全 文 ：第 20卷第 6期 分析测试学报 Vol.20 No.6
2001年 11月 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) Nov.2001
西非灰毛豆中鱼藤素的分析
曾鑫年 , 张善学 , 刘新清
(华南农业大学 昆虫毒理室 , 广东 广州 510642)
摘 要:改进了植物中鱼藤素的HPLC检测方法;比较 UV吸收光谱发现 , 检测波长设为 260 nm可以有选择地
检测鱼藤素 , 减少鱼藤酮的干扰;CHCl3-MeOH(体积比 9∶1)溶剂适于提取植物中鱼藤素 , 经 C_18柱层析 , 用
MeOH-H2O(体积比 20∶80)洗脱能有效去除大部分杂质 , 而用 MeOH-H2O(体积比 85∶15～ 100∶0)洗脱可收
集鱼藤素;对西非灰毛豆植株中鱼藤素的含量分析试验结果表明 , 该植物中的鱼藤素主要存在于叶中 , 平均含
量为 20.0×10-3(w), 其中又以上部叶和新叶含量最多 , 分别为 25.2×10-3和 22.0×10-3(w);根和枝条中含
量很低 , 尤其是枝条仅含 0.65×10-3(w), 基本上没有实用价值;鱼藤素的杀虫活性不如鱼藤酮 , 但由于其含量
高 , 在制作杀虫剂时也不能忽视其作用。
关键词:鱼藤素;西非灰毛豆;高效液相色谱
中图分类号:Q949.751.9 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2001)06-0018-03
鱼藤素(deguelin)是除鱼藤酮之外植物中最常见的鱼藤酮类化合物 , 它具有昆虫毒杀 、拒食和生长发育
抑制活性 , 近年又发现其有强抗癌活性 [ 1 ～ 3 ]。 西非灰毛豆是富含天然鱼藤酮类化合物的豆科植物 , 1980和
1988年我室将其作为杀虫植物分别从菲律宾和坦桑尼亚引种成功。 采用活性跟踪分离法对其杀虫活性成分
的研究发现 , 鱼藤酮 、鱼藤醇酮 、去氢鱼藤酮和鱼藤酚是其杀虫活性主要成分 , 但对于其中的鱼藤素则没有
研究报道 [ 4 ～6 ] 。 查明该植物中鱼藤素的含量和分布对其开发利用有重要意义 。 本文报道采用 HPLC方法分
析该植物中鱼藤素的研究结果。
1 实验部分
1.1 植物材料
西非灰毛豆(Tephrosia vogelii Hook.f.)材料从华南农业大学杀虫植物标本园收获 , 树龄 2 a , 株高 2 ～ 3
m。 叶材料中 , 叶龄小于 30 d的为新叶 , 其余为老叶;树冠上 1/2为上部叶 , 下 1/2为下部叶 。 根和枝条只
采集直径小于 1.0 cm的部分供试 。 将样品洗净晾干后 , 于鼓风干燥箱内在(60±5)℃下烘干 , 研末后备用 。
1.2 供试昆虫
家蚕(Bombyx mori)由广东省农业科学院蚕业研究所饲养提供 。 选三龄健康幼蚕进行试验 。
1.3 仪器与试剂
HPLC系统:分析方法研究采用由溶剂输送泵(400型)、混合进样器(491型)和四道二极管阵列检测器
(1000S型)组成的 Applied Biosystems系统 , 外加Spark Holland SPH 99型柱恒温器和 HP3396_Ⅱ积分仪 , 使用接
有预柱(Bondapak C_18 , 10μm , 24 mm×4mm)的Merck LiChrospher 100RP_18反相柱(LiChroCART , 5μm , 12.5
cm×0.4 cm , n=20 000/m);定量测定采用 HP1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司), 连接 HEWLWTT
PACKARD(ODS HYPERSIL , 5μm , 125 mm×4 mm)柱 。 Varian UNITY 300型 NMR仪(美国 Varian Associates ,
Inc.);微量点滴仪(中国科学院上海昆虫研究所制)。
鱼藤素标样为自行提取所得 , 经柱层和薄层色谱法纯化 , 纯度为 84%(w);鱼藤酮标样购自美国 SIGMA
公司 , 批号为 69F0953 , 纯度>95%(w);提取用有机溶剂为分析纯 , HPLC用有机溶剂为 HPLC纯 , 水为Milli_
Q纯水 。
1.4 实验方法
精确称取一定量的植物干粉于三角瓶中 , 加入 10倍量的 CHCl3-MeOH(体积比 9∶1)溶剂 , 置超声波水
收稿日期:2001-07-10;修回日期:2001-09-19
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20072006);教育部留学回国人员基金资助项目
作者简介:曾鑫年(1960-), 男 , 江西赣州人 , 副教授 , 博士 .
第 6期 曾鑫年等:西非灰毛豆中鱼藤素的分析 19
浴中 2 min , 然后在黑暗中静置提取 24 h , 滤出提取液 , 重复提取一次 , 合并滤液 。将滤液减压浓缩 , 除去溶
剂 。 所得提取物经 ISOLUTE(International Sorbent Technology Ltd , U.K.)C_18反相柱层析 , 以 VMeOH ∶VH 2 O为
20∶80 ～ 100∶0体系梯度洗脱;各流分的情况用 F254硅胶 60铝板(德国MERCK公司)进行 TLC监测 , Hexane
-EtOAc(体积比 2∶1)展开 , 10%(φ)H2SO4甲醇液显色 。
HPLC分析采用流动相为MeOH-H2O , 流速 1mL/min , 室温 , 于 240 nm主波长和 210 、299和 310 nm辅助
波长下检测 , 记录保留时间 、峰面积和 UV吸收光谱 。 纯化后 , 用 Varian UNITY 300型 NMR仪确定各峰化合
物的结构 。 NMR氢谱以 C5D5N为溶剂在 300MHz下测定 。
定量分析时 , 并行制作加标试样 , 用于回收率测定 。 样品中鱼藤素的含量采用外标法计算 。
生物活性测定采用点滴法 。 将以丙酮配制的药液点滴于试虫的胸部背面 , 每头 2μL , 设空白对照 。 每
个浓度的药剂处理 10头虫 , 重复 3次 。 处理 24 h后检查死亡率 , 计算 LD50值 。
2 结果与讨论
2.1 鱼藤素的分离纯化与检测
鱼藤素纯品为黄色油状物 , 几乎不溶于水 , 但溶于多种有机溶剂 。 CHCl3-MeOH(体积比 9∶1)能很好地
将植物中的鱼藤素提出。 以C_18反相柱进行层析 , 用MeOH-H2O(体积比 20∶80)洗脱能有效地去除大部分
杂质 , 用MeOH-H2O(体积比 85∶15～ 100∶0)洗脱收集鱼藤素 。
鱼藤素的检测基本参照曾鑫年等 [ 7 ]提出的鱼藤酮 HPLC检测方法 。 但对鱼藤素和鱼藤酮的 UV吸收光
谱比较发现 , 二者的吸收光谱有较大差异 , 通过改变检测波长可以有选择地检测这 2种化合物 , 290 ～ 300 nm
适合于鱼藤酮的分析 , 采用 260 nm波长能很好地检出鱼藤素 , 减少鱼藤酮的干扰 。
采用不同比例的MeOH-H2O溶剂作为反相 HPLC分析的流动相 , 可以较好地洗脱鱼藤素成分并达到与
其它鱼藤酮类化合物分离的目的 。 从梯度洗脱结果来看 , 用MeOH-H2O作流动相的配比应在 VMeOH ∶VH2 O
为 60∶40 ～ 70∶30范围为宜。 为求得不同分离效果 , 也可采用 CH3CN-H2O为流动相 。
2.2 植株中鱼藤素的分析
根据上述结果对样品进行前处理和设定HPLC分析条件 , 用 VM eOH ∶VH2 O =66∶34体系等度洗脱 , 对西非
灰毛豆植株中各部分的鱼藤素含量进行分析 。 结果表明 , 鱼藤素主要分布在叶中 , 平均每克叶干重含量达
20.0 mg(表 1)。 在不同的叶样中 , 上部叶含量最高 , 是下部叶含量的 1.6倍 , 而新叶则明显比老叶的含量要
高 , 为后者的 1.3倍 。种子含鱼藤素 9.69×10 -3(w), 尚不及叶含量的一半。 根和枝条中鱼藤素的含量均很
低 , 尤其是枝条仅含 0.65×10 -3(w), 从整个植株来看则基本上没有实用价值 。
表 1 西非灰毛豆植株不同部分的鱼藤素含量
Table 1 Deguelin content in different parts of the plant
Sample Root Branch New leaf Old leaf Top leaf Lower leaf Seed
Content w/ 10-3 2.56 0.65 22.0 17.3 25.2 15.5 9.69
回收率试验表明 , 在每克不同叶干粉样品中分别加入 25 mg标样 , 经以上方法处理和测定 , 鱼藤素的回
收率达 91%(w), 其标准偏差(SD , n=3)为 2.7%。
2.3 鱼藤素的生物活性
家蚕为鱼藤酮类化合物的敏感试虫 。 采用三龄家蚕幼虫进行点滴处理发现 , 鱼藤素的 LD50为 6.62μg/
头 , 而鱼藤酮的 LD50为 0.24μg/头 , 其毒杀活性约为鱼藤酮的 1/28。 据我们以前的试验分析 , 鱼藤素是西非
灰毛豆植株中的主要鱼藤酮类成分 , 其含量约是鱼藤酮含量的 4 ～ 5倍 。 因此 , 在用该植物制作杀虫剂时 ,
鱼藤素的作用也不可忽视 。
3 结 论
利用天然产物生产无公害杀虫剂和高效特效医药将是本世纪发展的一个重要领域 。 鱼藤素主要来源于
豆科的鱼藤属 、灰毛豆属 、合生果属等植物 , 有重要应用价值 。 本研究结果表明 , 西非灰毛豆中鱼藤素主要
存在于上部叶和新叶中 , 而在根和枝条中含量很低 。这不同于其它许多主要存在于根部的植物 , 地上部分收
采方便 , 且收获后又重发新的梢叶 , 达到高的生产能力 。 西非灰毛豆生长快 、适应性强 , 是优良的鱼藤素资
源植物 。
Bushway等 [ 8 ]最早提出HPLC法检测鱼藤酮成分 , 后被美国公职分析化学师协会(AOAC)采纳 。 这一方法
经改进已适应于多种条件和产品中鱼藤酮的检测 , 但对于鱼藤素的分析不能令人满意 [ 9] 。 本研究结果表明 ,
采用 CHCl3-MeOH(体积比 9∶1)进行提取 , 再经 C_18反相柱层析 , 然后以MeOH-H2O作流动相 , 在 260 nm
波长检测 , 对试样进行反相 HPLC分析 , 能对西非灰毛中的鱼藤素获得满意的分离分析效果 。
西班牙巴塞罗那化学环境研究所 Josep Coll教授帮助完成化合物分子结构的 NMR确定 , 特致谢忱!
参考文献:
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Analysis of Deguelin in Tephrosia Vogelii Hook.f.
ZENG Xin_nian , ZHANG Shan_xue , LIU Xin_qing
(Laboratory of Insect Toxicology , South China Agricultural University , Guangzhou 510642 , China)
Abstract:The HPLC method for the determination of rotenone was modified to analyze deguelin in
Tephrosia vogelii Hook.f..Judging from the UV spectra , it was found that the wavelength 260 nm can be
selectively used for the detection of deguelin with minimal interference from rotenone.A mixture of
CHCl3-MeOH with volume ratio 9∶1 is a suitable solvent system for the extraction of deguelin from
plants.Its purification can be made by filtration through a C_18 reversed_phase column.An eluent of
20∶80(by volume)MeOH-H2O was employed for the removal of impuri ties , whereas a gradient elution
starting from 85∶15 MeOH-H2O and up to pure MeOH was carried out for the collection of deguelin.
The analytical results showed deguelin mainly occured in leaves of Tephrosia vogelii Hook.f..Its average
content in leaves is 20.0×10-3(w), while i ts levels in roots and shoots are rather low—0.65×10-3(w).
The top leaves and new leaves showed higher contents than the lower leaves and old leaves , with an av-
erage contents of 25.2×10-3 and 22.0×10-3(w), respectively.Bioassay wi th the 3rd instar larvae of
silk worm showed that the toxicity of deguelin was lower than that of rotenone.However , its contribution
to the activity of insecticide made of rotenoid_containing plants should not be overlooked because i ts high
content in leaves.
Key words:Deguelin;Tephrosia vogelii Hook.f.;HPLC
20 分析测试学报 第 20卷