全 文 ：小大黄对药物性肝细胞损伤影响的实验研究
青海医学院(西宁 810001)　王索安　完德才让
南京医科大学(210029)　李跃华
指导:吴翠贞
　　 提　要 　目的:探讨小大黄(PSL)对药物性肝细胞损伤的影响及其作用机制 。方法:采用离
体肝细胞原代培养技术 ,以硫代乙酰胺(TAA)复制体外培养 SD乳鼠肝细胞损伤模型 ,通过检测 3
组(正常对照组 、损伤组 、小大黄治疗组)培养液中乳酸脱氢酶(LDH)逸出量及四甲基偶氮唑盐
(MTT)显色反应 ,了解肝细胞的损伤和增殖情况 ,并同时检测了培养液中超氧化物歧化酶(SOD)和
一氧化氮(NO)的含量变化 。结果:TAA可使培养液中 LDH 活性增加 ,肝细胞增生指数下降 ,SOD减
少 ,NO增加 ,应用小大黄后可逆转这些改变。结论:小大黄不仅可有效阻止 TAA导致的急性肝细
胞损伤 ,而且具有促进肝细胞再生的作用。
　　关键词 　小大黄　药物性肝细胞损伤　硫代乙酰胺　实验研究
　　中图分类号 　R285.5
　　青藏高原大黄属植物有 28种 ,其中藏药所用 21
种 ,藏医将大黄分为上 、中 、下三品 ,各品项下均载有功
效及治病的内容 ,虽各有异同 ,但在实际临床应用上其
功效主治基本相同。〔1〕小大黄(藏药名曲玛枚),又名西
伯利亚蓼(Polygonum Sibiricum Laxm , PSL)。大黄一直
被历代医家视为拨乱反正之要药 ,经药理实验与临床
运用证实大黄用于治疗急性肝炎及重型肝炎疗效明
显 ,可缩短病程 ,减少并发症 ,提高治愈率 。并具有抗
菌消炎抗氧化损伤 、保肝利胆等作用。〔2 ～ 3〕而对同属大
黄属的植物———小大黄(PSL)研究却甚少 ,国内外文献
至今未见报道。为了证实小大黄是否对急性肝损伤有
保护作用 ,本实验采用离体肝细胞原代培养技术 ,观察
了PSL水煎剂对硫代乙酰胺(TAA)所致的急性肝损伤
的作用 ,并对其抗损伤的机理作了初步探讨。
1　材料与方法
1.1　实验动物　SD乳鼠 ,鼠龄 2 ～ 3天 ,江苏省实验
动物中心提供。
1.2　制剂的制备　PSL为蒸馏水煎煮的浓缩液 ,主要
参照李涛 、黄海茵等方法进行 ,〔3～ 4〕并作了改进 。煎煮
时间不超过 10分钟 ,提取 3 次。〔5〕浓缩液用无菌纱布
及器皿过滤 ,实验前用培养基液-RPMI-1640调渗透
压 ,用 10%的碳酸氢钠液调 pH至 7.2 ～ 7.4 ,高速离心
5000转/分 ,持续10分钟 ,取上清液 ,先后经0.45μm和
0.2μm微孔滤膜滤菌 ,制成供体外细胞培养用的中药
原液 ,存贮在-20℃冰箱中备用 ,加药时在培养基液中
稀释到所需浓度 。
5-HT/NE的比值明显升高 ,形成单胺类神经递质含
量和比例的紊乱 。而针刺后 ,与模型组相比 ,NE含量
显著升高 , 5 -HT 和 5 -HIAA 的含量明显降低
(P<0.01 ～ 0.05),5 -HT/NE 的比值接近青年组水
平。说明电针对单胺类神经递质有良好的调整作用。
推测电针发挥作用的途径可能是通过中枢的整合作
用 ,来影响下丘脑的单胺类神经元的活动 ,从而调整了
下丘脑单胺类神经递质的紊乱 。由于雌激素在下丘脑
内代谢形成儿茶酚胺雌激素 ,后者又是儿茶酚胺降解
酶的竞争性抑制剂 ,因此 ,不排除针刺可能通过增加体
内雌激素水平 ,使儿茶酚胺雌激素含量增多 ,抑制其降
解酶的活性 ,使 NE破坏减少而增加局部的浓度。
4.4　针刺对神经-内分泌-免疫网络的调节作用　
神经-内分泌-免疫网络(NEI-N)是机体的调控整
合系统 。妇女进入更年期 ,NEI-N不可避免地发生增
龄性变化。本实验证实电针治疗对NEI-N 各个方面
均有调整作用 ,可能是通过增加 E2 水平 ,发挥雌激素
对其受体的正向调节作用 ,来调整神经递质的含量和
比例 ,同时也可能增加了 IL-2的含量 。此外 ,电针刺
激可通过神经核团及脑的不同水平的整合作用 ,调节
下丘脑紊乱的递质水平 ,削弱亢进 ,改善不足 ,使其趋
于一种稳定的含量与比例 ,从而稳定下丘脑的功能 ,由
此间接地调节GnRH与 GTH 的分泌与释放 ,对衰退的
下丘脑-垂体-卵巢轴起到良性调节作用。由此可以
看出 ,针刺能调节NEI-N的各个环节 ,具有多途径的
作用机制和整体调节的特点 ,是治疗更年期综合征的
安全 、有效的方法。
(收稿日期:2002-06-06)
·51·江苏中医药 2003年第 24卷第 1期
1.3 　仪器与试剂 　二氧化碳培养箱 (NATURE ,
USA), 倒置生物相差显微镜 , 酶联免疫检测仪 (MB
-111 , 北京新技术应用研究所)。胰蛋白酶 、 RPMI
-1640 (Sigma 公司产品)、 Polygonum Sibiricum Laxm
(青海医学院藏医系惠赠)、 TAA (由上海化学试剂采
购站提供)、 辅酶 1 (中国科学院东方仪器设备公司
生化部提供), SOD和 NO 试剂盒 (南京建成生物工
程研究所提供)。
1.4　细胞培养和活性检测　在无菌条件下取出乳鼠
肝脏剪碎 ,并用 0.125%胰蛋白酶消化 ,制备成肝细胞
悬液 ,以台酚兰排除法测定细胞存活率在 90%以上 ,
用20%小牛血清的 RPMI-1640培养液稀释成 106/ml
细胞 ,接种于培养板 ,每孔 100μl ,置 37℃、5%CO2培育
箱中培养。待细胞生长 24小时 ,贴壁良好后 ,加入各
种待测因素继续培养 48小时 ,然后采用四甲基偶氮唑
盐(MTT)显色法 , 〔6〕在酶标仪上进行光密度定量检测
肝细胞活性和增殖情况 ,并计算增生指数。
增生指数 =试验组 OD(570nm)/对照组 OD
(570nm)
1.5　肝细胞损伤模型及治疗模型的制备　将培养的
肝细胞分为正常对照组 、损伤组 、治疗组 3组。损伤组
在培养 24小时后贴壁生长良好的肝细胞上清液中加
入不同浓度的 TAA(终浓度 0.00 ～ 0.24mol/L),继续培
养至 48小时 ,采用 MTT 显色法 , 检测肝细胞增生指
数 ,选出最适损伤终浓度(0.20mol/L)制备损伤模型 ,
因此浓度可引起大量体外培养的肝细胞损伤和坏死。
治疗组在加入 TAA(终浓度 0.20mol/L)2小时后 ,分别
加入不同剂量的 PSL(终浓度 1μg/ml ,50μg/ml , 100μg/
ml , 200μg/ml , 400μg/ml , 800μg/ml ,1600μg/ml),继续培
养至 48小时后 ,检测细胞增生指数 ,选出最适治疗浓
度(400μg/ml)制备治疗模型。
1.6　生化指数的检测　应用 721型分光光度计采用
生化比色分析法 ,测定 3组肝细胞上清液中 LDH的含
量 ,采用黄嘌呤氧化酶法测定上清液中 SOD 的含量 ,
采用硝酸还原酶法测定上清液中NO的含量。
1.7　统计学处理　结果以均数±标准差(x±s)表示 ,
组间比较采用 t 检验 。
2　实验结果
2.1　TAA 对肝细胞活性的影响 　见图 1。将培养的
肝细胞与浓度递增的 TAA 混合培养 24 小时 ,观察其
对肝细胞活性的影响 。TAA在低浓度时 ,细胞增生活
跃 ,反复的肝细胞增生 ,可能导致细胞癌变。〔7〕当 TAA
终浓度加大到 0.2mol/L时 ,可引起肝细胞大量损伤和
坏死 ,增生指数<1 ,故选此浓度复制 TAA肝细胞损伤
模型 。
图1　不同浓度 TAA对肝细胞活性的影响 。各浓度的
值均为(x ±s), n =5 ,除 0.18mol/L 组外 ,与正常对照
组相比均 P<0.01。
图2　不同浓度梯度小大黄对急性肝细胞损伤的保护
作用。各组均为(x ±s), n =5 ,除 1μg/ml 组外 ,与正
常对照组相比均 P <0.01 。
2.2　PSL 对 TAA 肝细胞损伤的治疗作用　见图 2。
当PSL 终浓度为 1μg/ml时 ,不呈现治疗作用 ,增生指
数<1;而终浓度为50μg/ml时 ,增生指数开始上升 ,而
终浓度为 400μg/ml时 ,增生指数已达 6.83 ,因此选此
浓度制备治疗模型。
2.3　PSL 对TAA损伤组肝细胞酶活性的影响　见表
1。TAA损伤组与正常对照组相比肝细胞 LDH 逸出增
多 ,肝细胞内及培养上清液中 SOD 含量下降 , NO 增
高。治疗组 LDH与 NO含量降低 ,SOD升高 ,与损伤组
相比均有显著差异(P <0.01)。
表1　小大黄治疗组对TAA 损伤组肝细胞酶活性的影响　(x±s)
LDH(U/100ml) SOD(NU/ml) NO(μmol/L)
正常对照组 220±10.00　　 44.4±1.66　　 179.63±18.62　　
TAA损伤组 328±10.90＊　 26±1.38＊　 366.2±23.60＊　
PSL治疗组 250±7.10＊＊ 38.5±1.10＊＊ 219.8±29.50＊＊
　　注:n=5 ,与正常对照组比 , ＊P<0.01 , ＊＊P<0.05。
·52· 江苏中医药 2003年第 24卷第 1期
3　讨论
大黄具有消炎抗菌 、 抗病毒 、 抗氧化损伤 、 保肝
利胆等作用 , 这些药理作用主要是以中医的传统制剂
———水煎剂口服而获得的。〔2〕有文献报道 , 必须强调
的是大黄中众多的化学成分彼此间的协同综合作用 ,
从目前来看 , 大黄中所提取到的有效成分尚不能代替
水煎剂的作用。〔8〕配制大黄煎液 , 以水浴的方法煎煮
10min , 提取 2 ～ 3次 , 蒽醌衍生物提出量最高 , 以确
保药物疗效 。〔5〕直接将中药的单方制剂加入到体外细
胞培养体系中易于受到制剂的杂质 、 pH 值 、 渗透压
等因素的影响。因此实验采取了高速离心取上清液经
微孔滤膜过滤 , 可达去除杂质和滤菌的效果 , 用培养
基液与10%的碳酸氢钠调渗透压及 pH值 , 使其制备
成供体外细胞培养用的中药原液。
MTT 法测定活细胞内线粒体脱氢酶的含量与细胞
活性成正比 , 已广泛用于检测多种细胞的活性 , 检测
药物敏感性的指标。〔2 ,6〕体外培养肝细胞加入终浓度
为0.18mol/L 的TAA后 , 肝细胞活性降低 , 细胞增生
指数低于正常 , 上清液中 LDH活性增加 。〔9〕本试验结
果与其相符 , 唯独不同的是 TAA 的终浓度为
0.20mol/L , 可呈现上述结果 。这可能是与药物的纯
度 、产地及实验动物的类型不同等有关。OsadaJ等报
道 , 给鼠用TAA后降低肝细胞内磷酯酰胆硷合成 。〔7〕
这可能是由于影响了甲基化复合物形成 , 从而影响了
肝细胞膜蛋白的结构与机能 。应用 PSL治疗后 , LDH
下降及肝细胞增生指数高于损伤组 , 提示肝细胞膜损
伤减轻 , 说明该药可能具有促进肝细胞内磷酯酰胆硷
合成 , 稳定肝细胞膜蛋白的结构与机能 , 促进肝细胞
再生的作用。
有研究表明 , TAA所致的肝损伤与脂质过氧化有
关。〔9 ,10〕因脂质过氧化可直接影响肝细胞线粒体 , 导
致能量代谢障碍 , 使线粒体通透性增加 , 致使单价自
由基泄漏增多。本实验结果表明 , TAA 导致 SOD活
力下降 , 且发生在 LDH 升高之前 , 提示肝细胞抗氧
化能力不足 , 对抗自由基引起的脂质过氧化的作用降
低 , 这可能是 TAA引起肝细胞导致受损的主要原因
之一 。应用PSL后可使 SOD活力明显回升 , 提示 PSL
可能是通过提高 SOD活力 , 降低过氧化脂质 (IPO)
的生成 , 清除自由基 、增强肝细胞的抗氧化能力 。
NO是一种活性的氮氧自由基 , 它是在 NO 合成
酶的催化下以左旋精氨酸为底物而生成的。它具有双
重作用 , 在体内有保护作用 , 在体外培养的细胞当中
主要表现其细胞毒作用。体外试验表明肝巨噬细胞通
过释放 NO 对肝细胞产生毒性 , 其毒性主要在于 NO
可与线粒体呼吸链的酶类或 DNA 合成酶结合 , 使其
亚硝基化 , 从而抑制能量的生成及 DNA 合成;〔11〕NO
与氧自由基结合后形成毒性很强的过氧化亚硝酸盐阴
离子 , 诱导巯基氧化及脂质过氧化 , 分解后还可导致
类似-OH 的强烈氧化作用。〔12〕体外肝细胞培养加
0.20mmol/LTAA , 2 小时后再加 PSL400μg/ml 后 , NO
明显下降 , 并且 NO 含量与 LDH 呈正相关 , 与 SOD
呈负相关 , 实验结果提示 PSL可能是通过抑制肝细胞
产生NO , 从而起到对肝损伤的保护作用。
综上所述 , 实验表明 PSL可能是通过促进肝细胞
再生增强肝细胞抗氧化能力 , 稳定肝细胞膜蛋白的结
构与机能 , 清除自由基 , 抑制 NO 的释放而呈现其对
急性肝细胞损伤的保护作用。本实验仅从细胞水平上
做了初步探讨 , 其详尽的机理有待今后在分子水平上
进一步研究阐明 。
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