 , 本文研究
了 H i“ A d e和 i“ A d e 对 棉豆愈伤组织的 C K O 活性的影响 , 并与芸扁豆愈伤组织的该酶诱
导活性作了比较 .
1 材料和方法
1一 材料 芸 扁豆 ( P h a s e o l u s v u l g a r i s L . e v . G r e a t N o r t h e r )和棉豆 ( P . l u n a t u s
L
.
cy
.
K in g s t o n ) 愈伤组织按文献 〔1〕方法 , 各 白从萌发 5 天后 的 幼 苗胚 轴切段诱导
而成并进行培养 .
1
.
2 H i
6
A d e 和 i“ A d e 处理愈伤组织的方法
当愈伤组织鲜重每瓶约达 10 克时 ( 50 m l培养基植入 3 块愈伤组织 , 培 养 约 3 周 ) ,
本文 1 9 8 8年 1 月 29 日收到
. 本研究完成于美国俄勒岗州立大学 , D r . A r m s t r o n g实验室
略语 : C K O 细胞分裂素氧化酶 C y t o k i n i n o x i d a s e
j 6A d 。 : 异戊烯基腺嗦吟〔 N ` 一 (△ 2 一 i s o p e n t e o y l ) a d e n i n e 〕 , H , 6 A d e : 异戊烷基腺嚓
吟〔 N ` 一 i s o p e n , 1 a d e o i n e〕 , 内 e : 腺嘿吟〔a d e n i n e 〕 , P , P P : 聚乙烯聚毗咯烷酮
〔 P o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e〕 , P o l y m i n p : 一种聚环乙亚胺〔P o l y e t h y l e n m i n 亡〕
6 0中山大学学报( 自然科学版 )第 28卷
按每克愈伤组织鲜重加 o .lm l 1 0m m ol/ 1H i”A d e或 i“A d e水溶液的比例 , 将处理溶液直
接滴在愈伤组织 的表面上 〔 2 〕 ,经若干小时后 ( 27 “ C , 光下 )用于细胞分裂素氧化酶提取 .
1
.
3 细胞分裂素氧化酶的提取
参考文献〔 2 〕方法适当修改后提取细胞分裂素氧化酶 。
1
.
4 细胞分裂素氧化酶的活性测定
C K O 酶活性的分析是基于细胞分裂素氧化酶氧化带不饱和侧链的细胞 分 裂 素一一
异戊烯基腺嗓吟产生腺嚷吟的原理而进行的 , 酶活性分另l] 以每小时每 m g酶蛋 白质转化 底
物成腺嘿吟的 n m ol 数表示 , 底物— 1, 8一 ” H标记的异戊烯腺嚓吟按文献 〔 2〕 方法合 成 。所提取的酶蛋白溶于 0 . l m l l/ 咪哩缓冲液 ( p H 6 . 5 ) .每次酶分析的总体积为 50 微升 ;
其中含 o . 01 m m ol l/ 的咪吵缓冲液 , 在 3 7 “ C水浴中反应 30 分钟后 , 加 2 体积冰冻的 95 肠
乙醇 , 终正反应 . 冰浴 10 分钟后 , 离心 , 取上清液 ( 10 0川 ) 点样于 C I。 一硅 酸 薄 层 板
上 ( 5 x s c m )以分离经酶 作用后 的底物 。 经点样的层析板用 47 肠乙醇 (内含0 . 15 m ol l/
N a C )I 展开 , 然后在紫外灯下检测 , 可见两条蓝色色谱带 , 其中 R f为0 . 70 的是腺嚓吟 ,
而 R f为 0 . 28 的为异戊烯基腺嚷吟 . 将相应 的色谱带定量地转移到液闪瓶内 (含 5 m l iL p 。 -
fl o u r 闪 烁液 ) 用 P a c k ar d m o d el 2 4 0 5 液闪 仪测定各自的放射强度 , 最后 换算 出被
酶分解所得 的 1 , 8一“ H标记的腺嗓吟 m ol 数 。
1
.
5 蛋 白质的测定
酶蛋白溶液 与等量的冷三氯醋酸 i容液 ( 20 肠 w / v) 混合 ,冰浴 30 分钟后 , 离心 ( 2 0 0 0 0 9 ,
10 分钟 ) , 沉淀用 o . I N N a O H 溶解 , 用 F ol in 一酚试剂法 〔 3 , 测 定 蛋 白质含量 . 以上
每个测定有 2 一 4 个重复 , 数据以平均值士 S E表示 .
2 结 果
2
.
1 处理时间长短对细胞 分裂索依赖型棉豆愈伤组织 C K O 活性的影响
为便于与芸 扁 豆 间 类 侧 愈 历 组 织 相 比 咬 ,
H i

A d e 和 i “ A d e 的使用浓艾 为 1阴 m m d 厂耳 2肠盆接
滴加在愈历组织表面 . 不同处理时侧对 lC 交O 活性影
响见图 1 , 经 2 小时 后 C K O 活性开始月显 上升 , 此
后 , 随着处理时一 间的增长而继续提高 . 处理 4 小亘j一后
分别职加了 立1 肠和 12 4 肠 , 继续处洲 4 小时后在原有
基础上分别增加 21 肠和 16 c)b . 可见 , 在处理的第一个
4 小时内酶活性增加幅度较大 , 因此下述实验均采用
4 小时处理 .
令 一 一
了~一
匕- _ 二 _ _ _ _ _ 一o 己 ` 6处理时间 〔小时 )
、咚。幽,卜,亡\一呀哲臀测划华滋
图 1 处理时间对C K O 活性的影响
2
.
2 对细胞分裂素佑赖型芸扁 豆和棉豆愈伤班织 C K O 活性的影响
1 0 m m o il/ 卜从 .九比加 6 A d e 分别滴在愈衫爽且织表面 , 4 小时后测定 C卜O 活性 ,
结果如表 1所示 。
第 2期 黄学林 :i6 d Ae和 H i6 Ae d对芸扁豆和棉豆愈伤组织 CK O的影响 6上
从表 1可知 , H i“ A d e和 i “ A d e 都可 以诱导提高这两种愈历组织中 C K O酶水平 . 在
棉豆愈伤组织中经 H i “ A de 和 i “ A de 处理后 , C K O 酶活性水平相接近 ; 而在 芸扁豆愈 伤
组织 中 , H i “ A de 对 C K O的活性却比 i “ A de 要高 3 倍左右 .
表 1 H i“ A d e 和 i“ A d 。对细 胞分裂素依赖型芸扁豆和棉豆愈伤 组织 C K O活性 的 影 响
T a b
.
i E f f e e t o f o x o g e n o u s a p p l i e a t i o n o f H i 6 A d e a n d i 6 A d e o n e y t o k i n i n o x i d a s e
a e t i v i t y i n p h a s e o l u s v u l g a r i s L
.
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G r e a t N o r t l z c r n a n d P
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K i n g s t o n c a ] l u s t i s s u e (
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d 已p e二 d e n t g r o w t h )
细 胞 分 裂 素 氧 化 酶 活 性
( n m o l A d
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m g p r o t o i n )
( 4 }
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) 棉豆愈伤组织 艺扁豆愈伤组织
对照 ( H ZO )
H i 6 A d e
i
6A d e
1 5 4士0 . 0 7
2
.
18 士 0 . 1
2
.
1 4士 0 . 1 3
0
.
4 7士 0 . 0 5
1
.
4 1士0 . 0 5
0
.
5 8士 0 . 0 7
2
.
3 对细胞分裂素 自主型的芸扁豆和棉豆愈伤组织 中 C K O活性的影响
实验结果如表 2 所示 , H i 6 A d e和 i “ A de 均能诱导细胞分裂素自主型的芸扁豆和棉豆
愈伤组织中的 C K O 活性 , 但在芸扁豆愈伤组织中 , H i8 A d 。对 C K O活性的诱导 作 用 强
于 i “ A d e , 而在棉豆愈伤组织中 , 两者 诱导作用较接近 . 另外 , 从表 1 和表 2 可 知 , 细
胞分裂素自主型的棉豆愈伤组织原有酶水平活性较派 , !雨I长 ” A d 。和 i“ A d 。对自主型的愈
伤组织 中细胞分裂素氧化酶活性的影响均大于依赖型 .
氛 2
T a b
H i

A de 和 i “ A d e 对细胞分裂素 自主型芸局 豆和棉豆愈伤组织 中C K O 活性的影向
2 E f f e e t o f e x o g e n o u s a p p l i e a t i o n o f 玉I i 6 A d e a n d 16人 d o o n e y t o k i n i n o x i d a s e
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v i l y i n P h a s e o l u s v a l g a r i s L
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K i n g s t o n e a l l u s t i s 。 u e ( e y t o k i n i n
一 a u t o rn o u s g r o w t h )
细 胞 分 裂 素 氧 化 醉 洁 侧
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3 5士0 . 1 5
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对照 ( H ZO )
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8 8士 0 . 0了
3 讨 论
细胞分裂素氧化酶已分别从培养的烟草组织和玉米籽粒 、 芸扁豆愈伤组织中分离纯
化 。 带饱和侧链的细胞分裂素 ( 二氢玉米素 、 H 沪A d e等 ) 可以抵杭该酶的攻击 , 而 带
不饱和侧链的细胞分裂素 (玉米素 、 ie A de 等 )则极易被酶 所 氧 化以 ’ ` ’ 6 〕 . 有实验证明二
氢玉米素是芸扁豆幼苗中主要细胞分裂素之一 , 这种还原型的玉米素的存在被认为是为
了防止细胞分裂素过多地被破坏的机制之一 〔 5 〕 . 对于解释 H IO A de 对促进芸扁豆愈伤 组
2 6中山大学学报 ( 自然科学版 ) 第 2 8卷
织生长 活性要比 i“ A e d的活性强许多 ,而在棉豆愈伤组织中则很接近的现象 〔` 〕 , 一种推测
认为这可能是 与带不饱和侧链的 i “ A d e 引起芸扁豆愈伤组织 C K O 活性升高 , 结果使这一
带不饱和侧链的化合物在体内代谢过程中受 C K O 的 作 用而降 解 〔” 〕 。 然而实验表 明 :
在芸扁豆愈伤组织中带饱和侧链的 H i “ A de 对该酶的诱导作用要比 i “ A de 大 2 一 3 倍 , 而
在棉豆 愈伤组织中 , 这两个化合物对该酶的诱导作用则差别不大 。 显然这种诱导作用有
另1于一般的酶底物的诱导作用 , 因为在芸扁豆中 , C K O 的底物— 带不 饱 和 侧 链 的i OA d e对该酶的诱导作用却低于 H i“ A d e 。 C h a t f i e l d和 A r m s t r o n g ( 1 9 5 6 )认为 , 这一现
象可能是由于这两个化合物诱导酶活性的结构要求不同于作为酶底物 功 能 的 结 构 要
求 〔“ 〕 : , 然而这一解释仍需要进一步实验的证实 .
细胞分裂素对促进愈伤组织生 一氏的结构一活性的差异可能包括 : 这些组织对细胞分
裂素的吸收 、 体 内的运输以 及分解代谢的差异 。 酶诱导实验表明 , 这两个化合物在促进
愈伤组织生长所显示的结构一活性的差异性与其诱导 C K O活性差异有着一定的 联 系 ,
它们之间内在联系仍需进一步阐明 。
代谢研究揭示在植物中还存在着另一些细胞分裂素侧链裂解的代谢途径 , 如外喂苇
基腺嗓吟给小萝 卜( r a ib s h ) 、 白羽扇豆幼苗 、 大豆 、 烟草愈伤组织和外喂激动素给械树
细胞 , 都会产生这两个化合物侧链断裂的衍生物 〔“ ’ 7 〕 。 另外还发现长 春 花 冠 瘦 瘤 中
C K O 与玉米中的 C K O 无论在分子量或动力学参数 ( V m ax 、 K m )方面均存在差别 . 因此
要弄清 H 沪 A d e 和 i OA d e在促进芸扁豆和棉豆愈伤组织生长的结构一活性差异性 有 必 要
进一步研究它们在休内代谢途径 、 运输模式以 及有关酶的特异性 。
参 考 文 献
〔 l 〕 M o k M C e t a l 二 P l a n t P h y s i o l . , 61 ( 1 9 7 5 ) , 7 2一 7 5
〔2 、 C h a t f i e l d J M e t a l . , P l a n t P h y : 10 1 . , £0 ( 1 9 8 6 ) , 4 9 3一 4 9 9
〔3〕 P e t e r s o n G L , M e 才h o d : 厂 n 二夕 n : 0 1 , 91 ( 1 9 8 3 ) , 9 5一 1 1 9
〔 4〕 W h i t y C D e t a 卜 , C a n . J . B i o e h e o . , 52 ( 1 9 7 4 ) , 7 5 9一 7 9 9
〔5 〕 A r m s t r o n g D J e t a l , G : ` e r ,; , M o t a b o l i s nr a n d M o l e e u l a r A e t i v i t i e s o f
c y t o k i n i n s
,
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,
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. ,
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,
S p r i n g e r
一 v e r l e g B e r l i n H e i e e l b e r g
,
1 9 8 1
,
9 7一 1 0 4
〔6〕 L e t h a m D 5 e t a ] . , B `o c l/ e m . B f o p h y s . A e t a , 3 99 ( 1 0 7 5 ) , 6 2一 7 0
〔 7〕 F o x J E e t a j . , P l a ,`才 I 〕 h夕 : f o l . , 5 2 ( 1 9 7 3 ) , 6 2 7一 6 3 2
第 2 期 黄学林 : i6A d e和H i6A d e对芸扁豆和棉豆愈伤组织C K O 的影响 6 3
E f f e etofN 6

( 乙2 一 i s oP en t en yl) a d en i n ea n dN 6 一 i s op en t yla d en i n e
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一 a eti vi t yofN “ 一 (刁2 一 i s op en t en yl) a d e-
n三 n ea nN d6 一 i s op n et yla d en i n oi np r om o ti n痊 P ha s eolu s ea l lu s ti s su es g r ow th, t h e
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o n o f i l d u e t i o n e f f e e t s o f t h e s e t w o e o m P o u n d s o n e y t o k i n i n o x i d a s e a e
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e a l l u s t i s s u s e s o f P
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1 t w a s f o u n d t h a t b o t h o f N 6 一 (△ 2 一 i s o p e n t e n y l ) a d e n i n e a n d 入6 一 i s o p e n t y l a d -
e n i n e w e r e e f f e e t i v e i n i n d u e t i n g e l e v a t e t e d I e v e l o f e y t o k i z l i n o x i d a s e a e t i v i t y
i n t h e e a l l u s t i s s u e s
,
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(△ 2 一 i s o p e n t e n y l ) a d e n i n e
e x h i b i t e d 2 o r 3 t i m e i n e r e a s e i n e y t o k i n i n o x i d a s e a e t i v i t y t h a n N 6

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,
b u t i n k i n g s t o n e a l l u s t i s s u e s t h e y d i d e l o邓以 e f f e e t s o n i n e r e a s e o f t h e
e n z y m e a e t i v i t y
.
T h e s e r e s u l t s s h o w t h a t t h e r e 1 5 a r e l a t i o n s h z P b e t w e e n t h e s t r u e t u r e
一 a e t i
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1t y o f t h e s e t w o e o m p o n d s i n p r o m o t i n g e a l l u s t i s s u e g r o w t h a n d t h e i r i n d u e t i o n
e f f e e t s o n i n e r e a s e i n t h e e n z y m e a e t i v i t y o f t lz e t i s s u e s
.
T h e s t r u e t u r e r e q u i e m
-
e n t s f o r t h e i n d u e t i o n o f t h e e n z y m e a e t i v i t y a p p e a r t o d i f f e r f r o : n t h o s e d e t e r
-
m i n i n g t h e a b i l i t y o f t h e e o m p o u n d s t o f u n e t i o n a s s u b s t r a t e s f o r t h e e n z y m e
.
K e y w o r d s p h a s e o l u s v u l g a r i s
,
p h a s e o l u s l u n a t u s
, e a l l u s t i s s u e s
, e y t o k i n i n
o x i d a s 。 , N ` 一 (△ 2 一 i s o p e n t e n y l a d e n i n e ) , N 6 一 i s o p e n t y l a d e n i n e
* D e P a r t m e n t o f B i o l o g y