全 文 ：华北农学报·2012，27 ( 4 ) : 85 -88
收稿日期:2012 － 04 － 25
基金项目:农业部牧草种质资源保护项目(2011 － 10)
作者简介:刘 磊(1981 －) ，男，内蒙古乌兰察布人，助理研究员，在读博士，主要从事牧草种质资源及牧草育种研究。
通讯作者:李志勇(1965 －) ，男，内蒙古乌兰察布人，研究员，博士，主要从事牧草种质资源研究。
利用 ISSR标记解析胡卢巴和扁
蓿豆、黄花苜蓿的亲缘关系
刘 磊1，2，王宗礼1，李志勇1，师文贵1，李鸿雁1，赵俊喜3
(1．中国农业科学院 草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010;2．中国农业科学院 研究生院，
北京 100081;3．北京百灵天地环保科技有限公司，北京 100045)
摘要:为揭示胡卢巴和扁蓿豆、黄花苜蓿的亲缘关系，利用 ISSR 分子标记技术对其种质资源之间的亲缘关系进
行遗传基因检测分析。研究结果表明，胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜蓿有较广的遗传基础，而且扁蓿豆种质材料相对于胡
卢巴种质材料与黄花苜蓿的亲缘关系更近，但是，相对于黄花苜蓿，扁蓿豆与胡卢巴的亲缘关系更近，黄花苜蓿与胡
卢巴的亲缘关系相对较远。虽然，在这个结论里得出了扁蓿豆相对于黄花苜蓿与胡卢巴的亲缘关系较近，但不一定
能说明扁蓿豆这个种属于胡卢巴属。
关键词:胡卢巴;扁蓿豆;黄花苜蓿;亲缘关系;ISSR
中图分类号:S541 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2012)04 － 0085 － 04
Relationship among Trigonella foenum-graecum L．，Medicago
ruthenica L．，Medicago falcata L． Using ISSR
LIU Lei1，2，WANG Zong-li1，LI Zhi-yong1，SHI Wen-gui1，LI Hong-yan1，ZHAO Jun-xi3
(1． Grassland Research Institute，CAAS，Huhhot 010010，China;2． Graduate School，CAAS，
Beijing 100081，China;3． Beijing Larkworld Environment Technology Co．，ltd．，Beijing 100045，China)
Abstract:The relationship among Trigonella foenum-graecum L．，Medicago ruthenica L．，Medicago falcata L．
was analyzed using ISSR to reveal the relationship among them． The results showed:these germplasm including
Trigonella foenum-graecum L．，Medicago ruthenica L．，Medicago falcata L． had a broad genetic base． Comparing
with Trigonella foenum-graecum L．，there was closer relationship Medicago falcata L． between，Medicago ruthenica
L． Comparing with Medicago falcata L．，there was closer relationship between Trigonella foenum-graecum L．，Medi-
cago ruthenica L． Although，under this condition，it did not mean that Medicago ruthenica L． was not a species of
Trigonella foenum-graecum L．
Key words:Trigonella foenum-graecum L．;Medicago ruthenica L．;Medicago falcata L．;Relationship;ISSR
胡卢巴(Trigonella foenum-graecum L．)又名芸
香草、香苜蓿，系豆科蝶形花亚科一年生草本植
物［1 － 2］。我国有 9 种，其中一年生野生种在我国有
4 种(网脉胡卢巴(T． cancellata Desf)、单花胡卢巴
(T． monantha C． A． Meyer)、直果胡卢巴(T． ortho-
ceras Kar． et Kir．)和弯果胡卢巴(T． arcuata C． A．
Meyer) ) ，仅分布于新疆［3］。扁蓿豆又名花苜蓿、网
果胡卢巴、扁豆子、扁蓄豆、扁豆草、野苜蓿等［4］，最
早记载于 1753 年，记述为 Trigonella ruthenica，1841
年后改 Mdicago ruthenica，1872 年改为 Pocockia
thenica，1945 年改为 Trigonella korshinsk，1955 年改
为 Trigonella emodi，1976 年改 Melissitus ruthenicus，
1982 年改为 Meliotoides ruthenica。扁蓿豆作为中间
过度类群常被称为“类苜蓿植物(Medicago id)”或
“类胡卢巴植物(Trigonella id)”［5 － 6］，而有学者把
这些过渡类群直接归入胡卢巴属［7 － 9］ 或苜蓿
属［10 － 11］。ISSR分子标记技术广泛应用于植物亲缘
关系的研究，而且有更好的稳定性和多态性［12］。不
86 华 北 农 学 报 27 卷
同领域的学者在报春花［13］、国兰［14］、水稻［15］、芒
果［16］、烟草［12，17］、观赏贝母［18］、果梅［19］、大豆［20］、
冬虫夏草［21］、丝瓜［22］、茶树［23］等植物上进行了研
究，结果表明，利用 ISSR 分子标记技术可以对种质
资源的亲缘关系进行很好的分析，得到可信的结果。
本试验利用 ISSR 分子标记技术进一步揭示胡卢巴
扁蓿豆、黄花苜蓿的亲缘关系。
1 材料和方法
1． 1 材料
选取同一年种植的胡卢巴、黄花苜蓿、扁蓿豆植
物材料作为试验材料。
1． 2 DNA的提取
从以上材料分别随机取样 15 株，单株提取
DNA。提取方法采用 CTAB法［24］。利用 0． 8%的琼
脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，紫外分光光度计测定
DNA的浓度，置于 － 20℃冰箱备用。
1． 3 样品分析
引物参考加拿大哥伦比亚大学所设计二核苷酸
重复 ISSR引物，由上海生物工程技术服务有限公司
(Sangon)合成。PCR反应中的 Taq酶、dNTP和 PCR
缓冲液均购自 Sangon 公司。PCR 反应体系为:在
25 μL反应体系中，Taq DNA聚合酶 1． 5 U，10 × PCR
Buffer(含 Mg2 +)2． 0 mmol /L，模板 DNA 0． 5 ng /μL，
dNTPs 0． 6 mmol /L，引物 0． 9 μmol /L。扩增程序为:
94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s，55℃复性 30 s(退
火温度依引物而定) ，72℃延伸 30 s，循环 35 次;
72℃延伸 7 min，4℃保存。用 1． 5%琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物，电极缓冲液为 1 × TAE，电泳时间
40 min。用 DL2000 作对照。
1． 4 数据分析
同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为
具有同源性。统计清晰可重复的电泳条带，按扩增
条带有记为 1、无记为 0。并参照 Marker(DL 2000)
估计片段大小。数据分析采用 POPGENE VERSION
1. 31 软件进行［25］。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA的检测
本试验使用 CTAB 法提取的基因组 DNA 经
0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测表明，试验所提取的基因
组 DNA为一条清晰完整明亮的带，没有拖尾或弥散
现象，如出现空白或有上述情况，对植株 DNA 进行
重新提取、检测，使得其符合 ISSR 分析的要求
(图 1)。
图 1 用 CTAB法提取的胡卢巴、扁蓿豆和
黄花苜蓿基因组 DNA
Fig． 1 The genomic DNA of Trigonella foenum-graecum L．，
Medicago ruthenica L． and Medicago falcate L． by CTAB
2． 2 引物筛选
筛选扩增条带清楚、多态性和重复性好的引物
用作 ISSR研究，共筛选出 11 个有效引物，引物序列
和退火温度见表 1。
表 1 引物序列和退火温度
Tab． 1 Annealing temperature，primer
sequence and primer No．
引物编号
Primer
code
核苷酸序列
Sequence
退火温度 /℃
Annealing
temperature
UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 55
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 65
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAG T 55
UBC825 CACACACACACACA CAT 55
PRIMER21 AGAGAGAGAGAGAGAG CC 62
UBC853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 55
UBC818 CACACACACACACA CAG 53
UBC834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 53
UBC854 TCTCTCTCTCTCTCTCRG 55
UBC862 AGCAGCAGCAGCAGCAGC 61
UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA 52
1 ～ 5．胡卢巴种质材料;6 ～ 10．扁蓿豆材料;11 ～ 16．黄花苜蓿材料。
1 － 5． Trigonella foenum-graecum L．;6 － 10． Medicago ruthenica L．;
11 － 16． Medicago falcata L．
图 2 引物 UBC812 胡卢巴、扁蓿豆和黄花
苜蓿种质扩增的 ISSR带型
Fig． 2 ISSR banding pattern of Trigonella foenum-graecum
L．，Medicago ruthenica L． and Medicago falcata
L． accessions produced by the primer UBC812
4 期 刘 磊等: 利用 ISSR标记解析胡卢巴和扁蓿豆、黄花苜蓿的亲缘关系 87
2． 3 总 DNA扩增产物的多态性分析
利用优化的反应体系从 22 个 ISSR引物中选取
扩增条带清晰、稳定性好的 11 条引物进行统计分
析。用 11 个 ISSR引物对胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜
蓿 16 份种质材料进行 PCR扩增，结果如表 2 所示，
共在 69 个位点获得扩增片段，平均每个引物扩增片
段为 6． 27 条，扩增片段最多的引物是 UBC808，为
12 条;最少的引物为 UBC818，只有 3 条。多态性带
共有 68 条，所占比例为 98． 18%，平均每个引物产
生 6． 18 条多态性带，多态性变幅为 80% ～ 100%。
由于大多数的引物多态性信息含量较高，各材料种
质 ISSR多态性比例相对较高，说明以上材料的遗传
基础相对较广(图 2、表 2)。
表 2 11 个引物对胡卢巴、扁蓿豆和黄花
苜蓿种质 DNA扩增带数
Tab． 2 The number of the total and polymorphic bands
amplified by11 ISSR primers among Trigonella
foenum-graecum L．，Medicago ruthenica L． and Medicago
falcata L． accession
引物
Primer
多态性带数
No． of
polymorphic
总带数
Total band
number
多态性位点比例 /%
Polymorphic
rate
UBC808 12 12 100
UBC810 5 5 100
UBC807 4 5 80
UBC825 6 6 100
PRIMER21 5 5 100
UBC853 7 7 100
UBC818 3 3 100
UBC834 5 5 100
UBC854 4 4 100
UBC862 8 8 100
UBC812 9 9 100
总计 /平均 68 69 98． 18
Total /Mean
表 3 胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜蓿材料基因相似性
Tab． 3 Neis Unbiased Measures of Genetic Identity and
Genetic distance of Trigonella foenum-graecum
L．，Medicago ruthenica L． and Medicago falcata L．
PopID Pop1 Pop2 Pop3
1 1 0． 89 0． 86
2 0． 12 1 0． 92
3 0． 15 0． 09 1
注:Pop1代表胡卢巴;Pop2代表扁蓿豆;Pop3代表黄花苜蓿。表4同。
Note:Pop1is Trigonella foenum-graecum L．;Pop2 is Medicago rutheni-
ca L．;Pop3 is Medicago falcate L． ． The same as Tab． 4．
2． 4 依据 ISSR标记种质的聚类分析
由表 3，4 和图 3 可知，胡卢巴、黄花苜蓿、扁蓿
豆和种质两两间的相似系数分布在 0． 86 ～ 0． 92 之
间。其中，胡卢巴属种质材料和黄花苜蓿种质材料
相似系数最小，为 0． 86，遗传距离最大，为 2． 36，表
明种质间的亲缘关系最远;胡卢巴种质材料和扁蓿
豆种质材料之间的相似系数居中，为 0． 89，黄花苜
蓿种质材料与扁蓿豆种质材料的相似系数为 0． 92，
遗传距离最小，可见，扁蓿豆种质材料相对于胡卢巴
种质材料与黄花苜蓿的亲缘关系更近;但是，相对于
黄花苜蓿，扁蓿豆与胡卢巴的亲缘关系更近。
图 3 胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜蓿种质材料
基于 ISSR 标记的聚类分析
Fig． 3 Dendrogram of Trigonella foenum-graecum L．，
Medicago ruthenica L． and Medicago falcata L．
germplasm resources based on ISSR marker
表 4 胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜蓿种质材料遗传距离
Tab． 4 Neis Unbiased Measures of Genetic distance
of Trigonella foenum-graecum L．Medicago
ruthenica L．，and Medicago falcata L．
组间 Between 距离 Length
2 Pop1 6． 72
2 1 2． 36
1 Pop2 4． 35
1 Pop3 4． 35
根据以上分析说明，由于大多数的引物多态性
信息含量较高，胡卢巴、扁蓿豆和黄花苜蓿各材料种
质 ISSR多态性比例相对较高，证明它们的遗传基础
相对较广;扁蓿豆种质材料相对于胡卢巴种质材料
与黄花苜蓿的亲缘关系更近;但是，相对于黄花苜
蓿，扁蓿豆与胡卢巴的亲缘关系更近，黄花苜蓿与胡
卢巴的亲缘关系相对较远。
3 讨论与结论
ISSR分子标记技术在研究植物遗传多样性和
亲缘关系上已经被广泛地应用，在一些植物上也取
得了可靠的结果［12 － 23］。但是组成 ISSR分子标记技
术的因素众多，几乎组成反应体系和程序中的每个
因子都可以影响到 ISSR 分子标记的准确性［26 － 39］，
由于 ISSR分子标记存在一定的误差，不可避免地造
成在分析遗传多样性和亲缘关系上存在一些问题。
本试验中，选取了 22 条引物，通过电泳胶片最终选
出 11 条比较清晰的电泳条带进行亲缘关系的分析，
在一定程度上保证了试验的精度，从而较为准确地
反映了材料所蕴含的信息，比较真实地反映了试验
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材料之间的亲缘关系。
在分析胡卢巴和扁蓿豆亲缘关系时，引进了黄
花苜蓿种质材料的原因，主要考虑扁蓿豆和黄花苜
蓿在形态上更加相似，通过分析扁蓿豆、黄花苜蓿与
胡卢巴的相似系数，可以更加明了地分辨它们之间
的亲缘关系。本试验在证明胡卢巴、扁蓿豆和黄花
苜蓿有较广遗传基础的同时，也得出了扁蓿豆种质
材料相对于胡卢巴种质材料与黄花苜蓿的亲缘关系
更近，但是，相对于黄花苜蓿，扁蓿豆与胡卢巴的亲
缘关系更近，黄花苜蓿与胡卢巴的亲缘关系相对较
远。虽然，在这个结论里得出了扁蓿豆相对于黄花
苜蓿与胡卢巴的亲缘关系较近，但不一定能说明扁
蓿豆这个种有可能属于胡卢巴属的一个种。
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