全 文 ：文章编号:0253-2468(2003)04-0521-04　　　中图分类号:X171　　　文献标识码:A
游离附生假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌中32P释
放的影响
蒋丽娟1 ,史小丽1 ,杨柳燕1 ,肖　琳1 , 王凤平2 ,高　光3 ,秦伯强3 　(1.污染
控制与资源化研究国家重点实验室 ,南京大学环境学院,南京　210093;2.南京大学现代分析中心;3.中国科学院南京地理
与湖泊研究所)
摘要:采用同位素示踪法 ,分析游离附生假单胞菌(Pseudomonas sp.)对富集32P 的铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)中磷
释放的影响.研究结果表明:在微囊蓝细菌生长的延迟期和对数期, 游离附生假单胞菌的加入抑制了微囊蓝细菌中32 P的释
放 ,而对蓝细菌的生长没有明显的影响;在微囊蓝细菌生长的稳定期和衰减期 ,假单胞菌促进其蓝细菌细胞内32 P的释放 ,同
时也加速微囊蓝细菌的衰亡.假单胞菌对微囊蓝细菌32P释放的促进作用是由于自身的吸磷能力导致的.假单胞菌的吸磷量
由假单胞菌生物量和细胞内磷浓度决定 ,假单胞菌在微囊蓝细菌的整个生长阶段生物量不断增加 ,而体内32P 浓度在开始阶
段很低 ,直到微囊蓝细菌进入稳定期才达到相对稳定.
关键词:铜绿微囊蓝细菌;附生菌;假单胞菌;32P
Effect of free-living adhesive Pseudomonas on the release of 32P from
Microcystis aeruginosa
JIANG Lijuan1 , SHI Xiaoli1 , YANG Liuyan1 , XIAO Lin1 ,WANG Fengping2 , GAO Guang3 ,QIN Boqiang3 　
(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse , School of the Environment , Nanjing University , Nanjing　210093;2.The
Modern Analysis Center , Nanjing University , Nanjing　210093;3.Nanjing Institute of Geography and Limnology , CAS , Nanjing　210008)
Abstract:Effect of f ree-living adhesive Pseudomonas sp.on the release of 32 P from Microcystis aeruginosa was studied using the method of
phosphorus isotope tracer.Pseudomonas sp.could inhibit the release of 32 P when M.aeruginosa was in its lag andexponential growth phases
but had no significant effect on its growth.Pseudomonas sp.accelerated the release of 32 P and promotes the declining of M.aeruginosa cells
in the stationary phase and declining phase .The promotive effect of Pseudomonas sp.is influencedby its own phosphorus uptake ability which
was determined by its biomass and the concentration of 32 P in Pseudomonas sp.The biomass increased during the entire growth period of M.
aeruginosa.The concentration of 32P in Pseudomonas sp.was low at the beginning of this period and did not stabilize until M.aeruginosa
was in its stationary phase.
Keywords:Microcystis aeruginosa , Adhesive bacteria , Pseudomonas sp., 32 P
收稿日期:2002-06-10;修订日期:2002-08-31
基金项目:中科院知识创新项目(KZCX2-403)
作者简介:蒋丽娟(1979—),女 ,硕士研究生
近年太湖水体富营养化程度日益加剧 ,已严重威胁到太湖流域地区经济的持续增长和人
民的健康.铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)过去常称为铜绿微囊藻 ,是太湖水华暴发时
的主要生物类群.在微囊蓝细菌生长过程中 ,其胶鞘上常附生着细菌[ 1] ,微囊蓝细菌为附生细
菌营造一个适宜生长的微环境[ 2 , 3] ,并提供细菌生长所需的有机物[ 3] ;细菌能产生一些营养盐
和生长因子供蓝细菌生长 ,同时也能与蓝细菌竞争营养物质 ,并且具有溶藻能力[ 4—6] .蓝细菌
和真细菌之间这种密切的关系使得人们在寻找治理富营养化的对策时必须考虑蓝细菌附生细
第 23 卷第 4期
2003 年7 月
环　境　科　学　学　报
ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAE
Vol.23 , No.4
Jul., 2003
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2003.04.022
菌的重要性.本实验室对太湖微囊蓝细菌上附生细菌的磷代谢进行了初步研究[ 1 , 7 , 8] .本试验采
用同位素示踪法 ,研究了游离附生细菌的存在对铜绿微囊蓝细菌中磷的释放和磷迁移的影响.
1　材料与方法
1.1　试验材料及仪器设备
铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)由中科院武汉水生生物研究所提供 ,用改良的 MA
培养基培养[ 8] ,培养条件为 pH 值 8.6 、温度 25℃、光暗比 10∶14 、光强度 2200 lx.试验开始前将
处于对数生长期的微囊蓝细菌转移到无磷MA培养基中培养 3 d ,使蓝细菌细胞处于磷饥饿状
态.附生细菌为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),系南京大学环境微生物室从太湖微囊蓝细菌上
分离得到.Na2H 32PO4 由中国原子能研究院同位素所提供.
BECKMAN LS9800液体闪烁计数器 ,721分光光度计.
1.2　试验方法
1.2.1　铜绿微囊蓝细菌的32P 富集培养　在 Na2H 32PO 4浓度为 12mg·L-1的 MA培养基中 ,加
入经磷饥饿培养的铜绿微囊蓝细菌 ,培养3 d ,使铜绿微囊蓝细菌富集32P.
1.2.2　假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌中32P 释放的影响　由于附生假单胞菌粘着在蓝细菌的胶
鞘上 ,要分别测定各自细胞内32P有一定困难 ,为了克服这一困难 ,本试验先将附生假单胞菌从
微囊蓝细菌中分离出来(此部分工作由本实验室其他成员先行完成[ 1] ),再用渗析袋将铜绿微
囊蓝细菌和假单胞菌隔开 ,只让磷酸盐等小分子的代谢产物能通过渗析袋 ,从而便于收集假单
胞菌菌体进行测定.
将无放射性磷培养的假单胞菌从菌液中离心分离 ,用无菌水洗涤 3次 ,转移到含 200 mL
无磷MA培养基的 500mL烧杯中 ,使假单胞菌细胞数为 1.0×107 cell·L-1左右(接近水华爆发
时附生菌的度).经32P 富集培养的铜绿微囊蓝细菌液同样进行离心分离 ,并用水洗涤 ,重复 3
次后转移到含 200mL无磷MA培养基的渗析袋中 ,铜绿微囊蓝细菌的细胞数在 5.2×106 cell·
L
-1左右(光密度在0.58左右),渗析袋置于含有假单胞菌的烧杯中.同时设不加假单胞菌的空
白对照.在 25℃、光暗比 10∶14条件下培养微囊蓝细菌 ,观察游离附生细菌对铜绿微囊蓝细菌
磷代谢的影响.
用取样器移取 1.0 mL菌液 ,在 10000 r·min-1离心 15 min ,上清液移入液体闪烁瓶中 ,沉降
的假单胞菌用无放射性的培养液反复冲洗 ,直到冲洗液中的放射性强度达到背景值 ,然后将冲
洗过的菌用0.2mL 60%HClO4 和 0.4mL 30%H2O2 在80℃消化 60min ,消化后的产物移入闪烁
瓶中.在上清液和消化液中分别加入5 mL甲苯闪烁液后 ,测定其放射强度.
用721分光光度计分别在波长 380 nm和 460 nm 下测定假单胞菌液和微囊蓝细菌液的光
密度(OD)来观察假单胞菌液和微囊蓝细菌生长情况.
在试验开始前 ,先求得关于OD值和假单胞菌液浓度(mg·mL-1)的关系方程 ,然后通过测
定OD值计算出假单胞菌菌液浓度 ,最后再计算得到假单胞菌细胞体内32P浓度.
2　结果和讨论
2.1　假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌中32P 释放的影响
游离附生假单胞菌存在与否对铜绿微囊蓝细菌释放到水体中的32P 总量有着明显的影响
(图 1).
522 环　　境　　科　　学　　学　　报 23 卷
□不含假单胞菌时32P 释放总量;◆含假单胞
菌时32 P释放总量;○不含假单胞菌时微囊蓝
细菌的 OD;★含假单胞菌时微囊蓝细菌的
OD
图 1　附生假单胞菌对铜绿微囊蓝细
菌32P 释放总量和生长的影响
Fig.1　Effect of the adhesive bacteria(Pseudomonas
sp.)on the release of 32P from M.aeru-
ginosa and growth of M.aeruginosa
在微囊蓝细菌处于延迟期 、对数期时 ,假单胞菌的加
入抑制了微囊蓝细菌中32P 的释放.研究认为 ,微囊蓝细菌
的生长速率与微囊蓝细菌细胞内磷含量有关[ 10 ,11] ,因此假
单胞菌的这种抑制作用使蓝细菌中磷含量能保持在一定
图 2　存在假单胞菌时释放的32P的分布
Fig.2　Partitioning of 32P released f rom
Microcystis aeruginosa between
water column and adhesive bacteria
(Pseudomonas sp.)
水平 ,进而促进其生长.本试验中 ,假单胞菌对迟缓期和对
数期的微囊蓝细菌的生长并没有表现出明显的促进作用 ,
原因可能在于 ,经过磷富集的微囊蓝细菌在试验开始阶段
时细胞内磷含量仍然较高 ,而微囊蓝细菌细胞内磷含量越
高 ,它对生长速率的影响越小.在微囊蓝细菌的稳定期后
期和衰亡期 ,假单胞菌的加入加速了微囊蓝细菌中磷的释
放 ,同时其衰亡也加速.Maria等人研究认为微囊蓝细菌的
死亡是由于其合成蛋白质和多聚糖减少而导致细菌入侵
进入藻细胞体内发生溶藻的结果[ 5] ,但是从本试验结果来
看 ,在细菌与微囊蓝细菌用渗透膜隔开的情况下 ,细菌的
存在仍然能够导致微囊蓝细菌的加速衰亡 ,可见假单胞菌
对微囊蓝细菌衰亡的影响 ,除了溶藻作用外 ,还存在其它
影响因素 ,假单胞菌促进微囊蓝细菌中磷的释放可能就是
原因之一.它导致微囊蓝细菌细胞内磷含量的减少 ,致使微囊蓝细菌衰亡加速 ,而死亡的蓝细
菌细胞溶解后会释放出磷和更多其它一些有机无机营养物质 ,营养物质的释放促进了假单胞
菌的生长繁殖 ,反过来又增加对微囊蓝细菌的影响程度.
2.2　假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌释放的32P 的分布的影响
试验结果表明 ,加入假单胞菌后 ,水中32P 在相当长一段时间内保持相对稳定的波动状态
(图 2),这与不加入假单胞菌的水体中的情况相同(图 1);而假单胞菌中的32P始终呈不断增长
的趋势.游离附生假单胞菌的存在对微囊蓝细菌中32P的释放在不同时期具有抑制和促进两种
截然相反的作用 ,且假单胞菌对微囊蓝细菌32P 释放的促进作用是由于自身的吸磷作用导致
的.David等研究发现 ,藻类与假单胞菌共存时 ,假单胞菌吸收磷的能力明显比藻类要强[ 13] .本
试验中 ,假单胞菌能不断从蓝细菌中吸收磷.在微囊蓝细菌
生长的延迟期和对数期 ,假单胞菌从蓝细菌中获取32P 的量很
少 ,微囊蓝细菌进入稳定期和衰亡期后 ,假单胞菌吸磷能力
明显增加.
2.3　假单胞菌的生长和吸磷过程
试验过程中 ,假单胞菌的生物量始终处于增长状态 ,生
长速率在微囊蓝细菌进入衰亡期后达到最高值后即稳定不
变 ,呈对数增长 ,未出现稳定期和衰亡期(图 3).微囊蓝细菌
能向附生菌提供其生长所需的有机碳等营养物质 ,因此附生
菌的生长与微囊蓝细菌相关[ 2 , 3 , 12] ,本试验中假单胞菌在前一
阶段随微囊蓝细菌的增长而增长 ,当微囊蓝细菌进入衰亡期
后 ,由于大量微囊蓝细菌细胞死亡 ,大量有机物从细胞中释
放出来 ,因此该阶段的假单胞菌生长速率达到最高.
5234 期 蒋丽娟等:游离附生假单胞菌对铜绿微囊蓝细菌中32P释放的影响
图 3　假单胞菌的生长曲线和细胞内32P 浓度
Fig.3　Growth and 32P concentration of the
adhesive bacteria(Pseudomonas sp.)
本试验得到的假单胞菌液 OD值与菌液浓度(mg·
mL
-1)之间的关系方程为 Y =3.9234x -0.1576(R 2 =
0.9873).根据此方程 ,在测定OD的基础上得到假单胞菌
细胞内32P浓度(图 3).从试验结果看 ,假单胞菌细胞内32P
浓度在微囊蓝细菌生长进入稳定期后才达到稳定.当假单
胞菌处于对数生长期时 ,细胞内32P 浓度保持相对恒定 ,这
同微囊蓝细菌生长过程中磷变化有所不同.
3　结论
(1)在微囊蓝细菌生长的延迟期和对数期 ,游离假单
胞菌的加入抑制了微囊蓝细菌中32P 的释放 ,而对其生长
没有明显的影响;在微囊蓝细菌生长的稳定期和衰减期 ,
游离附生假单胞菌促进其细胞内32P 的释放 ,同时也加速微囊蓝细菌的衰亡.(2)在游离附生假
单胞菌存在时 ,微囊蓝细菌中的32P 释放到水体后通过渗透膜而被假单胞菌吸收.假单胞菌对
微囊蓝细菌32P释放的促进作用是由于自身的吸磷作用导致的.(3)假单胞菌的吸磷数量由假
单胞菌生物量和细胞内磷浓度决定 ,假单胞菌在微囊蓝细菌的整个生长阶段有很长的延迟期
和对数期 ,细胞内32P 浓度在微囊蓝细菌进入稳定期后才达到饱和.(4)在今后的研究中要采用
放射自显影等方法 ,直接研究细菌和铜绿微囊蓝细菌之间的磷迁移关系 ,探索富营养化的机
理.
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